吳敏，劉濤峰，劉小平，曹宇，章緯，汪長中（1.安徽中醫(yī)藥大學(xué)中西醫(yī)結(jié)合學(xué)院，安徽 合肥 3001；.安徽中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院，安徽 合肥 30031；3.安徽省中醫(yī)藥科學(xué)院中西醫(yī)結(jié)合研究所，安徽 合肥 3001；4.安徽中醫(yī)藥大學(xué)中藥復(fù)方安徽省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，安徽 合肥 3001）

尋常型銀屑病（Psoriasis vulgaris）是一種常見的慢性免疫炎癥性皮膚病，影響全球近6 000 萬人口[1]，發(fā)病率呈上升趨勢。尋常型銀屑病的主要特征為復(fù)發(fā)性鱗片狀紅色斑塊及丘疹，可累及任何部位的皮膚，以肘部、膝蓋及頭皮更為常見[2]，且與高血壓、肥胖、Ⅱ型糖尿病等多種疾病密切關(guān)聯(lián)[3]，但缺乏特效治療藥物。一般認(rèn)為銀屑病的發(fā)生與遺傳易感性及環(huán)境因素相關(guān)[4]，但確切的發(fā)病機(jī)制尚不明確。新近研究[5]證實(shí)，核苷酸結(jié)合寡聚化結(jié)構(gòu)域樣受體蛋白3（NLRP3）炎癥小體過度活化，并產(chǎn)生大量白細(xì)胞介素1β（IL-1β）等炎性因子，在銀屑病的發(fā)生發(fā)展過程中發(fā)揮重要作用。抑制NLRP3炎癥小體活性的藥物能夠緩解銀屑病皮損部位的免疫炎癥性損傷，從而改善其臨床癥狀[6]。復(fù)方澤漆沖劑由澤漆、大青葉、白花蛇舌草、土茯苓、板藍(lán)根、大血藤、半枝蓮、黃芩、貫眾、龍膽草、莪術(shù)、五味子等中藥組成，是安徽中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院的特色中藥制劑，臨床應(yīng)用能明顯改善進(jìn)行期尋常性銀屑病患者的臨床癥狀，降低異常升高的血清腫瘤壞死因子α（TNF-α）、IL-8 水平，改善微血管情況[7-8]。故本研究擬從NLRP3炎癥小體角度探討復(fù)方澤漆沖劑對尋常型銀屑病的作用及機(jī)制，以期為中醫(yī)藥治療尋常型銀屑病提供參考。

1 材料

1.1 動(dòng)物雄性BALB/c 小鼠56 只，SPF 級，4～6 周齡，（20±2）g，購于杭州子源實(shí)驗(yàn)動(dòng)物科技有限公司，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物生產(chǎn)許可證號：SCXK（浙）2019-0004，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物質(zhì)量合格證號：20210927Abzz0105000646。本實(shí)驗(yàn)經(jīng)安徽中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物倫理委員會(huì)批準(zhǔn)，批文號：AHUCM-mouse-2021113。

1.2 藥物及試劑復(fù)方澤漆沖劑，安徽中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院，批號：20201230；5%咪喹莫特軟膏，四川明欣藥業(yè)有限責(zé)任公司，批號：39210802；甲氨蝶呤片，上海上藥信誼藥廠有限公司，批號：191213；NLRP3 抑制劑（MCC950），上海宏葉生物科技有限公司，批號：GC316443；凡士林軟膏，廣東恒健制藥有限公司，批號：210903。復(fù)方澤漆沖劑、甲氨蝶呤片均以生理鹽水配制為混懸液，MCC950 以磷酸鹽緩沖液（PBS，pH=7.4）溶解，4 ℃保存，用前混勻。

