慈 麗,史紀(jì)強(qiáng),李 晏,曾南方,顏其貴

1.甘肅省甘南州迭部縣動(dòng)物疫病預(yù)防控制中心,甘肅 迭部 747400 2.四川農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)院,四川 成都 611130 3.巨星農(nóng)牧有限公司,四川 樂山 614899

0 引言

大腸埃希菌(Escherichiacoli,E.coli)俗稱大腸桿菌,是動(dòng)物腸道中的正常寄居菌,在特定條件下,大腸桿菌可引起人和動(dòng)物的腸道和腸外組織感染[1]。少部分血清型的大腸桿菌及其產(chǎn)生的毒素可引起豬發(fā)病,即豬大腸桿菌病[2]。該病主要引起豬腸道膨脹,腸系膜淋巴結(jié)充血腫大,肝、腎等組織臟器出現(xiàn)凝固性壞死[3],對(duì)仔豬生長(zhǎng)發(fā)育影響重大,是影響?zhàn)B豬業(yè)發(fā)展的重要疫病之一[4]。不同日齡豬對(duì)大腸桿菌易感性不同,但仔豬對(duì)其易感性最高,因日齡的不同,仔豬的發(fā)病臨床表現(xiàn)也不同,可分為以排黃色漿狀稀糞為主的仔豬黃痢、排乳白或灰白漿糊狀糞便的仔豬白痢和以胃壁等部位水腫為主的仔豬水腫病。目前,大腸桿菌病在世界各地均有報(bào)道,其發(fā)病率和死亡率在仔豬疾病中位于前列[5]。該病有較高的致病率和病死率,在我國多個(gè)地區(qū)時(shí)有發(fā)生,對(duì)我國的養(yǎng)豬業(yè)有嚴(yán)重的危害,可造成嚴(yán)重經(jīng)濟(jì)損失。

近來,四川某地豬場(chǎng)發(fā)生一起以腹瀉為主要特征的疫情,發(fā)病快且具有較高的死亡率,為弄清楚其病原,特進(jìn)行微生物學(xué)診斷和藥敏試驗(yàn),以判明其病因并提供治療藥物參考。

1 材料與方法

1.1 材料

1)病料來源:四川雅安某豬場(chǎng)腹瀉死亡仔豬。

2)試驗(yàn)動(dòng)物:2頭斷奶仔豬,臨床健康、體質(zhì)量相近,由巨星農(nóng)牧股份有限公司提供。

3)主要試劑:細(xì)菌DNA提取試劑盒,購自天根生化科技(北京)有限公司;2×Rapid Taq Master Mix,購自南京諾唯贊生物科技股份有限公司;20×磷酸鹽緩沖液(PBS),購自上海生工生物科技有限公司;藥敏紙片阿莫西林、氨芐西林、氨曲南、丁胺卡那、多西環(huán)素、多粘菌素、恩諾沙星、呋喃妥因、氟苯尼考、磺胺異噁唑、美羅培南、慶大霉素、四環(huán)素、替卡西林、頭孢噻吩、頭孢噻肟、萬古霉素、氧氟沙星等18種藥敏紙片,均購自杭州微生物生物試劑公司;TSB培養(yǎng)基及麥康凱培養(yǎng)基,購自青島高科技工業(yè)園海博生物技術(shù)有限公司。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)菌分離及染色鏡檢

用無菌棉簽采集死亡仔豬腸道內(nèi)容物及糞便,置于EP管中,加入無菌PBS 1 mL,接種于麥康凱平板上,培養(yǎng)18～20 h,挑取圓形、光滑、濕潤(rùn)、邊緣整齊、中等大小的粉紅色小單個(gè)菌落革蘭染色觀察。并接種至TSB液體培養(yǎng)基擴(kuò)大,37 ℃ 180 r/min振蕩培養(yǎng)5～6 h后冷藏保存。菌液加入50%甘油生理鹽水,置于-80 ℃保存。

1.2.2 16S rDNA 鑒定

使用細(xì)菌DNA基因組提取試劑盒提取冷藏保存的菌液的基因組DNA,以基因組DNA為模板,并以實(shí)驗(yàn)室已有的大腸桿菌作為陽性對(duì)照,采用表1中16S rDNA擴(kuò)增引物,用2×Rapid Taq Master Mix經(jīng)35個(gè)循環(huán)擴(kuò)增后,在1.5%瓊脂糖凝膠中電泳后觀察結(jié)果,PCR產(chǎn)物送生工生物工程(上海)股份有限公司,使用擴(kuò)增引物進(jìn)行測(cè)序。

表1 16S rDNA 擴(kuò)增引物

1.2.3 大腸桿菌毒力基因的檢測(cè)

