王 紀(jì),方升佐

(1.南京曉莊學(xué)院,江蘇 南京 211171;2.南京林業(yè)大學(xué)林草學(xué)院,江蘇 南京 210037)

青錢柳(Cyclocaryapaliurus)又名青錢李、搖錢樹等,系胡桃科(Juglandaceae)青錢柳屬,主要分布于安徽、浙江、湖南、四川等亞熱帶地區(qū)[1]。研究發(fā)現(xiàn),青錢柳中富含多酚類、黃酮類和三萜類等生物活性成分,具有抗氧化、抗腫瘤、抗菌等功效[2-4]。然而,青錢柳因其雌雄異型異熟的特性,導(dǎo)致其種子飽滿率低,并且具有深度休眠特性,嚴(yán)重限制了青錢柳的開發(fā)和利用[5-6]。而基于組織培養(yǎng)技術(shù)的離體快繁技術(shù)不僅可以解決種苗供應(yīng)不足,對突破季節(jié)限制組織培養(yǎng)生產(chǎn)次生代謝物質(zhì)也具有特殊的理論和現(xiàn)實(shí)意義[7-8]。但由于青錢柳中含有較高的酚類物質(zhì),組培中的褐化問題成為其愈傷組織死亡和制約建立其快速繁殖體系的重要原因。

褐化主要是由于植物組織細(xì)胞中的酚類物質(zhì)氧化形成醌類物質(zhì),從而使組織呈現(xiàn)褐色的現(xiàn)象,因此在培養(yǎng)基中添加抗氧化劑抑制酚類物質(zhì)的合成和氧化成為目前緩解外植體褐化問題的主要措施[9-10]。目前,關(guān)于青錢柳組培褐化控制的研究主要集中在外植體的預(yù)處理[11]、調(diào)整繼代時(shí)間[12]、添加抗氧化劑[10,13]和激素處理[14]等4個(gè)方面。研究表明,添加抗氧化劑和激素在一定程度起到增加愈傷組織的增長量和降低褐化率的效果[15-17]。也有研究表明,外植體的取樣部位也是影響褐化的重要因素,木質(zhì)化程度越高的外植體褐化程度越高,幼嫩的材料褐化率相對較低[18]。然而,有關(guān)青錢柳不同部位外植體愈傷組織褐化率、添加吸附劑活性炭(AC)及相關(guān)生理指標(biāo)的研究鮮見報(bào)道。因此,本研究以無菌實(shí)生苗的不同器官為試驗(yàn)材料,添加具有抗氧化作用的維生素C(VC)、對酚類物質(zhì)具有專一吸附作用的聚乙烯吡咯烷酮(PVP)和具有無選擇性吸附作用的AC作為抗褐化劑,并探究抗褐化劑種類和濃度對青錢柳愈傷組織褐變及其相關(guān)代謝酶活性的影響,旨在篩選褐化率低和愈傷組織生長量較高的抗褐化劑種類和最適濃度,為解決青錢柳組織培養(yǎng)過程中愈傷組織的褐化問題提供數(shù)據(jù)支撐和科學(xué)依據(jù),為進(jìn)一步組織培養(yǎng)生產(chǎn)次生代謝物質(zhì)和建立快速繁殖體系奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 無菌實(shí)生苗培養(yǎng)材料及培養(yǎng)條件

試驗(yàn)材料為采自江蘇省鎮(zhèn)江種苗基地(119°32′52″E,30°16′40″N)的青錢柳成熟種子,種子采集后進(jìn)行去翅、水篩,將沉淀的種子置于4 ℃冰箱內(nèi)保存。接種前對種子進(jìn)行消毒處理,先用飽和洗衣粉水沖洗5 min,再在流水下沖洗1 h。沖洗干凈后在超凈工作臺(tái)上對種子進(jìn)行表面滅菌,先用70%(體積分?jǐn)?shù),下同)酒精浸泡1 min,之后用0.2%(質(zhì)量分?jǐn)?shù),下同)HgCl2浸泡20 min,最后用無菌水沖洗8次,用無菌水浸泡封口后置于超凈臺(tái)上過夜。于第2天和第3天在無菌條件下各換1次無菌水,繼續(xù)浸泡。第4天在無菌條件下?lián)Q0.1% HgCl2搖動(dòng)5 min,浸泡過夜。第5天將浸泡后的種子用無菌水沖洗8次后,在超凈工作臺(tái)上進(jìn)行剝種。取含胚軸和至少1/2子葉完整的胚作為接種試材,以獲得無菌實(shí)生苗。

