甘玉佳，歐全宏，鄭鈞文，周湘萍，劉 剛*，時(shí)有明

（1.云南師范大學(xué)物理與電子信息學(xué)院，云南 昆明 650500；2.曲靖師范學(xué)院物理與電子工程學(xué)院，云南 曲靖 655011）

種子是農(nóng)業(yè)生產(chǎn)的基本生產(chǎn)資料，種子活力是種子質(zhì)量的重要指標(biāo)，高活力種子具有更大的生長潛能和優(yōu)勢(shì)［1］。種子老化是指種子活力自然衰退，隨貯藏時(shí)間的延長而發(fā)生的復(fù)雜生理生化變化［2］。種子老化很大程度上取決于種子貯藏的環(huán)境條件，貯藏條件惡劣將加速種子衰老和劣變［3］。傳統(tǒng)的種子老化檢測(cè)方法耗時(shí)較長、會(huì)對(duì)種子造成損傷、需要專業(yè)人員操作［4］，因此快速、無損、操作簡單的測(cè)定方法成為當(dāng)前種子老化檢測(cè)發(fā)展的重要趨勢(shì)。紅外光譜技術(shù)在農(nóng)作物種子檢測(cè)中具有簡單、快速、靈敏、綠色、成本低及操作簡便等優(yōu)點(diǎn)［5］。劉杰等（2021）［6］利用傅里葉變換紅外光譜（FTIR）對(duì)人工加速老化水稻種子進(jìn)行檢測(cè)，可以快速、有效區(qū)分不同老化程度的水稻種子。Andrade G C 等（2020）［7］利用衰減全反射紅外光譜（ATR-FTIR）對(duì)2 個(gè)玉米雜交品種加速老化過程中生化變化進(jìn)行識(shí)別，并建立評(píng)估活力的模型。Czekus B 等（2019）［8］通過傅里葉變換紅外光譜技術(shù)和拉曼光譜技術(shù)研究2 個(gè)品種藜麥種子中的有機(jī)物差異。田雪等（2022）［9］利用FTIR 法結(jié)合曲線擬合和主成分分析對(duì)3 種小米及其9 個(gè)不同產(chǎn)區(qū)進(jìn)行了鑒別和分類。Fioresi D B等（2021）［10］利用紅外光譜對(duì)阿拉比卡和羅布斯塔咖啡種子之間的差異進(jìn)行了研究，證明了兩者的紅外光譜存在差異。

咖啡是世界上交易最廣泛的商品之一，特別是阿拉比卡咖啡豆（俗稱小?？Х龋┮蚱漤樆?、溫和且醇厚的風(fēng)味受到消費(fèi)者的喜愛，占全球咖啡種植面積的70%以上。云南省主要咖啡種植區(qū)域?yàn)楸Ｉ绞?、普洱市、臨滄市、德宏傣族景頗族自治州等地。保山市隆陽區(qū)于1952年開始大規(guī)模種植小粒咖啡，優(yōu)異的氣候條件、適宜的土壤環(huán)境及充足的日照，使該地產(chǎn)出的小?？Х榷蛊焚|(zhì)極佳，在國際上被稱為“中國云南小?？Х取?，是我國極少數(shù)被世界公認(rèn)的農(nóng)特產(chǎn)品之一［11］。國內(nèi)咖啡市場(chǎng)普遍存在咖農(nóng)盲目種植的現(xiàn)象，嚴(yán)重削弱了咖啡產(chǎn)業(yè)的市場(chǎng)競(jìng)爭力，阻礙了咖啡產(chǎn)業(yè)的可持續(xù)發(fā)展［12］?？Х确N子在常溫下最多能儲(chǔ)存2～6 個(gè)月，之后活力會(huì)迅速喪失，影響種子田間健植率和植株生產(chǎn)性能［13］。目前，國內(nèi)外對(duì)咖啡種子的研究更多是對(duì)商業(yè)咖啡品質(zhì)評(píng)價(jià)、咖啡中化學(xué)成分檢測(cè)和不同基因型、品種及產(chǎn)地鑒別等，很少有針對(duì)咖啡種子老化測(cè)定的研究。

