周春陽 袁正 李依靜 祝麗婷 梅波

角膜是一種透明的無血管組織,可以起到結(jié)構(gòu)屏障的作用,保護(hù)眼睛免受感染[1]。同時與淚膜一起,為眼睛提供了光滑的屈光界面,角膜屈光力約占眼球總屈光力的70%。上皮層是角膜的最外層,在眼睛的免疫、保護(hù)和結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性方面具有重要功能。角膜上皮損傷是指由于各種因素導(dǎo)致的角膜上皮屏障功能與完整性被破壞,引起角膜上皮細(xì)胞層部分或全層缺失的病理狀態(tài)[2]。臨床上可表現(xiàn)為角膜上皮彌漫性點(diǎn)狀脫失或糜爛,嚴(yán)重者可導(dǎo)致角膜基質(zhì)病變,影響視功能,甚至失明。目前,全球盲人估計(jì)為3600萬,另有2.17億人患有中度至重度視力障礙。在2.53億盲人或視力受損者中,約617萬人的病例可歸因于角膜原因[3]。局部藥物使用是目前公認(rèn)的治療角膜上皮損傷最直接有效的手段,但臨床常使用的人工淚液、生長因子類和蛋白提取類滴眼液的治療效果不盡如人意,尋找更加有效的藥物治療角膜上皮損傷具有重要意義。美洲大蠊屬昆蟲綱,蜚蠊目,蜚蠊科,俗稱蟑螂。蜚蠊的藥用在中國現(xiàn)存最早的藥學(xué)專著《神農(nóng)本草經(jīng)》就有記載:“主血瘀,瘕堅(jiān),寒熱,破積聚,咽喉痹,內(nèi)寒無子”?，F(xiàn)代醫(yī)學(xué)研究發(fā)現(xiàn)美洲大蠊提取液(periplaneta americana extract,PAE)在治療許多涉及組織修復(fù)的疾病中起著至關(guān)重要的作用。本研究通過建立兔角膜上皮損傷模型,觀察PAE對兔角膜上皮損傷修復(fù)的潛在影響,進(jìn)一步明確治療效果,為角膜上皮損傷的治療提供新的方案。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1實(shí)驗(yàn)動物 32只標(biāo)準(zhǔn)實(shí)驗(yàn)用普通級健康雄性新西蘭大白兔,體重約2～2.5 kg,4～6月齡。動物飼養(yǎng)員使用專用飼料每日定時定量投食喂養(yǎng),飲水自由,適應(yīng)性飼養(yǎng)1周。本實(shí)驗(yàn)經(jīng)成都中醫(yī)藥大學(xué)動物實(shí)驗(yàn)倫理委員會審查通過(編號:2022-34)。

1.1.2主要試劑和儀器 美洲大蠊提取液(四川好醫(yī)生攀西藥業(yè)有限責(zé)任公司),人表皮生長因子滴眼液(桂林華諾威基因藥業(yè)有限公司),生理鹽水(四川科倫藥業(yè)股份有限公司),眼科裂隙燈顯微鏡檢查儀(重慶上邦醫(yī)療設(shè)備有限公司),手術(shù)顯微鏡(蘇州六六視覺科技股份有限公司)。

1.2 方法

1.2.1兔角膜上皮損傷模型建立 采用乙醇法建立兔角膜上皮損傷模型[4]。大白兔稱重后,3%戊巴比妥鈉(1 mL/kg)經(jīng)兔耳緣靜脈注射行全身麻醉。兔右眼結(jié)膜囊內(nèi)滴用鹽酸奧布卡因滴眼液行局部表面麻醉,放置開瞼器,充分暴露兔眼角膜。在角膜中央放置直徑7 mm的角膜環(huán)鉆,于角膜環(huán)鉆內(nèi)滴入提前配制好的體積分?jǐn)?shù)20%乙醇溶液,作用60 s后移除環(huán)鉆,使用生理鹽水進(jìn)行沖洗。使用角膜上皮刮刀逐步刮除角膜上皮。術(shù)畢進(jìn)行熒光素鈉染色,并拍照記錄染色范圍,確認(rèn)角膜上皮缺損呈圓形,符合后續(xù)實(shí)驗(yàn)標(biāo)準(zhǔn)。所有麻醉均由同一人完成,所有角膜上皮損傷模型均由同一人完成。

