楊玉強(qiáng) 全曉麗 王劉玉 鮮文峰 楊 紅

（1.南陽(yáng)市第二人民醫(yī)院骨一科，河南 南陽(yáng) 473000；2.鄭州大學(xué)第一附屬醫(yī)院腫瘤內(nèi)科，河南 鄭州 450001）

骨肉瘤是兒童和青少年人群高發(fā)的原發(fā)性間葉組織惡性腫瘤，病死率較高[1]。盡管針對(duì)骨肉瘤的診療策略不斷優(yōu)化，但對(duì)于發(fā)生轉(zhuǎn)移的患者療效仍有限，患者復(fù)發(fā)率和死亡率依然較高[2]。目前，骨肉瘤發(fā)病機(jī)制尚不完全清楚。有研究結(jié)果顯示，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激蛋白參與了骨肉瘤細(xì)胞的惡性增殖[3]。還有研究發(fā)現(xiàn)，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激可誘導(dǎo)骨肉瘤細(xì)胞凋亡和自噬[4]。核糖體結(jié)合蛋白1（ribosome-binding protein 1，RRBP1）作為一種粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)蛋白，在新生蛋白跨膜易位和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激中發(fā)揮重要作用[5]，其在多種惡性腫瘤組織中表達(dá)異常[6]，與前列腺癌預(yù)后密切相關(guān)[7]，也是判斷食管癌患者預(yù)后的潛在生物標(biāo)志物[8]。但RRBP1是否參與了骨肉瘤的發(fā)生、發(fā)展尚不明確。本研究擬通過(guò)檢測(cè)骨肉瘤組織中RRBP1蛋白的表達(dá)情況，分析其在不同臨床病理參數(shù)骨肉瘤患者中表達(dá)的差異，并觀察下調(diào)其表達(dá)對(duì)骨肉瘤細(xì)胞特性的影響。

1 材料和方法

1.1 研究對(duì)象

選取2014年6月—2020年6月在南陽(yáng)市第二人民醫(yī)院和鄭州大學(xué)第一附屬醫(yī)院行手術(shù)治療的骨肉瘤患者91例，其中男52例、女39例，年齡（19.62±8.15）歲。所有患者經(jīng)病理學(xué)檢查確診為骨肉瘤，排除繼發(fā)性骨腫瘤。組織學(xué)類(lèi)型：纖維母細(xì)胞型15例，軟骨母細(xì)胞型17例，骨母細(xì)胞型43例，混合型16例；腫瘤部位：四肢骨72例，中軸骨19例；Enneking分期：ⅡA期28例，ⅡB～Ⅲ期63例；發(fā)生遠(yuǎn)隔轉(zhuǎn)移42例。另選取南陽(yáng)市第二人民醫(yī)院骨科行手術(shù)治療且排除骨腫瘤的患者45例，其中男27例、女18例，年齡（20.05±9.05）歲。骨肉瘤患者和骨科手術(shù)患者之間性別和年齡差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）。本研究經(jīng)南陽(yáng)市第二人民醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)（NYSDERMYY20130809113），所有患者均知情同意。

1.2 主要儀器和試劑

兔抗人RRBP1多克隆抗體（克隆號(hào)bs-6574R，北京博奧森生物公司），免疫組化試劑盒和配套試劑（上海研卉生物公司），人骨肉瘤細(xì)胞系U-2OS（上海通派生物公司），Dulbecco改良Eagle培養(yǎng)基（Dulbecco's modified Eagle medium，DMEM）、胎牛血清和青霉素-鏈霉素（美國(guó)Gibco公司）。RRBP1干擾序列（si-RRBP1）和對(duì)照序列（si-NC）由上海捷蘭生物公司合成，Trizol試劑和Lipofectamine 2000（美國(guó)Invitrogen公司），逆轉(zhuǎn)錄和擴(kuò)增試劑盒（日本TaKaRa公司）。RRBP1和內(nèi)參[甘油醛-3-磷酸脫氫酶（glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase，GAPDH）]引物由生工生物（上海）股份有限公司合成。CCK-8試劑盒（上海碧云天公司），Transwell小室（美國(guó)Corning公司），基質(zhì)膠（美國(guó)BD公司）。StepOne Plus實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀（美國(guó)ABI公司），GellDoc XR+凝膠電泳分析系統(tǒng)、xMark酶標(biāo)儀（美國(guó)伯樂(lè)公司），DP50顯微鏡（日本Olympus公司）。

