孫傳玉 趙曉君 葛圣陽 張 揚(yáng)

（1.復(fù)旦大學(xué)附屬華山醫(yī)院，上海 200040；2.上海市臨床檢驗(yàn)中心，上海 200126；3.復(fù)旦大學(xué)生物醫(yī)學(xué)研究院，上海 200032）

前列腺癌是泌尿外科常見的腫瘤，也是男性常見的惡性腫瘤類型之一[1]，其發(fā)病率近年來呈上升趨勢(shì)[2]。據(jù)估計(jì)，全球每年新發(fā)病前列腺癌病例141.4萬，死亡人數(shù)超過37.5萬；2020年，我國(guó)前列腺癌發(fā)病率約為15.6/10萬人，死亡率為6.9/10萬[3]。雖然前列腺癌的病情進(jìn)展相對(duì)緩慢，且根治性治療對(duì)早期和局限性前列腺癌有良好的療效，但很多前列腺癌患者在確診時(shí)已處于晚期，只能進(jìn)行內(nèi)分泌治療[4]。在經(jīng)過內(nèi)分泌治療后，多數(shù)患者會(huì)進(jìn)一步發(fā)展為去勢(shì)抵抗性前列腺癌（castration-resistant prostate cancer，CRPC），CRPC對(duì)化療、放療均不敏感，缺乏有效的臨床治療方法，且有轉(zhuǎn)移傾向，預(yù)后不良[5]。前列腺癌的發(fā)生和發(fā)展是個(gè)復(fù)雜的過程，涉及體內(nèi)各種因子的相互作用，轉(zhuǎn)錄因子在其中扮演著重要角色。轉(zhuǎn)錄因子是一種與啟動(dòng)子調(diào)控元件結(jié)合以激活/抑制下游基因表達(dá)的核蛋白，調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)錄過程中的各個(gè)步驟，因此轉(zhuǎn)錄因子是基因轉(zhuǎn)錄調(diào)控重要的組成部分之一[6]。有研究結(jié)果顯示，轉(zhuǎn)錄因子參與了血管的形成過程和細(xì)胞的凋亡調(diào)控，通過調(diào)控癌基因、抑癌基因和細(xì)胞周期相關(guān)分子等影響細(xì)胞的增殖和腫瘤的生長(zhǎng)、侵襲、轉(zhuǎn)移[7-8]。轉(zhuǎn)錄調(diào)控網(wǎng)絡(luò)（transcriptional regulatory network，TRN）是指基因、調(diào)控因子及其相互作用的集合，主要用于研究轉(zhuǎn)錄因子與靶基因之間的調(diào)控，其中轉(zhuǎn)錄因子是TRN的關(guān)鍵調(diào)控因子[9]。SUN等[10]通過同位素標(biāo)記相對(duì)和絕對(duì)定量技術(shù)（isobaric tags for relative and absolute quantitation，iTRAQ）結(jié)合二維液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜（two-dimensional liquid chromatography with tandem mass spectrometry，2DLC-MS/MS）篩選出46個(gè)前列腺癌差異蛋白，其中表達(dá)上調(diào)20個(gè)、表達(dá)下調(diào)26個(gè)。在這些差異蛋白中，線粒體相關(guān)蛋白、細(xì)胞外基質(zhì)蛋白等已被證實(shí)在前列腺癌發(fā)生、發(fā)展中發(fā)揮重要作用[11]。但這些差異蛋白之間的轉(zhuǎn)錄調(diào)控并不清楚。為此，本研究基于前期研究[10]結(jié)果，采用GeneGo MetaCore軟件對(duì)差異蛋白構(gòu)建TRN，篩選顯著富集的轉(zhuǎn)錄因子，并采用IPA軟件進(jìn)一步追溯轉(zhuǎn)錄因子的上游調(diào)控網(wǎng)絡(luò)，以闡明前列腺癌中轉(zhuǎn)錄因子與差異表達(dá)蛋白之間的整體調(diào)控和相互作用，進(jìn)而了解前列腺癌的分子發(fā)病機(jī)制，尋找有效治療的潛在靶點(diǎn)，為前列腺癌的早期診斷和有效治療提供新的思路。