1.2.2實(shí)驗(yàn)分組及干預(yù) 造模完成后,隨機(jī)選擇其中2只實(shí)驗(yàn)兔即刻行角膜熒光鈉素染色和裂隙燈顯微鏡檢查,為即時(0 h)組。該組實(shí)驗(yàn)兔在完成眼前節(jié)照相后通過空氣栓塞法處死并取出角膜,置于甲醛溶液中固定。剩余30只實(shí)驗(yàn)兔隨機(jī)分為PAE組、人表皮生長因子(human epidermal growth factor,hEGF)滴眼液組和生理鹽水(normal saline,NS)組,每組10只。各組滴用對應(yīng)滴眼液進(jìn)行干預(yù),滴眼頻率為每天4次,每次間隔4小時,每次1～2滴。同時白天使用左氧氟沙星滴眼液、夜間使用妥布霉素眼膏預(yù)防感染。

1.2.3一般情況觀察 在造模后12、24、36、48、72 h使用裂隙燈顯微鏡對各組實(shí)驗(yàn)兔眼部情況進(jìn)行觀察評估,主要觀察內(nèi)容包括結(jié)膜充血、眼瞼腫脹程度、有無分泌物等情況,評估是否出現(xiàn)眼部感染、角膜上皮反復(fù)剝脫等異常情況。

1.2.4角膜上皮損傷圖像的攝取及分析 造模后0、12、24、36、48、72 h,使用裝配照相機(jī)的裂隙燈顯微鏡進(jìn)行圖像的攝取。隨后,在兔眼結(jié)膜囊內(nèi)滴入熒光素鈉進(jìn)行染色,在鈷藍(lán)光下行眼前節(jié)拍照記錄角膜熒光染色情況。使用Image-J軟件打開角膜熒光染色圖像,沿角膜上皮缺損區(qū)邊緣進(jìn)行測量,獲取各組不同時間點(diǎn)的角膜染色面積,并計(jì)算角膜上皮修復(fù)速率和角膜上皮愈合率。角膜上皮修復(fù)速率=上皮修復(fù)面積(mm2)/修復(fù)時間(h);角膜上皮愈合率=(0 h染色面積-觀察時染色面積)/0 h染色面積×100%。采用SPSS 26.0統(tǒng)計(jì)軟件對數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。

1.2.5角膜組織病理學(xué)觀察 各組分別于造模后24、48、72 h采取抽簽法選取3、3、4只實(shí)驗(yàn)兔,使用空氣栓塞法處死后取下角膜組織,置于甲醛溶液固定。所有固定好的角膜組織(含0 h組)進(jìn)行脫水、石蠟包埋、切片后,采用蘇木精-伊紅染色法進(jìn)行處理,觀察比較各組不同時間點(diǎn)角膜上皮缺損區(qū)的大小、細(xì)胞形態(tài)結(jié)構(gòu)和排列情況。

2 結(jié)果

2.1 一般情況

用藥后12、24、36、48、72 h,三組兔眼均未觀察到明顯的結(jié)膜充血、眼瞼腫脹、分泌物等情況,均未出現(xiàn)角膜感染、角膜上皮反復(fù)剝脫等異常情況,見圖1。

圖1 各組兔眼前節(jié)圖像(12.5×)

2.2 角膜上皮修復(fù)結(jié)果

所有兔眼角膜上皮均在72h內(nèi)完全修復(fù),其中PAE組所有兔眼角膜上皮均在48h內(nèi)完全修復(fù),見圖2。進(jìn)一步對比發(fā)現(xiàn),PAE組中有2只實(shí)驗(yàn)兔角膜上皮在36h內(nèi)完全修復(fù);同樣的情況也出現(xiàn)在hEGF滴眼液組,為1只。而這種個別角膜上皮修復(fù)較快的情況并沒有出現(xiàn)在NS組。

圖2 三組不同時間點(diǎn)角膜熒光染色后眼前節(jié)圖像(12.5×)

2.2.1三組角膜上皮修復(fù)速率比較 通過計(jì)算單位時間內(nèi)角膜上皮修復(fù)面積,分析對比各組兔眼角膜上皮修復(fù)速率。發(fā)現(xiàn)PAE組角膜上皮修復(fù)速率最快,為1.37±0.19 mm2/h;hEGF滴眼液組次之,為1.22±0.15 mm2/h;NS組最慢,為1.00±0.18 mm2/h。單因素方差分析結(jié)果顯示,組間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=7.487,P=0.005)。進(jìn)一步組間兩兩比較結(jié)果顯示,PAE組與hEGF滴眼液組的角膜上皮修復(fù)速率差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=1.621,P=0.123);PAE組與NS組的角膜上皮修復(fù)速率差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=3.860,P=0.001);hEGF滴眼液組與NS組的角膜上皮修復(fù)速率差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=2.303,P=0.034),見圖3。