1.3 骨肉瘤組織和正常骨組織RRBP1蛋白表達(dá)的檢測(cè)

分別收集骨肉瘤患者和骨科手術(shù)患者的骨肉瘤組織和正常骨組織樣本，石蠟包埋，以4 μm厚度切片，經(jīng)烤片、脫臘、脫水、透明至水，浸入pH值為6.0的檸檬酸鈉液行抗原修復(fù)，用3% H2O2滅活內(nèi)源性過(guò)氧化物酶，磷酸鹽緩沖液（phosphate-buffered saline，PBS）沖洗3次。滴加兔抗人RRBP1抗體（1∶800稀釋?zhuān)? ℃孵育過(guò)夜，PBS沖洗，滴加二抗，孵育60 min，二氨基聯(lián)苯胺顯色，蘇木素復(fù)染，透明、封片觀察。在光學(xué)顯微鏡的高倍鏡下隨機(jī)取5個(gè)視野。按文獻(xiàn)[9]方法進(jìn)行評(píng)分。1）染色評(píng)分：無(wú)染色為0分，淡黃為1分，棕黃為2分，棕褐為3分；2）染色細(xì)胞百分比評(píng)分：<5%為0分，6%～25%為1分，26%～50%為2分，51%～75%為3分，>75%為4分。以染色評(píng)分與染色細(xì)胞百分比評(píng)分的乘積為最終得分，≥1分為陽(yáng)性。

1.4 病例隨訪

從手術(shù)當(dāng)日開(kāi)始，每3個(gè)月對(duì)患者電話隨訪1次，每6個(gè)月來(lái)院復(fù)查1次，對(duì)于未按時(shí)復(fù)查者，進(jìn)行電話隨訪。隨訪截止日期為2021年12月，記錄患者生存情況。

1.5 細(xì)胞學(xué)實(shí)驗(yàn)

1.5.1 細(xì)胞培養(yǎng)和處理

將U-2OS細(xì)胞置于含10%胎牛血清的DMEM中，在5% CO2、37 ℃條件下培養(yǎng)。當(dāng)細(xì)胞融合度≥80%時(shí)，消化，傳代。將對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞接種于6孔板中，待細(xì)胞密度>70%時(shí)，用Lipofectamine 2000轉(zhuǎn)染不同序列。1）si-RRBP1組：轉(zhuǎn)染RRBP1干擾序列5'-GCAAGCCAGGATGGATATTTA-3'；2）si-NC組：轉(zhuǎn)染陰性對(duì)照序列5'-TTCTCCGAACGTGTCACGT-3'；3）空白對(duì)照組：僅加入轉(zhuǎn)染試劑。處理后繼續(xù)培養(yǎng)48 h。以常規(guī)培養(yǎng)的U-2OS細(xì)胞作為對(duì)照。

1.5.2RRBP1 mRNA表達(dá)的檢測(cè)

取U-2OS細(xì)胞和si-RRBP1組、si-NC組和空白對(duì)照組細(xì)胞，加入裂解液，采用Trizol試劑提取細(xì)胞總RNA。用逆轉(zhuǎn)錄試劑將RNA逆轉(zhuǎn)錄為互補(bǔ)DNA（complementary DNA，cDNA），以cDNA為模版，采用實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)（real-time fluorescence quantitative polymerase chain reaction，RTqPCR）擴(kuò)增。RRBP1 mRNA上游引物為5'-AACCTAATGGGAAGATACCTGA-3'，下游引物為5'-CATGGCTGGAACTGTGGC-3'；GAPDH上游引物為5'-CTGAACGGGAAGCTCACTGG-3'，下游引物為5'-TGAGGTCCACCACCCTGTTG-3'。反應(yīng)條件：95 ℃ 2 min，95 ℃ 30 s，58 ℃30 s，70 ℃ 30 s，36個(gè)循環(huán)。采用2-ΔΔCt法計(jì)算RRBP1 mRNA相對(duì)表達(dá)量。