本研究采用傅里葉變換紅外光譜（FTIR）對(duì)不同老化程度的小?？Х确N子進(jìn)行檢測(cè)，獲得其紅外指紋圖譜，結(jié)合曲線擬合、主成分分析和系統(tǒng)聚類分析對(duì)不同老化程度的小粒咖啡種子進(jìn)行分析，建立小粒咖啡種子快速、無損的老化檢測(cè)方法，對(duì)優(yōu)質(zhì)小?？Х鹊霓r(nóng)業(yè)生產(chǎn)和種質(zhì)資源保護(hù)有重要的意義。

1 材料與方法

1.1 材料

本研究試驗(yàn)所用材料為小粒種咖啡（Coffea arabicaL.）種子，于2022年3月收獲，采自云南省保山市潞江鎮(zhèn)新寨村（25°03′N，109°34′E），平均海拔1 300 m。種子含水量約7%（用鹵素水分儀測(cè)得，儀器為廈門米德電子科技有限公司生產(chǎn)，型號(hào)：QL-100B），千粒重為172.62 g。

1.2 方法

1.2.1 人工加速老化

將咖啡果脫殼后，用水洗凈表面的膠質(zhì)體，自然晾曬4 d，挑選顆粒飽滿的種子進(jìn)行處理。參照殷勤等（2016）［13］的方法，對(duì)咖啡種子進(jìn)行人工加速老化，采用杭州綠博儀器有限公司生產(chǎn)的LH-150S種子老化箱，設(shè)置老化箱恒定溫度為40 ℃，相對(duì)濕度為98%。老化時(shí)間分別為0、2、4、6、8 d，老化完成后將種子在室溫下晾3～4 d，確認(rèn)種子含水量降至原狀態(tài)后進(jìn)行光譜檢測(cè)。

1.2.2 FTIR測(cè)量

將咖啡種子的羊皮紙殼剝掉，同時(shí)去除干凈生咖啡豆的銀皮，用研磨機(jī)研磨成粉末，并與適量KBr粉末混合均勻進(jìn)行壓片，以純溴化鉀片為背景，采集咖啡樣品的紅外光譜。采用的紅外光譜儀是Perkins Elmer 公司Frontier 型傅里葉變換紅外光譜儀，配有氘代硫酸三甘肽晶體（DTGS）探測(cè)器。光譜采集范圍為4 000～400 cm-1，16 次掃描，分辨率為4 cm-1，以未老化種子為對(duì)照，測(cè)20 個(gè)樣品，其他老化時(shí)間的種子各測(cè)10 個(gè)樣品，3 次重復(fù)測(cè)量取平均值，光譜采集使用Spectrum 10.03 軟件。

1.2.3 數(shù)據(jù)處理

采用OMNIC 8.2 軟件對(duì)所得原始光譜進(jìn)行預(yù)處理，包括基線校正、13 點(diǎn)平滑、縱坐標(biāo)歸一化和導(dǎo)數(shù)譜圖等；用Origin 2018 軟件進(jìn)行主成分分析（PCA）和峰值擬合分析，用SPSS 24 軟件進(jìn)行系統(tǒng)聚類分析（HCA）。

建立PCA 模型時(shí)，采用1 750～1 500 cm-1范圍的紅外光譜數(shù)據(jù)，HCA 模型選取1 800～800 cm-1范圍的數(shù)據(jù)。