根據(jù)參考文獻(xiàn)[6]推薦的方法,合成對(duì)應(yīng)引物,引物序列、目的片段大小見表2。以1.2.2節(jié)提取的基因組DNA為模板,使用2×Rapid Taq Master Mix 經(jīng)35個(gè)循環(huán)擴(kuò)增后,在1.5%瓊脂糖凝膠中電泳后觀察結(jié)果。

表2 ETEC/EPEC的毒力基因擴(kuò)增引物

1.2.4 藥敏試驗(yàn)

用紙片法(K-B)對(duì)分離菌進(jìn)行藥物敏感性試驗(yàn),用游標(biāo)卡尺測(cè)量各藥敏紙片的抑菌圈直徑,參照美國臨床與實(shí)驗(yàn)室標(biāo)準(zhǔn)化協(xié)會(huì)(Clinical and Laboratory Standards Institute,CLSI)文件(M100-S21)判定結(jié)果。

1.2.5 動(dòng)物回歸試驗(yàn)

1.2.5.1 攻毒菌株制備

經(jīng)過至少兩代復(fù)蘇培養(yǎng)、活力恢復(fù)的目標(biāo)菌株接種到TSB肉湯中,37 ℃、220 r/min培養(yǎng)5～6 h至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期,使用比濁管測(cè)試并調(diào)節(jié)菌液濃度到109CFU/mL,作為攻毒菌液。攻毒菌液現(xiàn)配現(xiàn)用。

1.2.5.2 動(dòng)物試驗(yàn)分組

將2頭仔豬分成2組,攻毒組1頭,編號(hào)為739口服灌喂10 mL 2%碳酸氫鈉溶液,0.5 h后灌服接種攻毒菌液10 mL 109CFU/mL并肌內(nèi)注射1 mL 109CFU/mL。對(duì)照組,編號(hào)為751,口服灌喂10 mL 2%碳酸氫鈉溶液,0.5 h后灌服10 mL PBS溶液并肌內(nèi)注射1 mL PBS。

1.2.5.3 臨床觀察

攻毒后連續(xù)觀察3～5 d,觀察仔豬的排便情況、飲食情況及精神狀態(tài)并記錄仔豬發(fā)病時(shí)間和死亡情況。

1.2.5.4 剖檢觀察

對(duì)死亡仔豬進(jìn)行剖檢,并記錄剖解癥狀,剖檢后對(duì)各組織臟器以及腸道內(nèi)容物進(jìn)行細(xì)菌分離鑒定。

2 結(jié)果

2.1 細(xì)菌分離及染色鏡檢

病死仔豬腸內(nèi)容物接種于麥康凱培養(yǎng)基上,培養(yǎng)18～20 h,可見光滑、濕潤(rùn)、粉紅色小菌落,直徑2～3 mm(圖1a)。挑取單菌落,進(jìn)行革蘭染色,鏡檢可見形態(tài)均一,兩端鈍圓、革蘭氏陰性、中等大小的桿狀細(xì)菌(圖1b),初步鑒定為腸桿菌科的細(xì)菌。

(a)麥康凱平板劃線 (b)革蘭染色鏡檢

2.2 16S rDNA鑒定

對(duì)細(xì)菌DNA進(jìn)行16S rDNA擴(kuò)增,PCR產(chǎn)物經(jīng)1.5%凝膠瓊脂電泳,該菌株在1 500 bp左右處有清晰條帶,與預(yù)期條帶大小相符(圖2)。測(cè)序結(jié)果用GenBank Blastn軟件進(jìn)行相似性比較,結(jié)果發(fā)現(xiàn)分離株16S rDNA與GenBank中公布的大腸桿菌(MN208184)的16S rDNA序列同源性達(dá)到99%以上,確定分離的細(xì)菌為大腸桿菌。

M—DL 2000Marker;1—Y1;2—陽性對(duì)照;3—陰性對(duì)照。

2.3 大腸桿菌毒力基因的檢測(cè)

結(jié)果顯示,在5種常見致病性大腸桿菌相關(guān)毒力基因中,共檢測(cè)出 STa、STb、LT、F4 K88ab這4個(gè)毒力基因(圖3),證明該分離株為致病性大腸桿菌。

M—DL 2000Marker;1、3、5、7、9—分離株; 2、4、6、8、10—陰性對(duì)照。

2.4 藥敏試驗(yàn)

采用藥敏紙片法對(duì)分離到的大腸桿菌進(jìn)行18種常用抗菌藥物的藥敏性檢測(cè),結(jié)果該細(xì)菌對(duì)7種藥物耐藥,對(duì)2種藥物中介,對(duì)9種藥物敏感,具體檢測(cè)結(jié)果如表3所示。

表3 藥敏試驗(yàn)結(jié)果

2.5 動(dòng)物回歸試驗(yàn)