1.5.3 RRBP1蛋白表達(dá)的檢測(cè)

采用免疫印跡法檢測(cè)RRBP1蛋白的表達(dá)。取U-2OS細(xì)胞和si-RRBP1組、si-NC組和空白對(duì)照組細(xì)胞，加入蛋白裂解液，離心后取上清，用二喹啉甲酸（bicinchonic acid，BCA）試劑盒測(cè)定總蛋白濃度。取50 μg蛋白，采用十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳，電轉(zhuǎn)至聚偏二氟乙烯膜上，5%脫脂奶粉封閉120 min，加入兔抗人RRBP1多克隆抗體（1∶600稀釋?zhuān)? ℃過(guò)夜孵育，三羥甲基氨基甲烷-吐溫緩沖液（trishydroxymethyl aminomethane-Tween，TBST）沖洗3次，加入二抗，室溫孵育120 min，TBST沖洗3次，加入顯色劑，以GAPDH為內(nèi)參，采用Image J軟件（美國(guó)國(guó)立衛(wèi)生研究院）分析條帶的灰度值，計(jì)算相對(duì)表達(dá)量。

1.5.4 細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)

取si-RRBP1組、si-NC組和空白對(duì)照組細(xì)胞，離心后取沉淀，用培養(yǎng)液復(fù)懸，接種于96孔板，密度為2×103個(gè)/孔，繼續(xù)培養(yǎng)，分別于培養(yǎng)12、24、48、72和96 h時(shí)加入20 μL CCK-8溶液，繼續(xù)培養(yǎng)2 h，采用xMark酶標(biāo)儀檢測(cè)各孔吸光度（A）值。

1.5.5 細(xì)胞遷移實(shí)驗(yàn)

取si-RRBP1組、si-NC組和空白對(duì)照組細(xì)胞，胰蛋白酶消化，用無(wú)血清培養(yǎng)液制備單細(xì)胞懸液，密度為2.5×105個(gè)/mL，將200 μL單細(xì)胞懸液加入Transwell小室的上室，下室加入600 μL含10%胎牛血清的培養(yǎng)液，培養(yǎng)24 h，固定，1%結(jié)晶紫染色25 min，在DP50顯微鏡下觀察，隨機(jī)取5個(gè)高倍鏡視野（按左上、左下、中央、右上、右下選擇）計(jì)數(shù)穿膜細(xì)胞數(shù)，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.5.6 細(xì)胞侵襲實(shí)驗(yàn)

用培養(yǎng)液稀釋基質(zhì)膠，平鋪于Transwell小室的上室，風(fēng)干備用。其余實(shí)驗(yàn)步驟同“細(xì)胞遷移實(shí)驗(yàn)”。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 21.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。呈正態(tài)分布的計(jì)量資料以±s表示，多組間比較采用單因素方差分析，組內(nèi)比較采用LSD-t檢驗(yàn)。計(jì)數(shù)資料以例或率表示，組間比較采用χ2檢驗(yàn)。采用Kaplan-Meier生存曲線和Log-rankχ2檢驗(yàn)評(píng)估骨肉瘤患者的生存情況。以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 骨肉瘤組織和正常骨組織中RRBP1蛋白陽(yáng)性表達(dá)的比較

骨肉瘤組織中RRBP1蛋白陽(yáng)性表達(dá)率為74.73%（68/91），高于正常骨組織[22.22%（9/45）]（χ2=36.714，P<0.001）。見(jiàn)圖1。

圖1 骨肉瘤組織和正常骨組織中RRBP1蛋白表達(dá)（×200）

2.2 不同臨床病理參數(shù)的骨肉瘤患者之間RRBP1陽(yáng)性表達(dá)的比較

Enneking分期ⅡB～Ⅲ期、有遠(yuǎn)隔轉(zhuǎn)移的骨肉瘤患者RRBP1蛋白陽(yáng)性率分別高于Enneking分期ⅡA期、無(wú)遠(yuǎn)隔轉(zhuǎn)移的患者（P<0.05）。不同性別、年齡、腫瘤部位、組織學(xué)類(lèi)型和腫瘤大小的骨肉瘤患者RRBP1蛋白陽(yáng)性率差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）。見(jiàn)表1。

