王進(jìn)朝 張根豪( 安陽市人民醫(yī)院 檢驗(yàn)科， 河南 安陽 455000；2 鄭州大學(xué)第一附屬醫(yī)院 輸血科)

鐮狀細(xì)胞病(sickle cell disease， SCD)是1 種β 球蛋白隱性突變導(dǎo)致鐮狀血紅蛋白產(chǎn)生的常染色體疾病，嚴(yán)重時(shí)可危及患者生命[1]。 雖然近年來已有多項(xiàng)臨床試驗(yàn)改善了SCD 患者的臨床癥狀，但治療效果仍不理想[2]。 胎兒血紅蛋白(fetal hemoglobin， HbF)可以通過提高循環(huán)紅細(xì)胞(red blood cells， RBC)的存活率改善SCD 患者的病情，這對(duì)探索新的SCD 治療方法意義重大[3-5]。 血紅蛋白成分在出生后會(huì)從HbF(α2γ2)轉(zhuǎn)變?yōu)槌扇搜t蛋白(adult hemoglobin，HbA， α2β2)，這種現(xiàn)象稱為血紅蛋白轉(zhuǎn)換[6-7]。 HbF 在人血紅蛋白總量中所占比例極少，不到2%。 雖然已有研究報(bào)道高海拔或心肺疾病引起的缺氧可以誘導(dǎo)出生后γ-球蛋白和HbF 產(chǎn)生[8-9]，但相關(guān)機(jī)制仍未清晰。

在本研究中，我們通過對(duì)GSE6236 和GSE17639 數(shù)據(jù)集中臍帶血和成人外周血的網(wǎng)織紅細(xì)胞的轉(zhuǎn)錄組進(jìn)行全面分析，篩選出可能參與血紅蛋白轉(zhuǎn)換的差異基因，并在GSE35102 數(shù)據(jù)集、臨床成人外周血和臍帶血標(biāo)本中進(jìn)行驗(yàn)證，進(jìn)而探索血紅蛋白轉(zhuǎn)換過程中的關(guān)鍵調(diào)控基因，為SCD患者的靶向治療提供新的思路。

1 材料與方法

1.1 公共數(shù)據(jù)集下載和差異基因分析 從基因表達(dá)綜合數(shù)據(jù)庫(gene expression omnibus， GEO)下載GSE6236 (14 例臍帶血，14 例成人外周血)、GSE17639 (6 例臍帶血，6 例成人外周血)和GSE35102 中網(wǎng)織紅細(xì)胞的轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)并使用Anno-Probe 包進(jìn)行基因注釋。 隨后以｜logFC｜≥1.5 且P值＜0.05 為閾值篩選差異基因。 GSE6236 和GSE17639 的轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)合并后使用Limma 包的removeBatchEffect 函數(shù)去除批次效應(yīng)。

1.2 加權(quán)基因共表達(dá)網(wǎng)絡(luò)分析 通過聚類樹分析剔除離群值標(biāo)本后，使用加權(quán)基因共表達(dá)網(wǎng)絡(luò)分析(weighted gene coexpression network analysis， WGCNA)將基因聚類成不同顏色的模塊，并分析模塊與網(wǎng)織紅細(xì)胞之間的相關(guān)性。 相關(guān)性系數(shù)＞0.5 且P＜0.001 的模塊被認(rèn)為是網(wǎng)織紅細(xì)胞相關(guān)模塊。

1.3 差異基因在血紅蛋白轉(zhuǎn)變過程中的表達(dá)量變化GSE35102 數(shù)據(jù)集是1 個(gè)將人原代紅系祖細(xì)胞培養(yǎng)后進(jìn)行基因表達(dá)譜分析的芯片數(shù)據(jù)。 研究人員將原代紅系祖細(xì)胞在含有青霉素(100 U/mL)、鏈霉素(0.1 mg/mL)和30%胎牛血清的α-MEM 培養(yǎng)基內(nèi)進(jìn)行培養(yǎng)。 d0 在培養(yǎng)瓶內(nèi)添加干細(xì)胞因子(50 ng/mL)，白介素3(10 ng/mL)和促紅細(xì)胞生成素(4 U/mL)等細(xì)胞因子。 分別在培養(yǎng)后的d7、14、21 和28 收集細(xì)胞并進(jìn)行微陣列分析。 我們按照1、2、3 和4 周的時(shí)間間隔，將GSE35102 數(shù)據(jù)集中的標(biāo)本分為4 組，用于驗(yàn)證差異基因在血紅蛋白轉(zhuǎn)變過程中的表達(dá)量變化。

