陳穎 綜述 文飛球 審校

（1.汕頭大學(xué)醫(yī)學(xué)院深圳兒科臨床學(xué)院，廣東深圳 518034；2.深圳市兒童醫(yī)院，廣東深圳 518034）

惡性腫瘤是目前導(dǎo)致死亡的第二大常見原因，無論是在成人或者是兒童，其5年總體生存率不足70%［1］。其中大部分實(shí)體腫瘤患者可通過手術(shù)治療，并在術(shù)后接受輔助治療得到緩解。但部分患者在接受手術(shù)之后，體內(nèi)仍存在少量殘留的腫瘤細(xì)胞，稱為微小殘留?。╩inimal residual disease,MRD），可影響患者的預(yù)后，并導(dǎo)致腫瘤復(fù)發(fā)。腫瘤監(jiān)測(cè)的傳統(tǒng)方法包括經(jīng)典的生物標(biāo)志物檢測(cè)、影像學(xué)檢查和組織活檢。經(jīng)典的生物標(biāo)志物檢測(cè)具有高靈敏度的特點(diǎn)，但其特異度低，而且一些生物標(biāo)志物的濃度太低，無法通過適當(dāng)?shù)姆椒z測(cè)到。影像學(xué)技術(shù)能協(xié)助腫瘤的診斷，但其有假陽性率高、效率較低、有放射性等缺點(diǎn)。組織活檢是診斷腫瘤的金標(biāo)準(zhǔn)，但相對(duì)創(chuàng)傷較大，并且無法檢測(cè)整個(gè)腫瘤樣本。循環(huán)腫瘤DNA （circulating tumor DNA,ctDNA）克服了傳統(tǒng)檢測(cè)方法的不足，在臨床中的應(yīng)用越來越廣泛?，F(xiàn)對(duì)ctDNA檢測(cè)在實(shí)體腫瘤中的臨床研究進(jìn)展綜述如下。

1 ctDNA的概述

ctDNA是由腫瘤細(xì)胞脫落并釋放進(jìn)入循環(huán)系統(tǒng)的一種具有特征性的腫瘤生物標(biāo)志物，已經(jīng)成為一種有前途的實(shí)體腫瘤縱向評(píng)估的無創(chuàng)生物標(biāo)志物，其檢測(cè)的量化提供了比其他血清學(xué)指標(biāo)更準(zhǔn)確的腫瘤負(fù)荷評(píng)估［2］。ctDNA 是游離DNA（cellfree DNA）的組成部分，它來源于癌變組織中，因此它可以反映腫瘤內(nèi)部及其異質(zhì)性，并能準(zhǔn)確反映任何現(xiàn)有腫瘤中含有癌癥特異性DNA 突變的遺傳譜。通過從血液中提取ctDNA，我們可以更好地識(shí)別和持續(xù)監(jiān)測(cè)腫瘤突變，無創(chuàng)地追蹤腫瘤負(fù)荷的動(dòng)態(tài)變化，并實(shí)時(shí)評(píng)估MRD 和疾病狀態(tài)。與組織活檢相比，連續(xù)監(jiān)測(cè)血漿ctDNA 可以識(shí)別腫瘤核心部位的遺傳變異，動(dòng)態(tài)反映整個(gè)腫瘤的異質(zhì)性，并且具有高靈敏度和特異度、創(chuàng)傷小且無放射性等優(yōu)點(diǎn)［3］。