表1 不同臨床病理參數(shù)的骨肉瘤患者之間RRBP1陽(yáng)性表達(dá)的比較

2.3 RRBP1表達(dá)與骨肉瘤患者預(yù)后的關(guān)系

91例骨肉瘤患者中，有80例（87.91%）完成隨訪，隨訪時(shí)間為2～86個(gè)月。RRBP1陽(yáng)性組生存率為26.23%（16/61），生存時(shí)間為（39.30±2.53）個(gè)月；RRBP1陰性組生存率為68.42%（13/19），生存時(shí)間為（57.52±4.78）個(gè)月。2個(gè)組之間生存率差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（Logrankχ2=8.647，P=0.003）。見(jiàn)圖2。

圖2 不同RRBP1表達(dá)的骨肉瘤患者的Kaplan-Meier生存曲線

2.4 si-RRBP1組、si-NC組、空白對(duì)照組細(xì)胞和U-2OS細(xì)胞RRBP1 mRNA相對(duì)表達(dá)量比較

si-RRBP1組細(xì)胞RRBP1 mRNA相對(duì)表達(dá)量為0.25±0.07，顯著低于si-NC組（1.00±0.10）、空白對(duì)照組（1.03±0.09）細(xì)胞和U-2OS細(xì)胞（1.01±0.08）（P<0.05），si-NC組、空白對(duì)照組細(xì)胞和U-2OS細(xì)胞之間差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）。見(jiàn)圖3。

圖3 si-RRBP1組、si-NC組、空白對(duì)照組細(xì)胞和U-2OS細(xì)胞中RRBP1 mRNA相對(duì)表達(dá)量比較

2.5 si-RRBP1組、si-NC組、空白對(duì)照組細(xì)胞和U-2OS細(xì)胞RRBP1蛋白表達(dá)量比較

si-RRBP1組細(xì)胞RRBP1蛋白表達(dá)量為0.21±0.07，顯著低于si-NC組（0.84±0.07）、空白對(duì)照組（0.86±0.09）細(xì)胞和U-2OS細(xì)胞（0.90±0.05）（P<0.05）。見(jiàn)圖4。

圖4 4組細(xì)胞中RRBP1蛋白表達(dá)的免疫印跡法圖

2.6 si-RRBP1組、si-NC組和空白對(duì)照組細(xì)胞增殖能力比較

與si-NC組和空白對(duì)照組比較，si-RRBP1組培養(yǎng)24、48、72和96 h細(xì)胞增殖能力均降低（P<0.05）。見(jiàn)表2、圖5。

表2 si-RRBP1組、si-NC組和空白對(duì)照組培養(yǎng)不同時(shí)間的細(xì)胞增殖能力比較（A值）

圖5 si-RRBP1組、si-NC組和空白對(duì)照組培養(yǎng)不同時(shí)間的增殖能力比較

2.7 si-RRBP1組、si-NC組和空白對(duì)照組細(xì)胞遷移和侵襲能力比較

si-RRBP1組遷移細(xì)胞數(shù)和侵襲細(xì)胞數(shù)均低于si-NC組和空白對(duì)照組（P<0.05）。見(jiàn)表3、圖6、圖7。

表3 si-RRBP1組、si-NC組和空白對(duì)照組遷移細(xì)胞數(shù)和侵襲細(xì)胞數(shù)比較 個(gè)

