王英年

摘要：文中采用在線衍生和二極管陣列-熒光檢測(cè)器串聯(lián)分析對(duì)葡萄酒和黃酒中的17種氨基酸含量進(jìn)行測(cè)定，回收率及方法線性關(guān)系良好。通過(guò)不同檢測(cè)波長(zhǎng)將一級(jí)、二級(jí)氨基酸分離，并通過(guò)自動(dòng)進(jìn)樣器的程序設(shè)定解決手工操作繁瑣及手工衍生的偏差。采用內(nèi)標(biāo)法能有效提高定性的可靠性和定量的準(zhǔn)確性。對(duì)葡萄酒和黃酒的同步檢測(cè)，可縮短檢測(cè)時(shí)間和成本。

關(guān)鍵詞：氨基酸；在線衍生；檢測(cè)器串聯(lián)

Determination of Amino Acids in Wine and Yellow Rice Wine by PDA Coupled with RF Detector

WANG Yingnian

（ Longyan Product Quality Inspection Institute， Longyan 364000， Fujian， China ）

Abstract： The content of 17 amino acids in wine and yellow rice wine was determined by on-line derivatization and diode array-fluorescence detector tandem analysis. The first and second amino acids were separated by different detection wavelengths， and manual operation and deviation were solved by automatic sampler. Using internal standard method can effectively improve the reliability of qualitative and quantitative accuracy. The simultaneous detection of wine and rice wine can shorten the detection time and cost.

Key Words：? Amino acid; On-line derivative; Detector tandem

0 前言

氨基酸是構(gòu)成人體蛋白質(zhì)的最基本物質(zhì)，在人體內(nèi)通過(guò)代謝發(fā)揮著重要作用，與生命活動(dòng)息息相關(guān)。葡萄酒和黃酒中含有的豐富氨基酸，是兩類酒的風(fēng)味物質(zhì)組成，它易于被人體吸收及消化，因此，適量飲用葡萄酒和黃酒有益身體健康。目前，檢測(cè)葡萄酒行業(yè)檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)方法采用熒光檢測(cè)法，黃酒行業(yè)檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)方法采用二極管陣列或紫外檢測(cè)器。而在日常檢測(cè)工作中，手工操作繁瑣，很難將一級(jí)氨基酸（C-NH2）和二級(jí)氨基酸（羥脯氨基酸）分離。筆者通過(guò)對(duì)自動(dòng)進(jìn)樣器進(jìn)行程序設(shè)定，采用OPA（鄰苯二四醛）和FMOC（9-芴基甲基氯甲酯）[1]柱前衍生試劑讓自動(dòng)進(jìn)樣器吸取衍生試劑，讓氨基酸在定量環(huán)內(nèi)充分反應(yīng)，梯度洗脫，再進(jìn)入色譜柱分離，通過(guò)多波長(zhǎng)檢測(cè)通道對(duì)多種氨基酸進(jìn)行檢測(cè)。筆者采用二極管陣列（PDA）檢測(cè)器串聯(lián)熒光（RF）檢測(cè)器方法[2]同時(shí)對(duì)這兩類酒的17種游離氨基酸含量進(jìn)行檢測(cè)，可縮短檢測(cè)時(shí)間及成本，為氨基酸檢測(cè)分析提供參考。

1材料與方法

1.1儀器及試劑

液相色譜儀：日本島津公司LC20ADXR型（SIL-20ACXR自動(dòng)進(jìn)樣器，SPD-M40二極管陣列檢測(cè)器，RF-20A熒光檢測(cè)器）；色譜柱：氨基酸分析柱150 mm×4.6 mm（內(nèi)徑），3.5μm；電子天平：ME204/02（梅特勒公司）；17種氨基酸混合標(biāo)準(zhǔn)溶液（購(gòu)于島津公司）；正纈氨酸和肌氨酸混合內(nèi)標(biāo)溶液（購(gòu)于島津公司）；OPA溶液、FMOC溶液和硼酸鹽緩沖液（購(gòu)于島津公司）；甲醇、乙腈（色譜級(jí)）。

1.2實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1流動(dòng)相配制

流動(dòng)相A：稱取十二水合磷酸氫二鈉4.50g，十水合四硼酸鈉4.75g，加水1000mL，用36%鹽酸（約1.5mL）調(diào)pH至8.2，用0.45μm濾膜過(guò)濾。流動(dòng)相B：取甲醇450mL，乙腈450mL，水100mL。