2 結(jié)果與討論

2.1 傅里葉變換紅外光譜分析

由圖1 可以看出，不同老化天數(shù)的咖啡種子的原始紅外光譜峰整體相似，種子在老化的過程中差異不大。

表1 列出了不同老化天數(shù)的咖啡種子的主要吸收峰及歸屬，可以看出，小粒咖啡紅外光譜峰主要由蛋白質(zhì)、脂質(zhì)和多糖峰組成。

表1 人工老化小?？Х鹊募t外譜峰位置及其歸屬

圖2 為人工老化小?？Х确N子的傅里葉變換紅外光譜峰強(qiáng)比。圖2（a）中所有特征峰強(qiáng)度比A2926/A3010、A2855/A3010、A1745/A3010、A1461/A3010、A1380/A3010的值整體隨著人工老化時(shí)間的增加顯示升高趨勢(shì)，分別由老化前的2.50、1.66、0.93、0.97、1.06 升高到老化8 d 后的3.36、2.04、1.38、1.52、1.66，說明小?？Х戎兄|(zhì)的相對(duì)含量可能隨著老化時(shí)間的增加而產(chǎn)生正相關(guān)變化。圖2（b）中A1118/A3010、A1055/A3010顯示出相同的變化趨勢(shì)，先增強(qiáng)后減弱然后明顯增強(qiáng)，分別由未老化時(shí)的1.16、1.25 升高到老化8 d 的2.46、2.88；A1646/A3010的特征峰強(qiáng)度隨著老化時(shí)間先降低后增強(qiáng)，由未老化時(shí)的1.57 逐漸降為老化6 d 的1.25，隨后老化8 d 升高到2.00，表明蛋白質(zhì)和多糖在老化的過程中也產(chǎn)生了變化。

圖2 人工老化小?？Х确N子的紅外光譜峰強(qiáng)比

2.2 二階導(dǎo)數(shù)紅外光譜

圖3（a）、圖3（b）分別為人工老化小?？Х确N子在蛋白質(zhì)和脂肪（1 800～1 600 cm-1范圍）、多糖（1 200～950 cm-1范圍）特征區(qū)域的二階導(dǎo)數(shù)紅外光譜，在這2 個(gè)區(qū)域，人工老化小?？Х任辗鍞?shù)量隨老化天數(shù)增加而減少。其中1 800～1 700 cm-1區(qū)域的吸收峰主要由脂質(zhì)中C=O 伸縮振動(dòng)引起，所有人工老化樣品在該區(qū)域均出現(xiàn)2 個(gè)特征峰，分別在1 745 cm-1和1 711 cm-1附近，其中1 745 cm-1為脂類物質(zhì)最典型的特征吸收峰。

1 700～1600 cm-1區(qū)域主要是蛋白質(zhì)酰胺Ⅰ帶，受C=O 伸縮振動(dòng)的影響。不同老化小?？Х确N子吸收峰位置在該區(qū)域出現(xiàn)了差異，老化2 d 和4 d的種子在1 696 cm-1附近出現(xiàn)了吸收峰，而只有老化8 d 的小?？Х确N子在1 642 cm-1附近的峰消失，說明該峰與蛋白質(zhì)酰胺Ⅰ帶有關(guān)。其他共有的吸收峰出現(xiàn)在1 658、1 609 cm-1附近，1 700～1 660 cm-1范圍內(nèi)的吸收峰包含β-轉(zhuǎn)角結(jié)構(gòu)，1 660～1 650 cm-1范圍內(nèi)的吸收峰為α-螺旋結(jié)構(gòu)，1 650～1 640 cm-1范圍內(nèi)吸收峰為無序結(jié)構(gòu)，1 640～1 600 cm-1范圍內(nèi)包含β-折疊結(jié)構(gòu)，以上結(jié)構(gòu)均屬于蛋白質(zhì)二階結(jié)構(gòu)。

1 200～950cm-1區(qū)域特征峰主要受歸屬為多糖和糖苷鍵C-O 基團(tuán)、C-O-C 鍵的伸縮振動(dòng)、C-H 鍵和C-OH 鍵的彎曲振動(dòng)的影響［22］。該區(qū)域人工老化8 d的樣品差異明顯，老化0、2、4 d 的種子都在多糖區(qū)域內(nèi)出現(xiàn)了1 182、1 159、1 119、1 098、1 079、1 055、1 030、991、959 cm-1附近的9 個(gè)峰，老化6 d 的種子缺少1 182 cm-1附近吸收峰，而老化8d 的種子只有1 163、1 114、1 083、1 038、991、958 cm-1這6 個(gè)峰。隨著老化時(shí)間的增加，除老化8 d 外，其他不同老化時(shí)間的小?？Х确N子在1 159、1 098 cm-1附近的吸收峰向高波數(shù)位置移動(dòng)，在1 119、1 030、991、959 cm-1附近的吸收峰向低波數(shù)位置移動(dòng)，這些峰位置發(fā)生變化可能與多糖的結(jié)構(gòu)或含量變化有關(guān)。