圖6 si-RRBP1組、si-NC組和空白對(duì)照組細(xì)胞侵襲能力（結(jié)晶紫染色，×200）

圖7 si-RRBP1組、si-NC組和空白對(duì)照組細(xì)胞遷移能力（結(jié)晶紫染色，×200）

3 討論

骨肉瘤是發(fā)病率最高的惡性骨腫瘤，致殘率高、致死率高，腫瘤惡性程度高，且呈局部侵襲性生長(zhǎng)，易出現(xiàn)遠(yuǎn)隔轉(zhuǎn)移[10-11]。RRBP1作為一種定位于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)內(nèi)，由1 410個(gè)氨基酸構(gòu)成的蛋白，在新生蛋白折疊、運(yùn)輸、分泌中發(fā)揮重要作用[12]。正常生理?xiàng)l件下，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)參與維持蛋白質(zhì)穩(wěn)態(tài)，但若此過(guò)程受干擾，便會(huì)出現(xiàn)大量未折疊的蛋白，蓄積在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)內(nèi)，導(dǎo)致內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激[13-14]，進(jìn)一步導(dǎo)致未折疊蛋白反應(yīng)激活[15]，導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞大量增殖，引發(fā)腫瘤[16]。有研究結(jié)果顯示，RRBP1可通過(guò)調(diào)節(jié)未折疊蛋白反應(yīng)激活而促進(jìn)腫瘤細(xì)胞存活[17]。本研究結(jié)果顯示，骨肉瘤組織中RRBP1蛋白陽(yáng)性表達(dá)率高于對(duì)照組（P<0.001），說(shuō)明RRBP1蛋白在骨肉瘤組織中高表達(dá)，可能與骨肉瘤發(fā)生有關(guān)；Enneking分期ⅡB～Ⅲ期和有遠(yuǎn)隔轉(zhuǎn)移患者的骨肉瘤組織中RRBP1蛋白陽(yáng)性表達(dá)率顯著升高（P<0.05），說(shuō)明RRBP1可能參與骨肉瘤惡性進(jìn)展和轉(zhuǎn)移過(guò)程。

有研究發(fā)現(xiàn)，RRBP1過(guò)表達(dá)與子宮內(nèi)膜癌、膀胱癌進(jìn)展和不良預(yù)后有關(guān)[18-19]，是影響結(jié)直腸癌患者預(yù)后的危險(xiǎn)因素[20]。本研究結(jié)果顯示，與RRBP1陰性患者比較，RRBP1陽(yáng)性患者生存率更低，生存時(shí)間更短，說(shuō)明RRBP1蛋白陽(yáng)性表達(dá)與患者生存率和生存時(shí)間相關(guān)，可能是影響患者預(yù)后的危險(xiǎn)因素。

本研究結(jié)果顯示，與si-NC組、空白對(duì)照組細(xì)胞和U-2OS細(xì)胞比較，si-RRBP1組細(xì)胞RRBP1 mRNA和蛋白相對(duì)表達(dá)量均明顯降低（P<0.05），提示成功構(gòu)建低表達(dá)的骨肉瘤細(xì)胞。有研究結(jié)果顯示，高糖可通過(guò)上調(diào)RRBP1表達(dá)促進(jìn)原發(fā)性肝癌細(xì)胞增殖和轉(zhuǎn)移[21]。本研究結(jié)果顯示，si-RRBP1組細(xì)胞培養(yǎng)12、48、72和96 h時(shí)A值均明顯低于si-NC組和空白對(duì)照組（P<0.05），說(shuō)明RRBP1低表達(dá)可降低骨肉瘤細(xì)胞的增殖能力，提示RRBP1可能與骨肉瘤細(xì)胞增殖過(guò)程有關(guān)。有研究證實(shí)，RRBP1與膀胱癌T24細(xì)胞的遷移和侵襲有關(guān)[22]。本研究結(jié)果顯示，抑制骨肉瘤細(xì)胞RRBP1的表達(dá)可顯著抑制細(xì)胞遷移和侵襲的能力，提示RRBP1可能參與了骨肉瘤細(xì)胞的遷移、侵襲。

綜上所述，骨肉瘤組織RRBP1蛋白高表達(dá)，且與患者預(yù)后有關(guān)。下調(diào)RRBP1表達(dá)可抑制骨肉瘤細(xì)胞的增殖活性，抑制細(xì)胞的遷移和侵襲。因此，RRBP1有望成為骨肉瘤靶向治療的新靶位，但其具體作用機(jī)制和可能的作用途徑還有待更深入的研究予以明確。