1.4 實(shí)時(shí)定量PCR 檢測(cè)差異基因在臍帶血和成人外周血網(wǎng)織紅細(xì)胞中的表達(dá)量 本研究獲得了安陽市人民醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)的批準(zhǔn)(KS-2023-05-30)。 我們于2023 年6 月1 日—7月10 日分別從30 名成年健康志愿者和30 名產(chǎn)婦身上采集5mL外周血或臍帶血。 如前所述[10-11]，通過離心和過濾去除血漿、血小板和白細(xì)胞，獲得富集的網(wǎng)織細(xì)胞。 使用TRIzol 試劑(Invitrogen，15596026)從富集的網(wǎng)織紅細(xì)胞中分離總RNA，隨后使用逆轉(zhuǎn)錄試劑將RNA 逆轉(zhuǎn)錄成cDNA(上海生工，B532441)，最后按照說明書在Applied BiosystemsTM7500 儀器上進(jìn)行實(shí)時(shí)PCR 反應(yīng)。 CDC42 基因的引物序列為:上游CCATCGGAATATGTACCGACTG，下游CTCAGCGGTCGTAATCTGTCA； 內(nèi)參基因β-ACTIN 的引物序列為:上游CGTGGGCCGCCCTAGGCACCA，下游TTGGCTTAGGGTTCAGGGGGG。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 使用R.4.2 軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析；使用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)和Wilcoxon 秩合檢驗(yàn)分析定量數(shù)據(jù)。 當(dāng)P＜0.05時(shí)認(rèn)為結(jié)果具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 差異基因篩選 如圖1A 所示，在3 個(gè)數(shù)據(jù)集中，我們分別得到184，92，123 個(gè)差異基因(均｜logFC｜≥1.5 且P＜0.05)。這些差異基因在臍帶血和成人外周血網(wǎng)織紅細(xì)胞中的表達(dá)如圖1B 所示。 其中，12 個(gè)基因被認(rèn)為是共同差異基因(圖1C)。

圖1 差異基因

2.2 數(shù)據(jù)集合并與批次效應(yīng)去除 為了進(jìn)一步分析臍帶血與成人外周血中網(wǎng)織紅細(xì)胞的轉(zhuǎn)錄組差異，我們將3 個(gè)數(shù)據(jù)集進(jìn)行了合并。 合并后，共得到34 例臍帶血網(wǎng)織紅細(xì)胞標(biāo)本和34 例成人外周血網(wǎng)織紅細(xì)胞標(biāo)本。 如圖2A 所示，我們發(fā)現(xiàn)合并后的數(shù)據(jù)集具有明顯的批次效應(yīng)。 隨后，我們使用Limma 包的removeBatchEffect 函數(shù)去除批次效應(yīng)(圖2B)。

圖2 批次效應(yīng)去除

2.3 WGCNA 分析結(jié)果 我們首先對(duì)68 例標(biāo)本進(jìn)行聚類樹分析，發(fā)現(xiàn)7 個(gè)離群值標(biāo)本(圖3A)。 將離群值標(biāo)本剔除后，WGCNA 將基因聚類成藍(lán)色和孔雀綠2 個(gè)不同顏色的模塊(圖3B)。 藍(lán)色模塊與網(wǎng)織紅細(xì)胞相關(guān)性最大(相關(guān)系數(shù)＝0.76，P＜0.001)，被認(rèn)為是網(wǎng)織紅細(xì)胞相關(guān)模塊(圖3C)。 藍(lán)色模塊共包含了718 個(gè)基因。