2 檢測(cè)ctDNA 評(píng)估MDR 在臨床的應(yīng)用及展望

2.1 腫瘤負(fù)荷及治療反應(yīng)評(píng)估

Marsavela 等［4］回顧性分析了108 例黑色素瘤患者的血漿樣本，將有臟器轉(zhuǎn)移與僅有淋巴結(jié)、皮下或肺部病變的患者相比，有臟器轉(zhuǎn)移者ctDNA水平和檢出率更高。其中在19 例皮膚、皮下組織或淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的病例中，47%的患者在進(jìn)展時(shí)可檢測(cè)到ctDNA，而在5例肺轉(zhuǎn)移病例中有40%的患者可檢測(cè)到ctDNA；而且對(duì)治療有反應(yīng)的患者的檢出率（52%）明顯低于對(duì)治療無反應(yīng)且腫瘤大小未縮小的患者（檢出率為78%），表明中晚期腫瘤患者ctDNA 的檢出率顯著高于早期腫瘤患者，這可能與晚期實(shí)體腫瘤體積較大、腫瘤細(xì)胞較多有關(guān)［5］。盡管血液循環(huán)中含有的ctDNA 濃度很低，但ctDNA 濃度與腫瘤體積呈正相關(guān)，其檢測(cè)的濃度水平也反映了腫瘤負(fù)荷的變化［6］。Ruhen 等［7］應(yīng)用聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（polymerase chain reaction,PCR）分析對(duì)12 只橫紋肌肉瘤小鼠模型和28 例橫紋肌肉瘤患兒進(jìn)行研究也證實(shí)了這一點(diǎn)。另外，在同一種腫瘤中，T分期較高或有淋巴結(jié)受累的患者更有可能檢測(cè)到ctDNA［8］。應(yīng)用靶向治療6周后的轉(zhuǎn)移性胃癌患者ctDNA 水平的變化可以預(yù)測(cè)其腫瘤是否緩解，ctDNA 水平降低與預(yù)后改善相關(guān)［9］。有肝轉(zhuǎn)移的結(jié)直腸癌患者術(shù)前化療后的ctDNA水平顯著降低，提示這些患者有更好的腫瘤緩解，說明動(dòng)態(tài)ctDNA 監(jiān)測(cè)有助于調(diào)整術(shù)前治療強(qiáng)度和制定合適的手術(shù)方案，且可有助于預(yù)測(cè)輔助化療有效的患者［10-11］。然而，目前對(duì)于ctDNA檢測(cè)的水平分類和量化標(biāo)準(zhǔn)尚無共識(shí)。未來需要制定ctDNA 水平的量化標(biāo)準(zhǔn)，協(xié)助腫瘤的診斷及分期，以便于實(shí)現(xiàn)實(shí)體腫瘤患者的分級(jí)管理。

2.2 術(shù)后縱向評(píng)估和復(fù)發(fā)風(fēng)險(xiǎn)預(yù)測(cè)

ctDNA 作為生物標(biāo)志物在協(xié)助腫瘤早期診斷、監(jiān)測(cè)治療反應(yīng)和預(yù)測(cè)預(yù)后等方面有潛在的價(jià)值［12］。Chen 等［13］報(bào)道了1 例Ⅰ期胰腺癌患者，利用二代測(cè)序（next generation sequencing, NGS）方法對(duì)該患者血漿中提取到的DNA 進(jìn)行測(cè)序，血漿樣本中未檢測(cè)到的KRAS G12D和TP53 P152這兩種致病性突變，術(shù)后1.5年疾病進(jìn)展到晚期時(shí)，兩種致病突變均呈陽性；而另一例Ⅱ期結(jié)直腸癌患者術(shù)前檢測(cè)到腫瘤的BRAF、NRAS和PIK3CA原發(fā)突變，術(shù)后連續(xù)監(jiān)測(cè)沒有發(fā)現(xiàn)新的突變，盡管病情進(jìn)展到Ⅳ期，患者手術(shù)后3年仍然存活，表明ctDNA陽性不僅可以預(yù)測(cè)預(yù)后，同時(shí)也可以預(yù)測(cè)臨床進(jìn)展情況［14］。Seidel等［2］隨訪了6例尤文氏肉瘤患兒，結(jié)果ctDNA 濃度持續(xù)上升的患兒腫瘤也在進(jìn)展，腫瘤得到緩解的患兒ctDNA 濃度下降甚至檢測(cè)呈陰性。術(shù)后ctDNA 檢測(cè)突變基因陽性與疾病進(jìn)展相關(guān)，這種ctDNA 陽性檢測(cè)結(jié)果明顯早于臨床表現(xiàn)和影像學(xué)檢查進(jìn)展［15］?？v向ctDNA 監(jiān)測(cè)結(jié)合克隆信息可以對(duì)高?；颊哌M(jìn)行分層，有助于識(shí)別易復(fù)發(fā)的高風(fēng)險(xiǎn)患者，并推斷 ctDNA突變的變異起源。最早在術(shù)后1周左右檢測(cè)到血液中ctDNA陽性就可確定為復(fù)發(fā)的高危患者［16］。與ctDNA 陰性的患者相比，在術(shù)后檢測(cè)到ctDNA 保持陽性或由陰性轉(zhuǎn)為陽性的患者，幾乎都會(huì)進(jìn)展或者復(fù)發(fā)［17］。ctDNA陽性患者的疾病復(fù)發(fā)可能性比ctDNA陰性患者高40倍以上［18］。另一方面，治療后檢測(cè)到突變基因表明腫瘤惡性程度較高，這也是復(fù)發(fā)的一個(gè)強(qiáng)大而獨(dú)立的危險(xiǎn)因素。Yue 等［19］對(duì)22 例接受新輔助治療的非小細(xì)胞肺癌患者進(jìn)行術(shù)后連續(xù)監(jiān)測(cè)發(fā)現(xiàn)，術(shù)后3個(gè)月檢測(cè)ctDNA預(yù)測(cè)復(fù)發(fā)的靈敏度已超過80%，特異度可達(dá)90%，故縱向檢測(cè)ctDNA已成為了解術(shù)后患者轉(zhuǎn)歸的重要手段，它也是目前唯一能夠在影像學(xué)檢查或臨床癥狀出現(xiàn)之前評(píng)估患者腫瘤復(fù)發(fā)情況的重要方法。但是術(shù)后1～2 周ctDNA陰性并不意味著患者未來不會(huì)復(fù)發(fā)［20］。