圖3 三組角膜上皮修復(fù)速率比較注:ns:差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義;*:P<0.05;**:P<0.01。

2.2.2三組角膜上皮愈合率比較 對角膜上皮愈合率進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析發(fā)現(xiàn),在造模后12、24、36、48 h,PAE組的角膜上皮愈合率均最高,hEGF滴眼液組次之,NS組最低。所有兔眼角膜上皮愈合率在造模后72 h均為100%。單因素方差分析結(jié)果顯示造模后12、24 h,組間差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=1.668、1.656,P=0.218、0.220),見圖4、表1。造模后36、48 h,組間差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=4.305、5.938,P=0.037、0.015);進(jìn)一步兩兩比較結(jié)果顯示,PAE組與hEGF滴眼液組的角膜上皮愈合率差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=0.229、0.802,P=0.823、0.437);PAE組與NS組的角膜上皮愈合率差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=2.783、3.340,P=0.016、0.005);hEGF滴眼液組與NS組的角膜上皮愈合率差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=2.254、2.477,P=0.032、0.028),見圖5、表1。

表1 三組不同時間點(diǎn)角膜上皮愈合率比較

圖4 三組12、24 h角膜上皮愈合率比較注:ns:差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

圖5 三組36、48h角膜上皮愈合率比較注:ns:差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義;*:P<0.05;**:P<0.01。

2.3 組織病理學(xué)檢查結(jié)果

角膜組織病理學(xué)檢查結(jié)果顯示,正常角膜組織上皮細(xì)胞排列有序,上皮細(xì)胞之間、上皮細(xì)胞與基底膜之間連接緊密。在角膜上皮損傷模型中,可以看到上皮細(xì)胞層的缺失,基底膜與基質(zhì)層完整,基質(zhì)層膠原纖維均勻規(guī)則且排列有序,見圖6。角膜上皮損傷后24 h,可見三組角膜上皮層均未完全修復(fù),上皮細(xì)胞逐漸移行填補(bǔ)缺損區(qū)域。角膜上皮損傷后48h,PAE組上皮細(xì)胞已經(jīng)完全覆蓋缺損區(qū)域,但此時的上皮細(xì)胞層較薄,上皮細(xì)胞之間連接較為疏松;hEGF滴眼液組和NS組上皮細(xì)胞均未完全覆蓋缺損區(qū)域,且相比而言NS組的角膜上皮缺損區(qū)域更大。角膜上皮損傷后72h,hEGF滴眼液組和NS組上皮細(xì)胞均已經(jīng)完全覆蓋缺損區(qū)域。對三組角膜上皮層厚度進(jìn)行比較發(fā)現(xiàn),PAE組上皮細(xì)胞層最厚,與正常角膜上皮細(xì)胞層厚度接近,且上皮細(xì)胞之間排列更加緊密;hEGF滴眼液組次之;NS組最薄,見圖7。

圖6 角膜組織病理切片(100×)(正常角膜(左)、角膜上皮損傷模型(右))

圖7 三組24、48、72 h角膜組織病理切片(100×)

3 討論

角膜是暴露在外部環(huán)境中眼睛的一部分,最有可能因各種因素而受損。角膜上皮是一種可再生的組織,位于角鞏膜交界處的角膜干細(xì)胞為上皮再生提供終生的增殖細(xì)胞供應(yīng)[5-6]。角膜上皮創(chuàng)面愈合的過程包括兩個不同的階段:初始潛伏期和閉合期[7-8]。整個過程中,嚴(yán)密調(diào)控的交互信號級聯(lián)反應(yīng)涉及愈合的角膜上皮、淚液、淚腺、角膜神經(jīng)、角膜基質(zhì)細(xì)胞和骨髓來源的細(xì)胞,以及它們產(chǎn)生的細(xì)胞因子、生長因子和其他調(diào)節(jié)因子[9-10]。有助于重建上皮完整性和恢復(fù)角膜動態(tài)平衡,進(jìn)而保持角膜的透明度和良好的視力。中醫(yī)稱角膜為黑睛,角膜屬肝,為風(fēng)輪。角膜上皮損傷屬于黑睛生翳的范疇,中醫(yī)認(rèn)為黑睛生翳應(yīng)多從肝論治,同時輔以退翳明目治療。治療黑睛生翳主要通過以下途徑:一是祛風(fēng)熱泄肝火以祛除病因;二是補(bǔ)其不足以恢復(fù)正氣驅(qū)邪外出;三是收斂固澀以縮小病灶;四是活血以消散局部瘀滯[11]。