圖3 WGCNA 分析

2.4CDC42 基因在臍帶血和成人外周血網(wǎng)織紅細(xì)胞中的差異性表達(dá) 如圖4A 所示，我們將差異基因與藍(lán)色模塊的基因取交集后，共得到5 個(gè)基因。 然而在合并的數(shù)據(jù)集中，只有CDC42 基因的表達(dá)量具有差異性(t＝3.776，P＜0.001，圖4B)。CDC42 基因可以很好的區(qū)分合并集中臍帶血和成人外周血中的網(wǎng)織紅細(xì)胞，曲線下面積(area under the curve， AUC)為0.747(圖4C)。

圖4 CDC42 基因在合并數(shù)據(jù)集中的表達(dá)

2.5CDC42 基因在血紅蛋白轉(zhuǎn)變過程中的表達(dá)量變化 如圖5A 所示，原代紅系祖細(xì)胞培養(yǎng)后γ-球蛋白含量逐漸降低，而β-球蛋白含量逐漸升高，且二者在培養(yǎng)后第3 周左右出現(xiàn)了交集，表明此時(shí)發(fā)生了HbF/HbA 血紅蛋白轉(zhuǎn)變。 而CDC42 基因的表達(dá)量在培養(yǎng)后第2 周和第3 周的細(xì)胞中出現(xiàn)差異性改變(Z＝-2.908，P＜0.01，圖5B)，證明CDC42 基因可能參與了HbF/HbA 血紅蛋白轉(zhuǎn)變的進(jìn)程。

圖5 CDC42 基因表達(dá)量在血紅蛋白轉(zhuǎn)變過程中的變化

2.6CDC42 基因在臍帶血和成人外周血網(wǎng)織紅細(xì)胞中表達(dá)量的差異分析 如圖6A 所示，與臍帶血中的網(wǎng)織紅細(xì)胞相比(4.33±1.21)，成人網(wǎng)織紅細(xì)胞(2.47±0.85)中CDC42 基因的表達(dá)量顯著降低(t＝7.824，P＜0.001)，且CDC42 基因可以很好的區(qū)分臍帶血和成人外周血中的網(wǎng)織紅細(xì)胞，曲線下面積為0.892(圖6B)。

圖6 CDC42 基因在臍帶血和成人外周血網(wǎng)織紅細(xì)胞中表達(dá)量分析

3 討論

SCD 是1 種血紅蛋白β-珠蛋白鏈發(fā)生遺傳性突變的血紅蛋白病，其特征是慢性溶血性貧血、嚴(yán)重的急慢性疼痛以及伴隨終身的末端器官損傷。 SCD 與早期死亡率密切相關(guān)[12]。 早期診斷、預(yù)防并發(fā)癥和處理末端器官損傷等對(duì)癥治療對(duì)于改善SCD 的預(yù)后意義重大。 盡管美國食品和藥物管理局已經(jīng)批準(zhǔn)了除羥基脲以外的3 種治療SCD 的藥物(Lglutamine， crizanlizumab 和voxelotor)，但它們?nèi)匀徊荒軓母旧现斡鶶CD[2]。 因此，臨床工作中迫切地需要1 種更有效的方法改善SCD 患者的預(yù)后。

在本次研究中，我們通過對(duì)GSE6236 和GSE17639 數(shù)據(jù)集中臍帶血和成人外周血中網(wǎng)織紅細(xì)胞的轉(zhuǎn)錄組進(jìn)行全面分析，篩選出5 個(gè)可能參與血紅蛋白轉(zhuǎn)換的差異基因。 雖然只有CDC42 基因在去除批次效應(yīng)的合并數(shù)據(jù)集中有顯著表達(dá)差異，但其可以很好地區(qū)分臍帶血和成人外周血中的網(wǎng)織紅細(xì)胞(AUC＝0.747)。 隨后，我們?cè)贕SE35102 數(shù)據(jù)集中進(jìn)行驗(yàn)證。 GSE35102 數(shù)據(jù)集對(duì)原代紅系祖細(xì)胞進(jìn)行了全局基因表達(dá)譜分析，以探索在整個(gè)體外紅系分化過程中參與γ/β-球蛋白轉(zhuǎn)換的基因表達(dá)譜。 我們觀察到原代紅系祖細(xì)胞培養(yǎng)后γ-球蛋白含量逐漸降低，而β-球蛋白含量逐漸升高，且二者在培養(yǎng)后第3 周左右出現(xiàn)了交集，表明此時(shí)發(fā)生了HbF/HbA 血紅蛋白轉(zhuǎn)變。 而CDC42 基因的表達(dá)量在培養(yǎng)后第2 周和第3 周出現(xiàn)差異性改變，表明CDC42 基因可能參與了HbF/HbA 血紅蛋白轉(zhuǎn)變的進(jìn)程。 至于其調(diào)節(jié)血紅蛋白轉(zhuǎn)變進(jìn)程的具體分子機(jī)制，需要在未來的工作中進(jìn)一步研究。