2.3 指導(dǎo)臨床輔助化療應(yīng)用

多種實(shí)體腫瘤類型的各項(xiàng)研究表明，經(jīng)明確的局部治療后，可檢測(cè)到MRD 的患者的復(fù)發(fā)風(fēng)險(xiǎn)極高，而輔助化療可以降低ctDNA 水平［21］。通過ctDNA 檢測(cè)可以識(shí)別根治切除后的MRD，從而識(shí)別出復(fù)發(fā)風(fēng)險(xiǎn)較高的患者，并預(yù)測(cè)輔助治療的療效。Tie 等［22］在96 個(gè)術(shù)后樣本中發(fā)現(xiàn)，21%可檢測(cè)到ctDNA，這些患者無病生存率低；化療后仍可檢測(cè)到ctDNA 時(shí)，其3 年無病生存率為30%，而ctDNA 檢測(cè)陰性者無病生存率可達(dá)77%。Madanat-Harjuoja 等［23］在50 例腎母細(xì)胞瘤患兒中也發(fā)現(xiàn)能檢測(cè)到ctDNA 的患兒長期無病生存率低于未檢測(cè)到ctDNA的患兒，這表明術(shù)后ctDNA的檢測(cè)有助于指導(dǎo)輔助治療決策和減少過度治療以提高無病生存率。在復(fù)發(fā)早期階段無法通過影像學(xué)檢查發(fā)現(xiàn)時(shí)，ctDNA 檢測(cè)陽性可以幫助解決不明確的結(jié)果，為啟動(dòng)化療提供證據(jù)。術(shù)后多時(shí)間點(diǎn)檢測(cè)ctDNA陽性的患者可以考慮進(jìn)行輔助化療，以獲得良好的預(yù)后；相反，ctDNA結(jié)果陰性的患者可減少或放棄不必要的化療，避免相關(guān)的不良反應(yīng)和并發(fā)癥［24］。ctDNA 狀態(tài)可以識(shí)別真正受益于輔助化療治療的患者，以避免無效輔助化療的不良反應(yīng)，改善患者的預(yù)后和生活質(zhì)量［25］。因此，早期行ctDNA 檢測(cè)評(píng)估MRD 狀態(tài)對(duì)在輔助治療開始的標(biāo)準(zhǔn)時(shí)間窗內(nèi)做出治療決策至關(guān)重要。