2.5.1 臨床觀察

攻毒后12 h,攻毒組仔豬運(yùn)動(dòng)稍有減少,嗜睡,但刺激反應(yīng)正常,被毛粗糙,采食正常,糞便稀軟但成形,肛周及會(huì)陰部未見糞污;對(duì)照組仔豬一切正常。攻毒后36 h,攻毒組仔豬運(yùn)動(dòng)稍有減少,嗜睡,刺激反應(yīng)減弱,被毛粗糙,采食減少,出現(xiàn)拉稀癥狀,糞便糊狀不成形,無糞水分離現(xiàn)象,肛周糞污明顯;對(duì)照組仔豬一切正常。攻毒后48 h,攻毒組仔豬不活躍,能站立但出現(xiàn)斜倚,瘦弱,食欲明顯減退,出現(xiàn)血便情況,肛周糞污明顯(圖4);對(duì)照組仔豬一切正常。攻毒后62 h,攻毒組仔豬死亡;對(duì)照組仔豬一切正常。

圖4 肛周糞污明顯

2.5.2 剖檢觀察

對(duì)死亡仔豬進(jìn)行剖檢,腹腔內(nèi)有大量腹腔積液;小腸擴(kuò)張、腸壁變薄、嚴(yán)重水腫出血(圖5a),腸系膜淋巴結(jié)腫大、充血(圖5b)。

圖5 感染仔豬的病理解剖病變

2.5.3 組織細(xì)菌分離

分離死亡仔豬病變脾臟及腸內(nèi)容物中的病原菌,染色鏡檢結(jié)果與原分離菌形態(tài)一致。

3 討論

在飼養(yǎng)環(huán)境變化、感染了其他免疫抑制性疾病或腹瀉性疾病后,仔豬易發(fā)生大腸桿菌病。本試驗(yàn)在豬場(chǎng)前期對(duì)常見病毒性腹瀉病原篩查均為陰性的基礎(chǔ)上,根據(jù)發(fā)病死亡仔豬的臨床癥狀,懷疑該豬場(chǎng)豬感染了大腸桿菌。引起腹瀉的大腸桿菌主要類型是產(chǎn)腸毒素型大腸桿菌(Enterotoxigenic E.coli,ETEC)和腸致病型大腸桿菌(Enteropathogenic E.coli,EPEC),ETEC會(huì)引起新生仔豬腹瀉和斷奶仔豬腹瀉,EPEC會(huì)引起斷奶仔豬腹瀉[7]。引起斷奶仔豬腹瀉的ETEC會(huì)攜帶菌毛F4(k88)或者F18并產(chǎn)生黏附素從而更好地定植于腸道,定植后會(huì)在腸道產(chǎn)生一種或多種腸毒素,例如熱穩(wěn)定型毒素a(heat stable toxin a,STa)、熱穩(wěn)定型毒素b(heat stable toxin b,STb)和熱不穩(wěn)定型毒素(heat labile toxin,LT)[8]。本試驗(yàn)通過毒力基因的篩查,確定所感染大腸桿菌含有的毒力基因?yàn)镾Ta、STb、LT、F4 K88ab,該4種毒力基因均是ETEC常攜帶的毒力基因,分離株攜帶全部4種腹瀉毒力基因,證明其毒力強(qiáng),這可能是該豬場(chǎng)出現(xiàn)數(shù)十頭仔豬腹瀉死亡的原因。因此對(duì)分離株進(jìn)行動(dòng)物回歸試驗(yàn),確定其對(duì)仔豬能致腹瀉死亡,判定該豬場(chǎng)仔豬腹瀉死亡的病因?yàn)楦腥竞卸喔篂a毒力基因的ETEC。藥敏試驗(yàn)結(jié)果表明,從該豬場(chǎng)分離出來的菌株對(duì)阿莫西林、氨芐西林、多西環(huán)素、呋喃妥因、磺胺異噁唑、四環(huán)素、萬古霉素等表現(xiàn)出不同程度耐藥,可能是由于該豬場(chǎng)使用抗生素不規(guī)范、不科學(xué)、未輪換用藥,或該豬場(chǎng)所感染的大腸桿菌菌種本身就是耐藥菌。而耐藥性細(xì)菌感染數(shù)量的上升已經(jīng)嚴(yán)重威脅公眾的身體健康,感染的發(fā)病率和致死率均很高[9]。

4 結(jié)論

本試驗(yàn)從四川雅安某豬場(chǎng)腹瀉仔豬腸內(nèi)容物分離獲得了1株產(chǎn)腸毒素型大腸桿菌,確定了其能致仔豬腹瀉死亡,并通過藥敏試驗(yàn)確定其對(duì)氨曲南、丁胺卡那、多粘菌素、恩諾沙星、氟苯尼考、美羅培南、替卡西林、頭孢噻吩、氧氟沙星9中藥物敏感。本試驗(yàn)診斷出了該豬場(chǎng)腹瀉的病因,并為后續(xù)該豬場(chǎng)仔豬腹瀉病用藥防控提供了參考。