1.2.2在線衍生程序

吸取5.0μL硼酸鹽溶液，抽取樣品2.0μL，吸吐空氣液體混合，再洗針，吸OPA衍生試劑10μL，吸吐空氣液體混合，一級(jí)氨基酸反應(yīng)等待0.5min，洗針，吸FMOC衍生試劑1μL，吸吐空氣液體混合，二級(jí)氨基酸反應(yīng)等待0.5min，洗針，吸磷酸稀釋液10μL，吸吐空氣液體混合，進(jìn)樣。

1.2.3梯度洗脫

初始流速：1.0mL/min，具體步驟見(jiàn)表1。

1.2.4檢測(cè)器波長(zhǎng)

二極管檢測(cè)器338nm（一級(jí)氨基酸），262nm（二級(jí)氨基酸）夾縫4nm；UV檢測(cè)器：激發(fā)波長(zhǎng)340nm，發(fā)射波長(zhǎng)450nm（一級(jí)氨基酸），激發(fā)波長(zhǎng)262nm，發(fā)射波長(zhǎng)305nm（二級(jí)氨基酸）。

1.2.5樣品前處理

準(zhǔn)確稱取試樣1g左右，用0.05mol/L的鹽酸定容制成氨基酸總濃度約為0.5～1mg/L的試樣，再準(zhǔn)確移取1.0mL試樣，加入混合內(nèi)標(biāo)50μL，待測(cè)。

2 結(jié)果與討論

2.1 結(jié)果 17種氨基酸的標(biāo)準(zhǔn)色譜圖見(jiàn)圖1～4

2.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線

分別吸取5.0μL、10.0μL、20.0μL、50.0μL、100.0μL、150.0μL的氨基酸混合標(biāo)準(zhǔn)溶液，按1.2進(jìn)行測(cè)定，結(jié)果經(jīng)換算后，以氨基酸的質(zhì)量濃度（xμg/mL）對(duì)峰面積（y）做線性回歸曲線，17種氨基酸的線性回歸方程及最低檢出限（LOD）見(jiàn)表2。

2.3 葡萄酒與黃酒樣品中游離的氨基酸

檢測(cè)應(yīng)用

任選某葡萄酒及黃酒進(jìn)行游離的氨基酸檢測(cè)，譜圖見(jiàn)圖5、圖6，并對(duì)葡萄酒及黃酒中游離的氨基酸進(jìn)行精密度研究及加標(biāo)回收試驗(yàn)。

3 實(shí)驗(yàn)結(jié)果與分析

從標(biāo)準(zhǔn)色譜圖及樣品檢測(cè)圖中可知，采用此分析方法能夠很好地將17種游離氨基酸分離，出峰時(shí)間穩(wěn)定，也可看出二級(jí)氨基酸（脯氨酸）通過(guò)不同檢測(cè)波長(zhǎng)得到了很好分離；從標(biāo)準(zhǔn)曲線中可知，熒光檢測(cè)器和二極管陣列檢測(cè)器均有良好的線性，相關(guān)系數(shù)r在0.9995～0.9999之間；方法精密度測(cè)試葡萄酒RSD6在2.4%～6.7%，黃酒RSD6小于7.5%，表明方法精密度滿足要求；當(dāng)信噪比為3時(shí)，使用二極管陣列檢測(cè)器檢測(cè)限為0.28～0.85mg/L，使用熒光檢測(cè)器檢測(cè)限為0.083～0.64mg/L，滿足檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)要求；對(duì)兩類酒進(jìn)行加標(biāo)回收試驗(yàn)，葡萄酒的回收率在85.4%～107.3%之間，黃酒回收率在80.6%～108.9%之間，效果理想。

4 結(jié)語(yǔ)

文中建立的氨基酸在線衍生反應(yīng)，二極管陣列檢測(cè)器串聯(lián)熒光檢測(cè)器，并同時(shí)采用混合內(nèi)標(biāo)法，多波長(zhǎng)的檢測(cè)方法，實(shí)現(xiàn)了17種氨基酸的分離及氨基酸的自動(dòng)衍生，重復(fù)性好，靈敏度高，提高氨基酸的定性及定量準(zhǔn)確，降低手工繁瑣操作，可輕松應(yīng)對(duì)酒類、藥品、保健品等的氨基酸檢測(cè)。

參考文獻(xiàn)

[1]于世林.高效液相色譜方法及應(yīng)用[M].化學(xué)工業(yè)出版社，2001：243-252.

[2]Angelika Gratafeld-Huegsge.Senstiti and rialible?amino acid analysis protein hydrolysates using?the Hp1100series HPLC[R]，1999：2-4.