對(duì)于大多數(shù)實(shí)體腫瘤的治療，部分患者手術(shù)切除腫瘤后繼續(xù)進(jìn)行輔助化療來徹底消滅可能存在的腫瘤細(xì)胞或防止復(fù)發(fā)，手術(shù)治療后，部分患者實(shí)際上已經(jīng)達(dá)到完全緩解狀態(tài)，是否需要再行輔助化療，仍然是臨床上需要解決的重要問題。應(yīng)用可靠的生物標(biāo)志物評(píng)估篩選出適合輔助化療的患者，可以避免過度治療導(dǎo)致的藥物毒性。ctDNA MRD 分析通過提供腫瘤基因組數(shù)據(jù)方式，幫助指導(dǎo)系統(tǒng)性治療的時(shí)間、強(qiáng)度、治療方案和類型，制定無轉(zhuǎn)移性腫瘤更個(gè)性化的臨床決策。另外，ctDNA也可以作為影像學(xué)技術(shù)的補(bǔ)充，判斷輔助化療的效果，幫助選擇非手術(shù)治療的患者，指導(dǎo)有不同復(fù)發(fā)風(fēng)險(xiǎn)的患者選擇不同的治療策略。通過利用MRD 檢測(cè)結(jié)果，可實(shí)現(xiàn)對(duì)臨床腫瘤患者的個(gè)體化輔助治療。

2.4 發(fā)展方向及臨床應(yīng)用前景

盡管早期ctDNA 動(dòng)態(tài)檢測(cè)與預(yù)后和復(fù)發(fā)關(guān)系密切，且在臨床進(jìn)展前或影像學(xué)復(fù)發(fā)前可以發(fā)現(xiàn)耐藥突變或MRD，但根據(jù)這些結(jié)果采取相應(yīng)的措施是否可以改善預(yù)后，還需進(jìn)行隨機(jī)干預(yù)的臨床試驗(yàn)來評(píng)估ctDNA 監(jiān)測(cè)的效果。在目前已發(fā)表的相關(guān)研究中，大多數(shù)樣本量相對(duì)較小，且多為回顧性研究，未來需開展更多的、樣本量更大的前瞻性隊(duì)列研究，并在建立一個(gè)統(tǒng)一的臨床標(biāo)準(zhǔn)下，才能將ctDNA 技術(shù)作為常規(guī)化臨床檢測(cè)。同時(shí)可基于從游離DNA 中提取的腫瘤基因組特征來指導(dǎo)個(gè)性化治療［26］。此外，在NGS 和PCR 技術(shù)的基礎(chǔ)上，國內(nèi)外學(xué)者也在開發(fā)更多新的檢測(cè)方法應(yīng)用到臨床實(shí)踐，隨著檢測(cè)技術(shù)的發(fā)展，ctDNA檢測(cè)工作流程將會(huì)進(jìn)一步被簡化，檢測(cè)成本也將進(jìn)一步降低，檢測(cè)的特異度和靈敏度將會(huì)得到提高。

3 ctDNA的檢測(cè)方法

3.1 NGS

目前有幾種方法用于ctDNA 檢測(cè)，最普遍的是從血漿中提取所有ctDNA 片段的綜合分析，稱之為“液體活檢”，也被稱為基因組測(cè)序。NGS 技術(shù)具有高通量和能夠檢測(cè)幾乎所有類型的突變類型，如SNV、indel、融合和拷貝數(shù)變異（copy number variation, CNV）的優(yōu)點(diǎn)，可用于同時(shí)對(duì)多個(gè)基因和變異進(jìn)行測(cè)序，也可用于鑒定新的基因修飾和分析克隆進(jìn)化［27］。另外，采用“液體活檢”的方法，也避免了傳統(tǒng)影像學(xué)檢查帶來的電離輻射，其靈敏度達(dá)0.01%［28］。但該方法需測(cè)定所有遺傳序列，且需要非常高的測(cè)序深度和復(fù)雜的數(shù)據(jù)分析，因此其工作量較大，花費(fèi)也相對(duì)較高，故而在重復(fù)應(yīng)用時(shí)效率和成本效益較低［29］?；贜GS 并進(jìn)行改良的另一種基因組測(cè)序方法，稱為全基因組重測(cè)序（whole genome sequencing, WGS），該方法可減少常規(guī)NGS 存在的不足，實(shí)現(xiàn)更高的測(cè)序覆蓋率［30］。