IL-1β ELISA 檢測試劑盒（批號：GR2021-11）、IL-18 ELISA 檢測試劑盒（批號：GR2021-11），武漢基因美生物科技有限公司；Novostart SYBR qPCR SuperMix Plus，安諾倫（北京）生物科技有限公司，批號：05229413；PrimeScriptTMRT reagent Kit with gDNA Eraser，日本TaKaRa 公司，批號：AL21115A；NLRP3 抗體，成都正能生物制劑有限公司，批號：LL0311；凋亡相關(guān)斑點(diǎn)樣蛋白（ASC）抗體，亞科因（武漢）生物技術(shù)有限公司，批號：ATUMR3205；半胱氨酸蛋白酶1（Caspase-1）抗體，艾博抗（上海）貿(mào)易有限公司，批號：GR3265120-7；蘇木素染液（批號：06252114）、醇溶伊紅染液（批號：06242112）、中性樹脂（批號：06272110），均購自上海埃德伯格科技集團(tuán)有限公司；RIPA 細(xì)胞裂解液，上海碧云天生物技術(shù)有限公司，批號：09271919023；十二烷基硫酸鈉（SDS，批號：723T033）、甘氨酸（批號：516V061）、Tris（批號：809C0730）、Tween-20（批號：1121S017），均購自北京索萊寶科技有限公司；TRIzol（批號：350508）、ECL 超敏發(fā)光試劑盒（批號：VC298015）、預(yù)染蛋白Marker（批號：00784045），均購自美國賽默飛世爾科技公司；山羊抗兔IgG（批號：202700514）、山羊抗小鼠IgG（批號：140193），均購自北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司；β-actin 抗體，生工生物工程（上海）股份有限公司，批號：20210806。

1.3 主要儀器PIKOREAL 96型熒光定量PCR儀，美國賽默飛世爾科技公司；VE-180型電泳槽、EPS300型電泳儀、VE-186型轉(zhuǎn)膜儀，上海天能科技有限公司；JS-1070P 型自動(dòng)曝光儀，上海培清科技有限公司；RT-6000型酶標(biāo)儀，深圳雷杜生命科學(xué)股份有限公司；YB-7LF 型生物組織包埋機(jī)、YT-7FB 型生物組織攤烤片機(jī)、ZT-12M型生物組織自動(dòng)脫水機(jī)，湖北亞光醫(yī)療器械有限公司；RM2016型切片機(jī)，上海徠卡儀器公司；JW-3021HR 型高速冷凍離心機(jī)，安徽嘉文儀器裝備有限公司。

2 方法

2.1 分組、模型復(fù)制[9]及給藥適應(yīng)性飼養(yǎng)3 d后，將56 只小鼠按照體質(zhì)量隨機(jī)分為7 組：正常組、模型組、甲氨蝶呤組（陽性藥組）、NLRP3 抑制劑組（MCC950組）及復(fù)方澤漆沖劑低、中、高劑量組，每組8只。各組小鼠背部使用小鼠剃毛器剃毛，裸露皮膚面積約為2 cm×3 cm，再用10% Na2S 脫去剩余毛發(fā)；第1 天觀察脫毛區(qū)有無紅腫、破潰等異常反應(yīng)；次日起，正常組小鼠背部脫毛區(qū)均勻涂抹凡士林軟膏，其余6 組小鼠背部脫毛區(qū)均勻涂抹5%咪喹莫特軟膏（每只62.5 mg），連續(xù)7 d。

造模同時(shí)給藥治療，按照小鼠與人體表面積換算給藥劑量，復(fù)方澤漆沖劑低、中、高劑量組按照9.75、19.5、29.25 g·kg-1劑量灌胃給藥，甲氨蝶呤組按照1 mg·kg-1劑量灌胃給藥，各組灌胃體積為10 mL·kg-1；正常組和模型組灌胃等體積生理鹽水；NLRP3 抑制劑組按照25 mg·kg-1劑量腹腔注射MCC950；每天給藥1次，連續(xù)7 d。

2.2 樣本采集末次給藥24 h后，各組小鼠予以摘除眼球取血，每只收集0.5 mL 血液；室溫下靜置0.5 h后，以2 000 r·min-1（離心半徑為10 cm）離心10 min，吸取上層血清，-20 ℃保存；取血后脫頸處死小鼠，取背部皮損區(qū)皮膚組織。