2.3 曲線擬合分析

根據(jù)不同老化時(shí)間小?？Х确N子在該區(qū)域的二階導(dǎo)數(shù)紅外光譜確定出現(xiàn)的吸收峰位置和個(gè)數(shù)，對(duì)其原始紅外光譜1 770～1 500 cm-1范圍進(jìn)行曲線擬合，經(jīng)基線校正后采取高斯分布進(jìn)行分解，得到的擬合結(jié)果R2值均在0.999 以上，每個(gè)老化時(shí)間下的各種樣品光譜均進(jìn)行了8 次擬合。擬合結(jié)果如圖4所示，計(jì)算出特征峰峰面積百分比的平均值，統(tǒng)計(jì)結(jié)果見表2 和圖5。

表2 人工老化小粒咖啡種子在1 770～1 500 cm-1范圍內(nèi)曲線擬合子峰的面積百分比

圖4 人工老化小?？Х确N子紅外光譜在1 770～1 500 cm-1范圍的曲線擬合光譜

圖5 為不同老化時(shí)間下小粒咖啡種子脂質(zhì)特征峰（1 740 cm-1）、蛋白質(zhì)特征峰（1 648、1 586 cm-1）和咖啡因特征峰（1 608 cm-1）的峰面積百分比。結(jié)果顯示，老化0 d 的小?？Х确N子1 740 cm-1處特征峰的面積百分比為5.22%，老化2～6 d 逐漸增加到14.58%，老化8 d 又減少到6.95%。從圖5 中子峰面積百分比的變化可以看出，蛋白質(zhì)含量最高，1 648 cm-1處的特征峰峰面積百分比在老化0 d時(shí)為47.83%，老化6 d 后逐漸減小到28.38%，隨后急劇增加到56.48%。1 586 cm-1處的峰面積百分比在老化0 d 時(shí)為7.92%，老化6 d 后降低到1.21%，老化8 d 后增加到9.41%，2 個(gè)蛋白質(zhì)特征峰隨老化時(shí)間的峰面積變化趨勢(shì)一致，該趨勢(shì)與原始光譜中蛋白質(zhì)特征峰峰強(qiáng)比變化趨勢(shì)一致，而且蛋白質(zhì)含量最高，說明蛋白質(zhì)是小?？Х确N子的重要組成成分。1 608 cm-1處峰面積百分比從老化0 d的6.75%增加到老化4 d 的18.69%，老化6～8 d減小到3.18%。

2.4 主成分分析

為了分析數(shù)據(jù)中隱含的結(jié)構(gòu)信息，了解不同老化時(shí)間對(duì)小粒咖啡種子引起的差異，選用20 個(gè)未老化小粒咖啡種子和其他老化處理后各10 個(gè)樣本光譜，對(duì)不同老化程度的小粒咖啡種子在1 750～1 500 cm-1區(qū)域的傅里葉變換紅外光譜進(jìn)行主成分分析。

由圖6 可知，前2 個(gè)主成分累計(jì)貢獻(xiàn)率達(dá)99.3%，其中PC1 占總貢獻(xiàn)率的93.9%，PC2 占總貢獻(xiàn)率的5.4%，這代表了前2 個(gè)主成分可以有效區(qū)分不同老化程度的小?？Х确N子。根據(jù)圖中的分類情況可以看出，不同老化時(shí)間處理下的小?？Х确N子顯示出了清晰的聚類，每個(gè)時(shí)間的樣品都準(zhǔn)確分為一類，老化8 d 的種子與未老化種子最接近，老化6 d的樣品與未老化樣品離得最遠(yuǎn)。

圖7（a）、（b）分別為PC1 和PC2 的載荷圖。PC載荷圖表示不同變量的相關(guān)權(quán)重，顯示了一些對(duì)分類具有高度相關(guān)性和貢獻(xiàn)度的特征峰。在PC1 載荷圖中，1 750～1 500 cm-1范圍出現(xiàn)的峰都為正峰，在1 684、1 548 cm-1左右出現(xiàn)較強(qiáng)的峰，說明這些峰與PC1 具有正相關(guān)性。在PC2 載荷圖中，1 750～1 684 cm-1和1 545～1 500 cm-1范圍內(nèi)出現(xiàn)正峰，說明這些峰與PC2 具有正相關(guān)性，1 684～1 545 cm-1范圍內(nèi)為負(fù)峰，該區(qū)域的吸收峰與PC2 有負(fù)相關(guān)關(guān)系，其中最強(qiáng)峰出現(xiàn)在1 589 cm-1附近。