3.2 PCR

現(xiàn)常用的另一種方法，是基于定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（quantitative polymerase chain reaction,qPCR）或數(shù)字聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（digital polymerase chain reaction, dPCR）的標(biāo)準(zhǔn)突變檢測(cè)方法，是一種在腫瘤組織中發(fā)現(xiàn)DNA 突變，隨后利用已知突變的信息，在血漿ctDNA 中進(jìn)行分析的方法。qPCR和dPCR都是以等位基因特異性的形式進(jìn)行，每種檢測(cè)方法都設(shè)計(jì)用于檢測(cè)特定序列位點(diǎn)上的特定突變。液滴式dPCR 具有較高的靈敏度和絕對(duì)定量。Link-Lenczowska 等［31］應(yīng)用qPCR 和液滴式dPCR方法在63例骨髓增生性腫瘤患者中進(jìn)行監(jiān)測(cè)和比較，結(jié)果顯示這兩種PCR 方法均能檢測(cè)到JAK2基因V617F 突變，且具有較高的靈敏度，分別為0.12%和0.01%。PCR 可以檢測(cè)特異性基因變化，具有較高的檢測(cè)靈敏度，且實(shí)驗(yàn)設(shè)置簡單，不需要復(fù)雜的信息學(xué)支持，相對(duì)成本較低，很適用于MRD的重復(fù)檢測(cè)［32］。但該方法特異性相對(duì)不足，且在實(shí)際應(yīng)用中，一份血漿樣本只能檢測(cè)到2～3 個(gè)已知突變［29］。且檢測(cè)需要已知的“腫瘤信息”，也不太適用于腫瘤的初始診斷。

3.3 其他新興技術(shù)

為提高ctDNA 檢測(cè)的特異度及靈敏度，一些新興技術(shù)也在研發(fā)之中，如片段長度分析、變性毛細(xì)管電泳檢測(cè)法、基因組和表觀基因組癌癥特征的血漿ctDNA 檢測(cè)、癌癥個(gè)性化分析等也已被用于檢測(cè)ctDNA。Vessies 等［33］對(duì)36例患者的血漿中檢測(cè)到的21 705 個(gè)片段進(jìn)行長度分析，并結(jié)合變異檢測(cè)對(duì)ctDNA 長短進(jìn)行比對(duì)和分析發(fā)現(xiàn)，來源于腫瘤的DNA 片段相對(duì)較短。這種方法提高了檢測(cè)MRD 的靈敏度，同時(shí)也排除了細(xì)胞的正常凋亡、炎癥刺激等向血液釋放細(xì)胞DNA帶來的影響。在腫瘤特異性突變檢測(cè)結(jié)果的基礎(chǔ)上進(jìn)行分析，既增加了ctDNA 檢測(cè)的靈敏度，又排除了非腫瘤源性改變帶來的假陽性?；蚪M和表觀基因組癌癥特征分析是在腫瘤基因未知的情況下通過血漿ctDNA 進(jìn)行MRD 檢測(cè)，該方法有以下幾個(gè)優(yōu)勢(shì)：（1）周轉(zhuǎn)時(shí)間更快；（2）成本相對(duì)較低；（3）可降低檢測(cè)的復(fù)雜性，但其特異度和靈敏度有待更多的臨床研究進(jìn)行系統(tǒng)評(píng)估［34］。

目前用于檢測(cè)MRD 的方法幾乎都依賴于腫瘤組織的初始基因組圖譜，以識(shí)別特定于每個(gè)患者的腫瘤衍生突變，ctDNA 檢測(cè)可以精確評(píng)估這些改變。

4 總結(jié)

ctDNA 檢測(cè)與傳統(tǒng)檢測(cè)方法相比具有無創(chuàng)性、低成本、無輻射等優(yōu)點(diǎn)，并可用于疾病進(jìn)展和預(yù)后評(píng)估。通過監(jiān)測(cè)患者ctDNA 水平的變化，對(duì)患者血漿中腫瘤特異性DNA 突變的檢測(cè)和量化，提供更明智或適當(dāng)?shù)闹委煕Q策，指導(dǎo)臨床輔助化療應(yīng)用，這與傳統(tǒng)的組織活檢和放射掃描相比更有優(yōu)勢(shì)，將成為監(jiān)測(cè)和管理實(shí)體腫瘤患者的重要方法。但現(xiàn)有的檢測(cè)技術(shù)尚未成熟，其特異度及靈敏度仍不能滿足臨床應(yīng)用要求，有待進(jìn)一步提高。

利益沖突聲明：所有作者均聲明不存在利益沖突。