2.3 皮損指數(shù)評價(jià)采用PASI（Psoriasis area and severity index）評分[9]進(jìn)行銀屑病模型小鼠皮損指數(shù)評價(jià)。造模后每日拍照記錄小鼠皮損變化情況，對皮損處的紅斑、鱗屑、增厚程度分別進(jìn)行0～4 級評分（無，0 分；輕度，1 分；中度，2 分；重度，3 分；極重度，4分），將三者評分合計(jì)得到PASI總分。

2.4 HE 染色法觀察皮損組織病理變化采用4%多聚甲醛溶液固定新鮮的皮損組織后，經(jīng)過脫水、包埋、切片、脫蠟處理；然后進(jìn)行蘇木素染色，再放入伊紅溶液中染色3 min；最后經(jīng)乙醇梯度脫水、二甲苯透明、中性樹膠封片后，在光學(xué)顯微鏡下觀察皮損組織病理變化，并利用CaseViewer軟件測量皮損表皮厚度。

2.5 免疫組織化學(xué)法檢測皮損組織中NLRP3 蛋白表達(dá)水平取“2.4”項(xiàng)下制備的小鼠皮膚組織切片，經(jīng)二甲苯脫蠟、水化后，用檸檬酸鹽緩沖液進(jìn)行抗原熱修復(fù)；待溫度降至室溫后，依次用3% H2O2室溫孵育，PBS 沖洗；然后滴加NLRP3（1∶200）抗體，置于37 ℃培養(yǎng)箱孵育60 min；PBST沖洗后滴加二抗，37 ℃下孵育30 min；PBST 沖洗后DAB 顯色，蒸餾水沖洗終止；然后用蘇木素襯染2～5 min，水洗干凈；1%鹽酸乙醇分化，再次水洗；切片經(jīng)碳酸鋰溶液藍(lán)化、常規(guī)脫水、二甲苯透明、中性樹膠封片后鏡檢。每只小鼠皮膚切片在200倍鏡下隨機(jī)選取1 個(gè)視野，細(xì)胞核呈藍(lán)色，陽性表達(dá)為棕色；采用Image-Pro Plus 6.0 軟件測定每個(gè)視野中的積分光密度（IOD）值，并進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。

2.6 ELISA 法檢測小鼠血清IL-1β、IL-18 含量取“2.2”項(xiàng)下制備的小鼠血清，室溫下解凍后，嚴(yán)格按照試劑盒說明書步驟進(jìn)行操作，采用ELISA法檢測小鼠血清IL-1β、IL-18含量。

2.7 qRT-PCR 法檢測皮損組織NLRP3、ASC、Caspase-1 mRNA 表達(dá)水平取小鼠皮膚組織50～100 mg，液氮研磨成粉末，加入1 mL TRIzol 裂解液，提取總RNA，檢測RNA 濃度及純度。按照反轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書步驟操作，合成cDNA，逆轉(zhuǎn)錄條件為：42 ℃、2 min，冰浴1 min；37 ℃、15 min；85 ℃、5 s。以cDNA 為模板，加入靶基因上、下游引物于10 μL反應(yīng)體系內(nèi)，進(jìn)行PCR擴(kuò)增反應(yīng)，反應(yīng)條件為：95 ℃預(yù)變性1 min，95 ℃變性20 s，60 ℃退火1 min，共40個(gè)循環(huán)。反應(yīng)結(jié)束后，根據(jù)擴(kuò)增曲線及熔解曲線判斷PCR 反應(yīng)特異性。結(jié)果以β-actin 為內(nèi)參，采用2-△△Ct法計(jì)算目的基因的相對表達(dá)水平，并進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。引物由生工生物工程（上海）股份有限公司合成，引物序列見表1。