1 材料和方法

1.1 研究對(duì)象

選取復(fù)旦大學(xué)附屬華山醫(yī)院因總前列腺特異性抗原（prostate-specific antigen，PSA）>10 ng/mL或直腸指檢發(fā)現(xiàn)異常結(jié)節(jié)，接受“10+X”前列腺穿刺活檢的患者40例。根據(jù)病理學(xué)結(jié)果分為良性前列腺增生患者20例[良性增生組，年齡（67.5±8.8）歲]和前列腺癌患者20例[前列腺癌組，年齡（70.5±10.6）歲]。2個(gè)組之間年齡差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。

1.2 方法

采用GeneGo MetaCore軟件中的轉(zhuǎn)錄調(diào)控網(wǎng)絡(luò)算法對(duì)前期研究[10]篩選出的46個(gè)差異表達(dá)蛋白進(jìn)行生物信息學(xué)分析，46個(gè)差異表達(dá)蛋白見表1、表2。根據(jù)網(wǎng)絡(luò)得分對(duì)結(jié)果進(jìn)行排序，獲取前30位富集度最高的網(wǎng)絡(luò)中的轉(zhuǎn)錄因子。通過文獻(xiàn)篩選出與腫瘤密切相關(guān)的轉(zhuǎn)錄因子。利用IPA軟件中的UpstreamRegulator功能獲得轉(zhuǎn)錄因子的上游調(diào)節(jié)子。

表1 表達(dá)上調(diào)的前列腺癌差異表達(dá)蛋白[10]

表2 表達(dá)下調(diào)的前列腺癌差異表達(dá)蛋白[10]

2 結(jié)果

2.1 差異表達(dá)蛋白的TRN分析

采用GeneGo MetaCore軟件中的轉(zhuǎn)錄調(diào)控算法對(duì)46個(gè)差異表達(dá)蛋白進(jìn)行分析，得出了30個(gè)轉(zhuǎn)錄因子靶模型網(wǎng)絡(luò)和20個(gè)TRN。按差異表達(dá)蛋白的富集度進(jìn)行排序，居前6位的TRN分別由特化蛋白1（specificity protein 1，SP1）、p53、陰陽1（Yin Yang-1，YY1）、雄激素受體（androgen receptor，AR）、c-Myc和Slug調(diào)控，見表3。46個(gè)差異表達(dá)蛋白中有18個(gè)參與SP1的調(diào)控，10個(gè)參與p53的調(diào)控，9個(gè)參與YY1的調(diào)控，7個(gè)參與AR的調(diào)控，7個(gè)參與c-Myc的調(diào)控。在以Slug為核心形成的TRN中，Slug與SP1、p53、AR等轉(zhuǎn)錄因子相互作用，涉及氧化應(yīng)激反應(yīng)、細(xì)胞周期調(diào)控、凋亡調(diào)控等細(xì)胞活動(dòng)，見圖1。

圖1 富集度最高的6個(gè)轉(zhuǎn)錄因子網(wǎng)絡(luò)

表3 SP1、p53、YY1、AR、c-Myc和Slug的GO①富集分析

2.2 差異表達(dá)的轉(zhuǎn)錄因子對(duì)前列腺癌患者的臨床意義。

采用GEPIA2數(shù)據(jù)庫（http：//gepia2.cancerpku.cn/）分析SP1、p53、YY1、AR、c-Myc和Slug對(duì)前列腺癌患者生存情況的影響。Kaplan-Meier生存曲線分析結(jié)果顯示，高表達(dá)p53的前列腺癌患者無病生存期和總生存期均長(zhǎng)于低表達(dá)p53的患者（P值分別為0.047、0.019），低表達(dá)AR的前列腺癌患者無病生存期長(zhǎng)于高表達(dá)AR的患者（P=0.023），其他轉(zhuǎn)錄因子對(duì)前列腺癌預(yù)后無影響（P>0.05）。見圖2。

2.3 轉(zhuǎn)錄因子的上游調(diào)控網(wǎng)絡(luò)

采用IPA軟件構(gòu)建SP1、p53、YY1、AR、c-Myc的上游調(diào)控網(wǎng)絡(luò)，結(jié)果顯示，表沒食子兒茶素沒食子酸酯（epigallocatechin gallate，EGCG）、蛋白激酶B（protein kinase B，PKB；又稱AKT）1、成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子2（fibroblast growth factor 2，F(xiàn)GF2）、β-雌二醇可能是SP1、p53、YY1、AR、c-Myc的上游調(diào)控因子。見圖3。