以上結(jié)果表明，不同老化時(shí)間下的小?？Х确N子間存在差異，2 個(gè)主成分中較強(qiáng)的峰都?xì)w屬于蛋白質(zhì)吸收峰，由此推斷，小?？Х戎械鞍踪|(zhì)含量的差異是主成分判別中的主要依據(jù)，在PC1 和PC2 的不同程度老化分類中承擔(dān)主要貢獻(xiàn)，印證了曲線擬合中蛋白質(zhì)是小?？Х戎兄匾M成成分的結(jié)果。

2.5 系統(tǒng)聚類分析

圖8 為人工老化小粒咖啡種子在1 800～800 cm-1范圍內(nèi)紅外光譜的系統(tǒng)聚類分析結(jié)果。用SPSS 24對(duì)人工老化小粒咖啡種子樣品（未老化以及老化2、4、6、8 d 各取5 個(gè)，共25 個(gè)光譜樣本）在1 800～800 cm-1范圍內(nèi)進(jìn)行聚類分析，聚類方法為組間連接，區(qū)間選擇歐氏距離。未老化小粒咖啡種子聚為一類且與其他樣品的相距最遠(yuǎn)，距離為25，老化4 d小?？Х确N子單獨(dú)聚為一類；老化2、6、8 d 小?？Х确N子各自聚為一類，并聚集在一起；老化2 d 和老化6 d 小?？Х确N子距離最近，說明這兩種樣品在成分或物質(zhì)含量上最相似。系統(tǒng)聚類分析和主成分分析均能對(duì)不同老化時(shí)間小?？Х确N子進(jìn)行較好的分類，表明多元統(tǒng)計(jì)分析可以用來分析人工老化小粒咖啡種子。

圖8 人工老化小?？Х确N子紅外光譜的系統(tǒng)聚類分析

3 結(jié)論

本研究利用傅里葉變換紅外光譜法、二階導(dǎo)數(shù)紅外光譜、曲線擬合分析結(jié)合多元統(tǒng)計(jì)學(xué)方法對(duì)人工老化小?？Х确N子進(jìn)行分析。光譜結(jié)果顯示，人工老化小?？Х确N子的紅外光譜主要物質(zhì)的吸收峰整體相似。根據(jù)紅外光譜的吸收峰強(qiáng)度可得，隨著老化時(shí)間的增加，脂類物質(zhì)特征峰峰強(qiáng)比明顯增加，糖類物質(zhì)特征峰峰強(qiáng)比表現(xiàn)為先增后減再增，而蛋白質(zhì)特征峰峰強(qiáng)比變化趨勢(shì)為先減小后增加。二階導(dǎo)數(shù)紅外光譜顯示，人工老化小?？Х确N子在1 800～1 600 cm-1和1 200～950 cm-1范圍內(nèi)的峰數(shù)量隨著老化時(shí)間的增加而減少，部分吸收峰隨老化時(shí)間發(fā)生峰移。曲線擬合在1 770～1 500 cm-1范圍內(nèi)進(jìn)行分析，不同老化時(shí)間的小?？Х确N子的子峰位置和面積百分比存在差異，人工老化小?？Х确N子中脂質(zhì)和咖啡因所對(duì)應(yīng)峰的相對(duì)含量呈現(xiàn)先增后減趨勢(shì)，蛋白質(zhì)所對(duì)應(yīng)峰的相對(duì)含量呈現(xiàn)先減后增趨勢(shì)，且面積百分比最大。多元統(tǒng)計(jì)方法顯示，在1 750～1 500 cm-1范圍內(nèi)的主成分分析和在1 800～800 cm-1范圍內(nèi)的系統(tǒng)聚類分析均能實(shí)現(xiàn)5 個(gè)不同老化時(shí)間的小?？Х确N子獨(dú)立聚類。主成分分析載荷圖顯示，對(duì)不同老化小?？Х确N子分類貢獻(xiàn)最大的吸收峰歸屬于蛋白質(zhì)，證明了老化過程中蛋白質(zhì)是主要的變化物質(zhì)之一。系統(tǒng)聚類分析不僅可以根據(jù)其結(jié)果得到不同樣品之間的接近程度，且分類效果比主成分分析更好。結(jié)果表明，紅外光譜法結(jié)合多元統(tǒng)計(jì)分析可以快速、有效地區(qū)分不同老化程度的小?？Х确N子。