表1 qRT-PCR 引物序列Table 1 qRT-PCR primer sequences

2.8 Western Blot 法檢測皮損組織中NLRP3、ASC、Caspase-1 蛋白表達(dá)水平稱取冷凍的小鼠背部皮損組織0.1 g 至勻漿器中，剪碎，充分研磨后，加入1 mL 組織蛋白裂解液；充分勻漿后，以4 ℃、12 000 r·min-1（離心半徑為10 cm）離心15 min，取上清液；采用BCA 法測定總蛋白濃度。加上樣緩沖液及蛋白制備樣品，沸水浴使蛋白變性；采用SDSPAGE 凝膠電泳分離蛋白，將凝膠中的蛋白轉(zhuǎn)印至PVDF 膜上；用5%脫脂牛奶在室溫下?lián)u床封閉1 h后，添加一抗［NLRP3、ASC、Caspase-1（1∶1 000）、β-actin（1∶1 000）］，4 ℃下孵育過夜；TBST 洗膜3 次，添加辣根過氧化物酶（HRP）標(biāo)記的二抗（1∶20 000），室溫下孵育1 h；TBST 洗膜3 次后，采用ECL化學(xué)發(fā)光法曝光顯影，拍照；采用ImageJ圖像分析軟件分析蛋白條帶灰度值，以β-actin 為內(nèi)參，對目的蛋白進(jìn)行半定量分析。

2.9 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理方法采用SPSS 25.0 統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析；計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示；多組間比較采用單因素方差分析（One-way ANOVA），兩兩比較采用LSD 或Games-howell 法檢驗(yàn)；以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

3 結(jié)果

3.1 復(fù)方澤漆沖劑對銀屑病樣小鼠皮損外觀的影響結(jié)果見圖1。與正常組比較，模型組小鼠在外涂5%咪喹莫特軟膏次日，造模區(qū)皮膚即可見少許粗糙；第3天可見皮膚上有少許紅斑，上有少許鱗屑，皮損稍增厚；第5天可見片狀紅斑，鱗屑較多，皮損厚度增加；第7天皮損顯著增厚，并出現(xiàn)典型紅斑、浸潤及鱗屑，PASI 評分顯著升高（P＜0.01）。與模型組比較，給藥組小鼠背部造模區(qū)皮損紅斑及鱗屑明顯減少，浸潤程度明顯減輕，PASI 評分顯著降低（P＜0.05，P＜0.01）。結(jié)果表明，5%咪喹莫特軟膏對小鼠背部造模區(qū)的皮損病理學(xué)改變符合銀屑病特征，而復(fù)方澤漆沖劑可改善銀屑病樣小鼠的皮損。

3.2 復(fù)方澤漆沖劑對銀屑病樣小鼠皮損組織病理形態(tài)變化及表皮厚度的影響結(jié)果見圖2。正常組小鼠背部皮膚表現(xiàn)為1～3 層角質(zhì)層細(xì)胞，3～5 層棘層細(xì)胞，基底層細(xì)胞完整，真皮淺層及血管周圍未見明顯炎性細(xì)胞浸潤。與正常組比較，模型組小鼠皮膚角化過度伴角化不全，棘層增厚、表皮突下延，真皮淺層淋巴細(xì)胞浸潤明顯，表皮厚度顯著增加（P＜0.01）。與模型組比較，給藥組小鼠皮膚組織病理損傷程度明顯減輕，復(fù)方澤漆沖劑高劑量組、甲氨蝶呤組及NLRP3 抑制劑組小鼠的表皮厚度顯著降低（P＜0.01）。結(jié)果表明，復(fù)方澤漆沖劑能抑制銀屑病樣小鼠表皮細(xì)胞增殖。

圖2 復(fù)方澤漆沖劑對銀屑病樣小鼠皮損組織病理變化及表皮厚度的影響（HE 染色，×200；±s，n=8）Figure 2 Effects of Compound Zeqi Granules on skin lesions histopathological changes and skin thickness in psoriasis-like mice（HE staining，×200；±s，n=8）

3.3 復(fù)方澤漆沖劑對銀屑病樣小鼠皮損組織中NLRP3表達(dá)的影響結(jié)果見圖3。與正常組比較，模型組小鼠皮損組織中NLRP3 蛋白表達(dá)量顯著升高（P＜0.01）。與模型組比較，給藥組小鼠皮損組織中NLRP3 蛋白表達(dá)量均顯著降低（P＜0.01）。結(jié)果表明，復(fù)方澤漆沖劑能抑制銀屑病樣小鼠皮損組織中NLRP3炎癥小體的表達(dá)。