圖3 利用IPA對(duì)轉(zhuǎn)錄因子上游調(diào)節(jié)子進(jìn)行追溯

3 討論

致癌基因和涉及多種信號(hào)通路的腫瘤抑制因子的功能變化與前列腺癌的轉(zhuǎn)移和耐藥有關(guān)。本研究基于生物信息學(xué)分析構(gòu)建了前列腺癌差異表達(dá)蛋白相關(guān)的TRN，結(jié)果顯示，關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子SP1、p53、YY1、AR、c-Myc和Slug在前列腺癌的發(fā)生、發(fā)展中發(fā)揮重要的作用，追蹤其上游調(diào)控因子，發(fā)現(xiàn)EGCG、AKT1、FGF2和β-雌二醇可對(duì)轉(zhuǎn)錄因子進(jìn)行調(diào)控。

有研究發(fā)現(xiàn)，轉(zhuǎn)錄因子SP1不僅通過表皮生長(zhǎng)因子受體（epidermal growth factor receptor，EGFR）/磷脂酰肌醇3-激酶（phosphoinositide-3-kinase，PI3K）/AKT、絲裂原活化蛋白激酶激酶（mitogen-activated protein kinase kinase，MAPKK；又稱MEK）/細(xì)胞外調(diào)節(jié)蛋白激酶1/2（extracellular regulated protein kinase 1/2，ERK1/2）等通路參與細(xì)胞增殖、分化等細(xì)胞內(nèi)過程，還通過上皮型鈣黏蛋白（epithelial cadherin，E-Cad）、Wnt/β-連環(huán)蛋白等通路參與上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化（epithelial-mesenchymal transition，EMT）過程[12-13]。同時(shí)，由于SP1在前列腺癌中過表達(dá)，在非癌癥人體組織中相對(duì)低表達(dá)的特點(diǎn)，SP1可被作為重要的藥物靶點(diǎn)[14]。本研究結(jié)果顯示，共有18個(gè)差異表達(dá)蛋白參與了SP1的調(diào)控，涉及細(xì)胞組分轉(zhuǎn)移、細(xì)胞黏附調(diào)控、生物特性調(diào)控等，這說明SP1在前列腺癌的發(fā)生、發(fā)展過程中發(fā)揮重要作用，SP1是一個(gè)關(guān)鍵治療靶點(diǎn)和預(yù)后預(yù)測(cè)生物標(biāo)志。

抑癌基因轉(zhuǎn)錄因子p53，又稱TP53，在DNA損傷或腫瘤發(fā)生時(shí)調(diào)控細(xì)胞周期和誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡過程中起核心作用，p53的功能確實(shí)可能對(duì)50%的人類癌癥產(chǎn)生影響，低活性的p53與前列腺癌治療后的耐藥性相關(guān)[15]。在前列腺癌中，p53可通過雄激素介導(dǎo)Ras-GTP酶激活蛋白SH域結(jié)合蛋白2（GTPase-activating protein SH3-domain-binding protein，G3BP2）轉(zhuǎn)移到細(xì)胞質(zhì)中發(fā)揮作用，G3BP2是雄激素受體的直接靶基因，能夠誘導(dǎo)細(xì)胞周期進(jìn)程和阻斷細(xì)胞凋亡，降低p53的信號(hào)，從而在前列腺癌的發(fā)展和耐藥性產(chǎn)生中起重要作用[16]。p53還可以和ELL相關(guān)因子2（ELL-associated factor 2，EAF2）相互作用，失活的EAF2和p53可激活信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)及轉(zhuǎn)錄激活因子3（signal transducer and activator of transcription 3，STAT3），驅(qū)動(dòng)前列腺癌的發(fā)生[17]。

轉(zhuǎn)錄因子YY1在轉(zhuǎn)錄調(diào)控中有雙向作用。在前列腺癌中，YY1是促進(jìn)腫瘤前基因表達(dá)程序的關(guān)鍵致癌因子，并與較差的臨床預(yù)后相關(guān)[18]。YY1可以直接結(jié)合并激活血小板型磷酸果糖激酶（phosphofructokinase，platelet，PFKP）的致癌途徑，PFKP是一種編碼糖酵解限速酶的基因，可顯著促進(jìn)前列腺癌中YY1強(qiáng)化的Warburg效應(yīng)和惡性生長(zhǎng)[19]。YY1還可以抑制前列腺癌細(xì)胞中的腫瘤抑制因子——X染色體連鎖腫瘤抑制相關(guān)因子-1（X-linked inhibitor of apoptosis-associated factor 1，XAF1）的表達(dá)，YY1與XAF1啟動(dòng)子結(jié)合后，可通過組蛋白脫乙酰基酶（histone deacetylase 1，HDAC1）途徑抑制XAF1在前列腺癌細(xì)胞中的表達(dá)，促使前列腺癌的生長(zhǎng)[20]。