無菌實(shí)生苗的培養(yǎng)基配方為:WPM+蔗糖 30 g/L+瓊脂6 g/L,pH調(diào)至5.8,121 ℃高壓滅菌20 min,培養(yǎng)溫度25 ℃、相對濕度60%、光照時(shí)間12 h/d、光照度2 000 lx。

1.2 愈傷組織誘導(dǎo)材料及培養(yǎng)條件

分別取無菌實(shí)生苗的完整葉片、根部和莖部的1 cm段作為外植體接入誘導(dǎo)培養(yǎng)基中進(jìn)行愈傷組織誘導(dǎo),30 d后將誘導(dǎo)的愈傷組織進(jìn)行兩次繼代。

愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)基配方為:MS+2.0 mg/L 6-BA+1.0 mg/L IBA+蔗糖30 g/L+瓊脂6 g/L,pH調(diào)至5.8,121 ℃高壓滅菌20 min,培養(yǎng)溫度25 ℃,相對濕度60%,光照時(shí)間12 h/d,光照度1 200 lx。

1.3 抗褐化劑處理

以愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)基為基本培養(yǎng)基,分別添加質(zhì)量濃度為0.1、0.2、0.4和1.0 g/L的VC(分別記為z1、z2、z3、z4),1.0、3.0、5.0 g/L的PVP(分別記為z5、z6、z7)和1.0、2.0、4.0 g/L的活性炭AC(分別記為z8、z9、z10),共10種處理。分別取莖段、葉片和根系經(jīng)繼代培養(yǎng)后外觀條件基本一致的愈傷組織作為試驗(yàn)材料,分別接種到經(jīng)10種處理的培養(yǎng)基上,每種處理3個(gè)重復(fù),每個(gè)重復(fù)10瓶,每瓶接4塊愈傷繼續(xù)培養(yǎng)。

1.4 測定指標(biāo)方法

1.4.1 愈傷組織鮮質(zhì)量增長量和褐化率

接種后于10、20、30和40 d統(tǒng)計(jì)愈傷組織鮮質(zhì)量增長量和增長率,于40 d時(shí)統(tǒng)計(jì)其褐化率。

愈傷組織鮮質(zhì)量增加量(g/瓶)為每瓶收獲鮮質(zhì)量與每瓶接種鮮質(zhì)量之差。愈傷組織褐化率為褐化數(shù)目占接種數(shù)目的百分比。

1.4.2 生理指標(biāo)的測定

接種后于10、20、30和40 d分別取樣,以鮮樣進(jìn)行生理指標(biāo)的測定。苯丙氨酸解氨酶(PAL)活性測定采用苯丙氨酸比色法,多酚氧化酶(PPO)活性測定采用鄰苯二酚比色法,過氧化物酶(POD)活性測定采用愈創(chuàng)木酚比色法[19]。

1.5 統(tǒng)計(jì)分析

統(tǒng)計(jì)分析使用SPSS 20.0軟件,多重比較采用新復(fù)極差法(Duncan,α=0.05),圖表繪制分別使用Origin 2017和Excel 2016,數(shù)據(jù)為均值±標(biāo)準(zhǔn)差。

2 結(jié)果與分析

2.1 抗褐化劑對青錢柳愈傷組織褐化的影響

由不同處理下不同外植體愈傷組織的褐化率(表1)可知,不同種類和濃度抗褐化劑對青錢柳莖段、葉片和根系愈傷組織褐化率有顯著影響(P< 0.05)。3種外植體愈傷組織褐化率一般隨抗褐化劑PVP和AC濃度的升高而逐漸降低,其中葉片為外植體添加PVP抗褐化劑時(shí)呈現(xiàn)先降低后升高的趨勢。添加VC的3種外植體的愈傷組織褐化率都隨著濃度的升高呈現(xiàn)先降低后升高的趨勢。與VC和PVP相比,添加AC抑制褐化效果最佳,莖段、葉片和根系愈傷組織在AC質(zhì)量濃度為4.0 g/L時(shí)褐化率最低分別為16.7%、33.3%和26.7%。

由表1還可以看出,不同處理葉片愈傷組織褐化率高于莖段和根系。添加質(zhì)量濃度為0.1、0.2和0.4 g/L 的VC處理莖段愈傷組織褐化率略高于根系,添加PVP(3.0和5.0 g/L)和AC處理根系愈傷組織褐化率略高于莖段。