CDC42 基因是鳥苷三磷酸酶(GTPase)家族的1 個(gè)重要成員，參與調(diào)節(jié)細(xì)胞受到細(xì)胞外刺激后胞內(nèi)三磷酸鳥苷(GTP)和二磷酸鳥苷的活性狀態(tài)。CDC42 基因不但參與調(diào)節(jié)造血干細(xì)胞的粘附、遷移、歸巢以及細(xì)胞周期等生物進(jìn)程，在紅細(xì)胞的最終分化過程中也起著至關(guān)重要的作用[13]。CDC42 基因缺陷小鼠會(huì)出現(xiàn)致命的骨髓增生性疾病，主要表現(xiàn)為髓系和紅系發(fā)育抑制，以及顯著的白細(xì)胞增多伴中性粒細(xì)胞增多[14]。 本研究發(fā)現(xiàn)CDC42 基因在臍帶血網(wǎng)織紅細(xì)胞中的表達(dá)顯著高于成人外周血網(wǎng)織紅細(xì)胞中的表達(dá)，且在原代紅系祖細(xì)胞的γ/β-球蛋白轉(zhuǎn)換過程中也存在差異性改變。HbF/HbA 血紅蛋白的轉(zhuǎn)變通常發(fā)生在嬰兒出生后幾個(gè)月內(nèi)。 HbF 的生成增加可顯著改善成人SCD 患者的臨床癥狀。 目前通過靶向HbF/HbA 血紅蛋白轉(zhuǎn)變治療SCD 患者的基因療法主要包括2 種，1 種是通過慢病毒載體向紅細(xì)胞內(nèi)添加正常的β-球蛋白編碼序列以增加HbF 的表達(dá)[15]，另1種是通過Cas9 特異性敲除紅細(xì)胞內(nèi)的BCL11A 以重新激活γ-球蛋白基因[16-17]。 但這2 種方法的終末有效性和安全性仍值得商榷[18]。 考慮到CDC42 基因信號(hào)傳導(dǎo)貫穿整個(gè)紅細(xì)胞發(fā)育成熟的進(jìn)程中[14]，且CDC42 基因可能參與了HbF/HbA 血紅蛋白轉(zhuǎn)變進(jìn)程，我們或許可以將CDC42 基因作為1個(gè)潛在的治療靶點(diǎn)應(yīng)用于SCD 患者的基因治療。

綜上所述，我們通過對(duì)臍帶血和成人外周血中網(wǎng)織紅細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組的分析，發(fā)現(xiàn)CDC42 基因可能參與了HbF/HbA 血紅蛋白轉(zhuǎn)變的進(jìn)程，可作為未來SCD 患者的潛在治療靶點(diǎn)。在明確CDC42 基因參與HbF/HbA 血紅蛋白轉(zhuǎn)變進(jìn)程的具體分子機(jī)制后，通過質(zhì)?；蚵《巨D(zhuǎn)染的方式在網(wǎng)織紅細(xì)胞內(nèi)過表達(dá)CDC42 基因從而促進(jìn)紅細(xì)胞內(nèi)HbF 表達(dá)增加，或許可以作為未來SCD 患者靶向HbF/HbA 血紅蛋白轉(zhuǎn)變的潛在治療靶點(diǎn)，為SCD 的基因療法開辟1 種新的方向。

利益沖突:所有作者均聲明不存在利益沖突。