AR是一種配體誘導(dǎo)轉(zhuǎn)錄因子，在維持正常前列腺上皮穩(wěn)態(tài)中起重要作用，其中包括維持上皮分化和抑制細(xì)胞增殖，雄激素可通過刺激AR活性來控制轉(zhuǎn)錄[21]。由于大多數(shù)前列腺癌表達(dá)AR，即使是晚期前列腺癌也可以采用雄激素剝奪治療，雖然前列腺癌患者最初對(duì)雄激素剝奪療法有反應(yīng)，但這些患者會(huì)逐漸發(fā)展為CRPC，這個(gè)過程通常需要30個(gè)月左右[22]。在由激素依賴性前列腺癌轉(zhuǎn)變?yōu)镃RPC的過程中，AR也扮演了重要角色，即使在雄激素剝奪治療時(shí)，AR信號(hào)依舊通過多種機(jī)制持續(xù)傳遞，包括AR過表達(dá)、雄激素分泌增加和誘導(dǎo)產(chǎn)生結(jié)構(gòu)活躍AR拼接變異體[23]。異常的AR信號(hào)是前列腺癌的常見特征，AR通路和PI3K/AKT/雷帕霉素靶蛋白（mammalian target of rapamycin，mTOR）已被證實(shí)通過幾個(gè)相互抑制環(huán)路進(jìn)行交叉調(diào)節(jié)，PI3K/AKT/mTOR通路可能在響應(yīng)雄激素/AR定向治療時(shí)被激活，這種代償性激活可以促使CRPC的生長(zhǎng)，而PI3K/AKT/mTOR通路抑制可增強(qiáng)AR信號(hào)，導(dǎo)致前列腺癌的進(jìn)展和產(chǎn)生耐藥性[24]。本研究AR調(diào)控網(wǎng)絡(luò)中的上、下游蛋白可以為后續(xù)研究提供思路。

原癌基因轉(zhuǎn)錄因子c-Myc在前列腺癌的早期過度表達(dá)，會(huì)誘導(dǎo)全面的代謝重編程，以支持癌細(xì)胞的生存和增殖，是前列腺癌發(fā)生、發(fā)展的關(guān)鍵驅(qū)動(dòng)因子，并與前列腺癌的轉(zhuǎn)移性進(jìn)展和不良預(yù)后密切相關(guān)[25]。c-Myc會(huì)與大量在前列腺癌中觀察到的基因改變和信號(hào)缺陷交織在一起，如TMPRSS2-ERG基因融合可增加c-Myc蛋白水平，PTEN/Trp53缺失是由c-Myc蛋白表達(dá)失調(diào)引起的[26]。本研究還發(fā)現(xiàn)，c-Myc調(diào)控GRP78、HSP60等7個(gè)差異表達(dá)蛋白，參與涉及抗凋亡、調(diào)控Caspase的活性等生物學(xué)途徑，說明c-Myc在前列腺癌的TRN中占有重要的地位。

在腫瘤的發(fā)生和發(fā)展過程中，各種轉(zhuǎn)錄調(diào)控網(wǎng)絡(luò)之間存在相互作用。本研究結(jié)果顯示，差異表達(dá)蛋白富集度最高的轉(zhuǎn)錄因子網(wǎng)絡(luò)是以Slug為核心的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)，在此網(wǎng)絡(luò)中，SP1、p53、AR、ESR1與Slug轉(zhuǎn)錄調(diào)控網(wǎng)絡(luò)之間存在著相互作用。Slug屬于鋅指轉(zhuǎn)錄因子Snail家族，是一種轉(zhuǎn)錄抑制因子，參與了EMT過程中的E-Cad的下調(diào)，與前列腺癌的淋巴轉(zhuǎn)移相關(guān)[27]。還有研究發(fā)現(xiàn)，慢性缺氧誘導(dǎo)下的Slug通過激活Eph相關(guān)受體酪氨酸激酶的配體ephrin-B1的表達(dá)促進(jìn)前列腺癌細(xì)胞的侵襲[28]。