2.2 抗褐化劑對青錢柳愈傷組織增長量的影響

不同種類和濃度抗褐化劑處理對青錢柳莖段、葉片和根系愈傷組織增長量均具有顯著影響(P< 0.05,表2)。在培養(yǎng)過程中,添加VC、PVP和AC處理的莖段、葉片和根系愈傷組織每10 d的增長量隨濃度增加并未呈現(xiàn)一致變化規(guī)律,但添加PVP和AC處理愈傷組織累計(jì)增長量(0～40 d)隨濃度增加呈增加趨勢,添加VC處理隨濃度增加呈先增加后降低趨勢,在0.4 g/L(z3處理)時(shí)最高。由表2還可以看出,添加VC和PVP處理不同外植體愈傷組織增長量高于AC處理,且這一差距隨培養(yǎng)時(shí)間延長而增大。莖段愈傷組織累計(jì)增長量在VC質(zhì)量濃度為0.4 g/L(z3)時(shí)最高為6.69 g,在AC質(zhì)量濃度為2.0 g/L(z9)時(shí)最低僅為0.34 g;葉片和根系愈傷組織累計(jì)增長量在PVP質(zhì)量濃度為5.0 g/L(z7)時(shí)最高,分別為6.44和5.56 g,在AC質(zhì)量濃度為1.0 g/L(z8)時(shí)最低,分別為0.25 g和0.45 g。

除個(gè)別處理外,莖段、葉片和根系愈傷組織增長量隨培養(yǎng)時(shí)間呈逐漸增加趨勢,在30～40 d增長量最高,且不同外植體平均愈傷組織增長量從大 到小依次為:莖段>葉片>根系,莖段愈傷組織質(zhì)量為3.57 g,分別為葉片和根系的1.17和1.19倍。

2.3 抗褐化劑對青錢柳愈傷組織相關(guān)酶活性的影響

2.3.1 苯丙氨酸解氨酶(PAL)活性

由抗褐化劑對青錢柳不同器官愈傷組織PAL活性的影響結(jié)果(圖1a)可知,青錢柳莖段、葉片和根系愈傷組織PAL活性在不同抗褐化劑種類和濃度處理間有顯著差異(P<0.05)。添加PVP和VC處理的莖段、葉片和根系愈傷組織PAL活性略高于AC處理。在0～40 d,所有處理不同器官愈傷組織PAL活性均值在葉片中最高為7 526.8 U/(g·h),比莖段和根系分別高出42.3%和21.9%。

由圖1還可以看出,愈傷組織PAL活性隨抗褐化劑添加濃度的增加整體呈逐漸降低的趨勢。在0～40 d,z3、z4、z6和z7處理莖段愈傷組織PAL活性變化相對平穩(wěn);z10處理PAL活性顯著低于其他處理,而z1和z5處理PAL活性較高(圖1a)。除z3處理外,其他處理葉片愈傷組織PAL活性在0～40 d均具有較大變化幅度,z1處理的PAL活性顯著高于其他處理(圖1b)。根系愈傷組織PAL活性在培養(yǎng)過程中整體呈逐漸降低的趨勢;z1處理愈傷組織PAL活性最高,而以z9和z10處理PAL活性最低(圖1c)。

2.3.2 多酚氧化酶(PPO)活性

抗褐化劑種類和濃度對青錢柳莖段、葉片和根系愈傷組織PPO活性有顯著影響(P< 0.05,圖2)。添加PVP處理(z5—z7)的莖段、葉片和根系愈傷組織PPO活性高于添加AC(z8—z10)和VC(z1—z4)處理。在0～40 d,不同處理愈傷組織PPO活性在不同器官中均值從大到小依次為:葉片>莖段>根系,分別為858.1、713.7和705.5 U/(g·min)。

莖段、葉片和根系愈傷組織PPO活性隨抗褐化劑添加濃度的增加整體呈先增加后降低的單峰變化趨勢。在0～40 d,添加AC處理的莖段愈傷組織PPO活性變化相對平穩(wěn),z8處理PPO活性低于其他處理(圖2a)。除z2和z4處理外,其他葉片愈傷組織PPO活性在培養(yǎng)過程中均有較大變化幅度,z3和z6處理PPO活性高于其他處理,而z8低于其他處理(圖2b)。根系愈傷組織PPO活性在培養(yǎng)過程中均有較大變異幅度,z6和z7處理在第30 d時(shí)活性最高,而其他處理均在第30 d活性最低(圖2c)。