圖3 復(fù)方澤漆沖劑對銀屑病樣小鼠皮損組織中NLRP3 表達(dá)的影響（免疫組化，×200；±s，n=8）Figure 3 Effect of Compound Zeqi Granules on NLRP3 expression in skin lesion tissue of psoriasis-like mice（IHC，×200；±s，n=8）

3.4 復(fù)方澤漆沖劑對銀屑病樣小鼠血清中IL-1β、IL-18 水平的影響結(jié)果見圖4。與正常組比較，模型組小鼠血清IL-1β、IL-18 水平顯著升高（P＜0.01）；與模型組比較，給藥組小鼠血清IL-18水平均顯著降低（P＜0.05，P＜0.01），復(fù)方澤漆沖劑高劑量組、甲氨蝶呤組及NLRP3抑制劑組小鼠的血清IL-1β水平均顯著降低（P＜0.01）。結(jié)果表明，復(fù)方澤漆沖劑能抑制銀屑病樣小鼠血清中炎癥因子IL-1β、IL-18的表達(dá)。

圖4 復(fù)方澤漆沖劑對銀屑病樣小鼠血清中IL-1β、IL-18 水平的影響（±s，n=8）Figure 4 Effects of Compound Zeqi Granules on serum IL-1β and IL-18 levels in psoriasis-like mice（±s，n=8）

3.5 復(fù)方澤漆沖劑對銀屑病樣小鼠皮損組織NLRP3、ASC、Caspase-1 mRNA 及蛋白表達(dá)的影響結(jié)果見圖5、圖6。與正常組比較，模型組小鼠皮損組織NLRP3、ASC、Caspase-1 mRNA 及蛋白表達(dá)顯著上調(diào)（P＜0.01）。與模型組比較，給藥組小鼠皮損組織NLRP3、ASC、Caspase-1 mRNA 及蛋白表達(dá)均顯著下調(diào)（P＜0.05，P＜0.01）。結(jié)果表明，復(fù)方澤漆沖劑能抑制銀屑病樣小鼠NLRP3炎癥小體的表達(dá)。

圖5 復(fù)方澤漆沖劑對銀屑病樣小鼠皮損組織NLRP3、ASC、Caspase-1 mRNA 表達(dá)的影響（±s，n=8）Figure 5 Effects of Compound Zeqi Granules on mRNA expressions of NLRP3，ASC and Caspase-1 in skin lesion tissue of psoriasislike mice（±s，n=8）

圖6 復(fù)方澤漆沖劑對銀屑病樣小鼠皮損組織NLRP3、ASC、Caspase-1 蛋白表達(dá)的影響（±s，n=8）Figure 6 Effects of Compound Zeqi Granules on protein expressions of NLRP3，ASC and Caspase-1 in skin lesion tissue of psoriasislike mice（±s，n=8）

4 討論

銀屑病是多因素交互的復(fù)雜疾病，遺傳因素與環(huán)境因素在發(fā)病過程中發(fā)揮了重要作用[10-11]，共同影響銀屑病的免疫病理性損傷。復(fù)方澤漆沖劑是安徽中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院開發(fā)的用于治療銀屑病的院內(nèi)制劑。方中君藥澤漆、大青葉、白花蛇舌草清熱涼血解毒；臣藥土茯苓、板藍(lán)根、大血藤、半枝蓮能夠增強(qiáng)君藥清熱解毒之效；佐以黃芩、貫眾、龍膽草、莪術(shù)、五味子，共奏清熱涼血解毒、行氣活血消瘀之功。多年來的臨床應(yīng)用[7-8]表明，復(fù)方澤漆沖劑對內(nèi)有蘊(yùn)熱，郁于血分，復(fù)感毒邪所致的風(fēng)熱血燥型銀屑病療效顯著。