作為上游調(diào)控因子，腫瘤細(xì)胞需要多種遺傳和表觀遺傳改變來激活生長(zhǎng)因子受體、信號(hào)蛋白、激酶和轉(zhuǎn)錄因子。在構(gòu)建的TRN基礎(chǔ)上，本研究進(jìn)一步追溯了其上游的調(diào)控因子，發(fā)現(xiàn)EGCG、AKT1、FGF2、β-雌二醇處于前列腺癌異常轉(zhuǎn)錄因子的上游，與多條信號(hào)通路交織，在相關(guān)網(wǎng)絡(luò)中處于支配地位，在前列腺癌的發(fā)生、發(fā)展中扮演著重要的角色。EGCG是綠茶中的一種活性化合物，能夠介導(dǎo)前列腺癌細(xì)胞內(nèi)Ca2+升高，引起前列腺癌細(xì)胞的巰基氧化和Ca2+泄漏增強(qiáng)，該機(jī)制或可觸發(fā)EGCG對(duì)前列腺癌細(xì)胞的細(xì)胞毒作用，目前已證實(shí)EGCG對(duì)癌細(xì)胞有細(xì)胞毒作用，其劑量對(duì)于組織配對(duì)的正常細(xì)胞幾乎是無害的[29]。AKT1主要調(diào)節(jié)糖酵解途徑，在前列腺癌細(xì)胞的增殖、侵襲、跨內(nèi)皮遷移等過程中發(fā)揮重要作用，AKT1和癌基因MYC的失調(diào)能夠顯著改變由非糖營(yíng)養(yǎng)源及其下游激活的代謝途徑[30]。FGF-2和肝細(xì)胞生長(zhǎng)因子（hepatocyte growth factor，HGF）可以通過恢復(fù)腫瘤內(nèi)雄激素合成，協(xié)助前列腺癌細(xì)胞產(chǎn)生對(duì)阿比特龍的耐藥性，這可能形成一種逃逸機(jī)制，促進(jìn)了高級(jí)別前列腺癌的發(fā)展[31]。前列腺癌中FGF2與p53的相互作用相關(guān)研究中較少，作為AR和p53的共同上游調(diào)控因子，后續(xù)可以關(guān)注FGF2與p53在前列腺癌中的作用機(jī)制。β-雌二醇在前列腺癌發(fā)病中起重要作用，其水平的波動(dòng)會(huì)引起雄激素水平的變化，雄激素水平下降會(huì)引起前列腺組織萎縮，雄激素水平恢復(fù)可能會(huì)促進(jìn)前列腺上皮的再生，通過這種方式，攜帶致癌突變的細(xì)胞得以克隆擴(kuò)增[32]。雖然β-雌二醇與AR的關(guān)系已經(jīng)明確，但β-雌二醇作為上游調(diào)控因子，很有可能通過其他轉(zhuǎn)錄因子旁通路傳遞相關(guān)信號(hào)。

綜上所述，信號(hào)通路上游的調(diào)控因子和轉(zhuǎn)錄因子在癌癥發(fā)生、發(fā)展中扮演著關(guān)鍵角色，具有重要的致瘤作用，且其表達(dá)量的異常不容易被免疫系統(tǒng)識(shí)別，可逃避免疫檢查點(diǎn)治療，導(dǎo)致不良臨床預(yù)后。就設(shè)計(jì)新型藥物而言，由于缺乏高度可藥物化的載體，存在更多的蛋白質(zhì)相互作用，需要核定位等，轉(zhuǎn)錄因子及其上游調(diào)控因子相對(duì)定位于信號(hào)網(wǎng)絡(luò)中的蛋白，在靶向治療領(lǐng)域往往更具挑戰(zhàn)性。但是，由于轉(zhuǎn)錄因子的異常改變?cè)谇傲邢侔┌l(fā)生和發(fā)展早期有重要意義，并且是進(jìn)一步致癌的驅(qū)動(dòng)因素，針對(duì)轉(zhuǎn)錄因子及其上游調(diào)控因子的靶向治療能夠解決腫瘤異質(zhì)性，并且可能推遲耐藥性突變。因此，轉(zhuǎn)錄因子及其上游調(diào)控因子在臨床的治療和預(yù)后評(píng)估中具有潛在的臨床應(yīng)用價(jià)值。