圖2 抗褐化劑對青錢柳不同器官愈傷組織PPO活性的影響Fig. 2 Effects of anti-browning agents on PPO activity of callus in different organs of C. paliurus

2.3.3 過氧化物酶(POD)活性

抗褐化劑種類和濃度對青錢柳莖段、葉片和根系愈傷組織POD活性有顯著影響(P<0.05)。與VC和PVP相比,添加抗褐化劑AC(z8—z10)處理莖段、葉片和根系愈傷組織POD活性較低。在培養(yǎng)階段,不同處理愈傷組織POD活性在不同器官中均值從大到依次為:葉片>莖段>根系,分別為4 524.0、3 613.6和3051.6 U/(g·min)(圖3)。

圖3 抗褐化劑對青錢柳不同器官愈傷組織POD活性的影響Fig. 3 Effects of anti-browning agents on POD activity of callus in different organs of C. paliurus

由圖3還可看出,不同器官愈傷組織POD活性隨抗褐化劑添加濃度的增加與PPO呈一致單峰變化趨勢。在培養(yǎng)過程中,不同處理莖段愈傷組織POD活性呈先增加后降低變化趨勢,在第20天或30天達(dá)到最大值;z3和z6處理POD活性高于其他處理(圖3a)。添加AC處理葉片愈傷組織POD活性在培養(yǎng)過程中變化平穩(wěn),z2、z3、z5和z7處理在第30天和第 40天遠(yuǎn)高于第10天和20天;z6處理POD活性顯著高于其他處理(圖3b)。由圖3c可知,在0～40 d,z8和z9處理根系愈傷組織POD活性變化平穩(wěn),z2、z5和z6處理變化明顯,呈先增加后降低趨勢;z8和z10處理POD活性顯著低于其他處理。

2.4 相關(guān)性分析

相關(guān)性分析結(jié)果(表3)表明,青錢柳愈傷組織褐化率與PAL活性呈極顯著正相關(guān)(P<0.01),但與PPO和POD活性相關(guān)關(guān)系不顯著。愈傷組織增長量與PPO和POD活性顯著正相關(guān)(P<0.05),但與PAL活性相關(guān)關(guān)系不顯著。

表3 青錢柳愈傷組織褐化率、增長量與生物酶 活性指標(biāo)的相關(guān)性分析

3 討 論

植物組織初代培養(yǎng)、愈傷組織的繼代培養(yǎng)過程中經(jīng)常出現(xiàn)褐化現(xiàn)象,這對離體培養(yǎng)的外植體誘導(dǎo)和生長產(chǎn)生不利影響[7, 20]。在植物組織培養(yǎng)過程中,褐變的底物是酚類化合物,而PAL是酚類化合物合成途徑中的關(guān)鍵酶和限速酶[21],因此,PAL與植物組織培養(yǎng)的愈傷組織褐變有密切的關(guān)系。謝寅峰等[10]對青錢柳愈傷組織褐化的研究結(jié)果表明,青錢柳愈傷組織的PAL活性在不同種類抗褐化劑處理下均受到抑制,并且隨著抗褐化劑濃度的增加呈下降趨勢。本研究也證實(shí),3種抗褐化劑對青錢柳莖段、葉片和根系的愈傷組織內(nèi)的PAL活性的抑制效果在不同種類和濃度的抗褐化劑處理間存在顯著差異(P< 0.05),且PAL活性均隨著抗褐化劑添加量的增加而降低。同時(shí),葉片的愈傷組織PAL活性高于莖段和根系的愈傷組織,這可能是由于青錢柳葉是酚類物質(zhì)合成的主要部位[22]。另外,添加AC處理的愈傷組織PAL的活性低于PVP和VC處理的,這可能是因?yàn)锳C的吸附?jīng)]有選擇性,導(dǎo)致了培養(yǎng)基中的營養(yǎng)物質(zhì)也被吸附,從而造成酚類物質(zhì)的合成底物減少[23]。