研究表明，IL-17/IL-23 軸在銀屑病發(fā)病過程中起重要作用[12-13]，但隨著對銀屑病發(fā)病機(jī)制研究的不斷深入，發(fā)現(xiàn)NLRP3炎癥小體的過度活化也與銀屑病密切相關(guān)，NLRP3炎癥小體被視為干預(yù)銀屑病的一個(gè)新的重要靶標(biāo)[5-6]。炎癥小體是由胞漿內(nèi)模式識別受體（PRRs）參與組裝的多蛋白復(fù)合物，是機(jī)體固有免疫系統(tǒng)的重要組成部分。炎癥小體能夠識別病原相關(guān)分子模式（PAMPs）或宿主來源的危險(xiǎn)信號分子（DAMPs），招募并激活半胱天冬氨酶的前體（pro-Caspase-1）；活化的Caspase-1 能夠切割I(lǐng)L-1β、IL-18 的前體，產(chǎn)生相應(yīng)的成熟細(xì)胞因子IL-1β、IL-18，以清除病原體或應(yīng)對危險(xiǎn)信號，發(fā)揮對宿主的防御保護(hù)作用[14]。在眾多炎癥小體中，針對NLRP3炎癥小體的研究最多，其活化失調(diào)可導(dǎo)致過度炎癥反應(yīng)，并參與了包括銀屑病在內(nèi)的多種免疫炎癥性疾病的發(fā)生發(fā)展[15]，抑制NLRP3炎癥小體的過度活化有助于銀屑病的治療。研究[16]發(fā)現(xiàn)，尋常型銀屑病患者皮損與非皮損處皮膚比較，ASC、Caspase-1 mRNA 及蛋白表達(dá)水平均顯著上調(diào)。與正常皮膚比較，銀屑病患者受累表皮中NLRP3炎癥小體、IL-18和IL-1β表達(dá)水平明顯升高[17]。洋金花有效部位可以通過調(diào)控TLR7/8-MyD88-NF-κB 通路介導(dǎo)的NLRP3抑制咪喹莫特誘導(dǎo)的小鼠銀屑病樣皮損形成[9]；人參皂苷Rg1 可通過抑制ROS/NLRP3 通路緩解小鼠銀屑病樣皮損[18]。本研究結(jié)果顯示，與正常組比較，外用5%咪喹莫特乳膏的模型組小鼠背部造模區(qū)銀屑病樣皮損處的NLRP3、ASC、Caspase-1 mRNA 及蛋白表達(dá)均顯著上調(diào)，血清IL-1β、IL-18 水平顯著升高，與上述研究結(jié)果基本一致。而復(fù)方澤漆沖劑干預(yù)后，能夠明顯抑制銀屑病樣小鼠NLRP3炎癥小體的表達(dá)，降低血清炎癥因子IL-1β、IL-18水平。

另有研究[12-13，19]指出，IL-23/Th17 軸在銀屑病發(fā)病過程中發(fā)揮了重要作用，Th17 細(xì)胞活化后能夠釋放IL-17、IL-22、IL-21等細(xì)胞因子，促進(jìn)角質(zhì)細(xì)胞過度增生，使表皮顯著增厚并向真皮生長，并逐漸衍變?yōu)槁匝装Y性皮膚損害。本課題組前期研究[20]發(fā)現(xiàn)，復(fù)方澤漆沖劑能明顯改善尋常型銀屑病患者的臨床癥狀，降低血清IL-17、IL-22、IL-23、IL-8 及TNF-α等炎癥因子水平。研究[21]發(fā)現(xiàn)，NLRP3炎癥小體活化所產(chǎn)生的IL-1β 能夠通過作用于Th17 細(xì)胞促進(jìn)IL-17 的產(chǎn)生。因此推測，復(fù)方澤漆沖劑調(diào)控NLRP3炎癥小體既可能通過直接活化所產(chǎn)生的IL-1β影響皮膚慢性炎癥性損害，也可能通過調(diào)控IL-23/Th17 軸影響皮損，具體作用機(jī)制有待進(jìn)一步深入探討。

綜上所述，復(fù)方澤漆沖劑能改善銀屑病樣小鼠的皮損，可能與其抑制NLRP3炎癥小體的表達(dá)，降低血清炎癥因子IL-1β、IL-18水平有關(guān)。