PPO和POD是植物體內(nèi)普遍存在的氧化酶,在組織培養(yǎng)中將酚類物質(zhì)氧化成醌類物質(zhì),從而引起愈傷組織褐變,因此,PPO和POD活性的高低也是引起愈傷組織褐變的關(guān)鍵[24-25]。本研究結(jié)果顯示,青錢柳葉片的愈傷組織內(nèi)PPO和POD活性顯著高于莖段和根系愈傷組織的,這可能是因?yàn)榍噱X柳葉的酚類物質(zhì)含量顯著高于根和莖的[22],且PPO和POD活性均與愈傷組織內(nèi)酚類物質(zhì)含量呈正相關(guān)關(guān)系[25-26]。同時(shí),青錢柳莖段、葉片和根系愈傷組織內(nèi)的PPO和POD活性均隨著3種抗褐化劑濃度的增加呈現(xiàn)單峰趨勢,這可能是由于過高濃度的抗褐化劑抑制了愈傷組織內(nèi)的酚類物質(zhì)的合成。添加PVP處理的愈傷組織PPO和POD活性高于AC和VC處理,這可能是因?yàn)锳C處理的愈傷組織合成的酚類物質(zhì)較少,而VC作為一種強(qiáng)抗氧化劑,既能作為醌類物質(zhì)的還原劑,又能抑制PPO的活性,從而起到抗褐化的作用[27]。

由于不同外植體的酚類物質(zhì)含量存在差異,因此抗褐化劑種類的選擇及其濃度對不同組織的抗褐化能力和愈傷組織增長的影響并不一致[18,27],本研究結(jié)果也表明青錢柳莖段、葉片和根系的愈傷組織褐化率和增長量在不同種類和濃度的抗褐化劑的處理間存在差異。此外,研究發(fā)現(xiàn),植物愈傷組織的褐化與相關(guān)酶活性密切相關(guān)[28]。本研究的相關(guān)分析表明,青錢柳愈傷組織褐化率與PAL活性呈極顯著正相關(guān)(P< 0.01),而愈傷組織增長量與PPO和POD活性顯著正相關(guān)(P< 0.05)。這說明PAL的活性在青錢柳愈傷組織褐化過程中到關(guān)鍵作用,而愈傷組織增長量受到PPO和POD活性的影響。綜合上述PAL、PPO和POD 3種酶的研究結(jié)果發(fā)現(xiàn),添加AC的處理對青錢柳愈傷組織褐化抑制效果最好,青錢柳莖段、葉片和根系的愈傷組織褐化率結(jié)果也顯示添加AC處理的褐化率最低。但是,添加AC處理的莖段、葉片和根系的愈傷組織增長量也是最低的,甚至抑制青錢柳愈傷組織的生長,這與陳雪梅等[26]和馮代弟[29]的研究結(jié)果一致,AC是一種無選擇性的吸附劑,其在吸附酚類物質(zhì)的同時(shí)也會(huì)影響培養(yǎng)基的營養(yǎng)物質(zhì)的含量,導(dǎo)致生長受阻。同時(shí)高濃度的PVP會(huì)抑制青錢柳莖段、葉片和根系的愈傷組織增長,可能是因?yàn)楦邼舛鹊腜VP會(huì)抑制植物對6-BA等有益物質(zhì)的吸收利用[30]。而高濃度的VC會(huì)增加青錢柳莖段、葉片和根系的愈傷組織褐化率,這可能是因?yàn)閂C濃度過高時(shí),部分VC會(huì)與氨基酸發(fā)生反應(yīng),增加褐化程度[31-32]。因此,在對青錢柳進(jìn)行組織培養(yǎng)時(shí),除了選擇最適宜抗褐化劑及其最適濃度,還需對青錢柳外植體材料進(jìn)行選擇。

綜上所述,不同抗褐化劑及其不同濃度對青錢柳愈傷組織褐化率和生長的影響有所差異,以4.0 g/L的AC處理褐化率最低,以0.4 g/L的VC處理莖段愈傷組織累計(jì)增長量最高。進(jìn)一步探索愈傷組織的褐化率與相關(guān)酶活性的關(guān)系,PAL酶活性在愈傷組織褐化過程中起到關(guān)鍵作用,可以作為青錢柳組織培養(yǎng)過程中褐化控制的主要參考酶指標(biāo),同時(shí)外植體器官的類型選擇也是控制褐化要考慮的因素。研究結(jié)果為青錢柳建立組織培養(yǎng)快速繁殖體系和離體生產(chǎn)次生代謝物質(zhì)提供了一定的理論基礎(chǔ)和技術(shù)支撐,但對其次生代謝物質(zhì)的積累和褐化機(jī)理還有待進(jìn)一步深入研究。