美洲大蠊性寒味咸,作為一味中藥材,無論是中藥散劑還是美洲大蠊的提取物,其在疾病治療中均發(fā)揮著重要作用,如抗菌、抗病毒、抗腫瘤、增強(qiáng)免疫功能、促進(jìn)組織修復(fù)和傷口愈合等[12]?，F(xiàn)代醫(yī)學(xué)研究發(fā)現(xiàn)PAE能夠激活免疫細(xì)胞,促進(jìn)壞死組織脫落,肉芽組織生長。可以通過調(diào)節(jié)與細(xì)胞增殖、纖維化形成、再上皮化和重塑相關(guān)基因的表達(dá)來促進(jìn)傷口愈合[13]。對皮膚組織、腸道粘膜的損傷修復(fù)具有良好的促進(jìn)作用,被廣泛用于外傷、潰瘍、燙傷創(chuàng)面,并取得了顯著療效。而角膜和皮膚都是提供身體外部屏障的器官,這兩個組織都發(fā)展了保護(hù)機(jī)體免受廣泛外部威脅的內(nèi)在機(jī)制,同時也使組織完整性和器官特異性功能得以快速恢復(fù)。皮膚創(chuàng)傷修復(fù)的研究揭示了再生生物學(xué)中的基本原理,皮膚屏障被破壞后,炎癥細(xì)胞的涌入、肌成纖維細(xì)胞的分化、細(xì)胞外基質(zhì)的合成和瘢痕的形成在角膜和皮膚傷口愈合中呈現(xiàn)平行的修復(fù)機(jī)制。皮膚和角膜創(chuàng)傷修復(fù)反應(yīng)的細(xì)胞和分子網(wǎng)絡(luò)存在相似性[14]。

本次動物實(shí)驗(yàn)的研究方向,是通過乙醇法建立新西蘭大白兔角膜上皮損傷模型,探索PAE對兔角膜上皮損傷修復(fù)的影響,尋找更加安全有效的藥物來解決目前角膜創(chuàng)面愈合所面臨的問題。本研究中,在使用PAE干預(yù)后的多個時間點(diǎn)內(nèi),所有兔眼均未觀察到明顯的結(jié)膜充血、眼瞼腫脹、分泌物等情況,沒有角膜感染、角膜上皮反復(fù)剝脫等異常情況發(fā)生。表明該藥物作用于角膜創(chuàng)面溫和無刺激,這與PAE應(yīng)用于皮膚組織、腸道粘膜的損傷修復(fù)效果相似,均沒有出現(xiàn)明顯的不良反應(yīng)[15-16]。與NS組相比,PAE組的角膜上皮修復(fù)速率更快;在干預(yù)后36、48 h,PAE組的角膜上皮愈合率均顯著高于NS組。表明PAE能夠促進(jìn)角膜上皮損傷的修復(fù),縮短角膜創(chuàng)面完全愈合的時間。組織病理學(xué)檢查結(jié)果顯示,干預(yù)后72 h, PAE組角膜上皮層厚度相較于hEGF滴眼液組和NS組更厚,上皮細(xì)胞之間排列更加緊密,表明PAE能促進(jìn)角膜上皮損傷后角膜上皮的重塑。

綜上所述,PAE可以通過減輕創(chuàng)面炎癥反應(yīng)、提高免疫和抗氧化活性、調(diào)節(jié)細(xì)胞生長因子的表達(dá)、調(diào)節(jié)與傷口愈合相關(guān)的信號通路等途徑促進(jìn)皮膚組織修復(fù)[17],而皮膚和角膜創(chuàng)傷修復(fù)反應(yīng)的細(xì)胞和分子網(wǎng)絡(luò)存在相似性,因此PAE可能通過相似的作用機(jī)制來促進(jìn)角膜上皮損傷的修復(fù)。目前的基礎(chǔ)研究和臨床實(shí)驗(yàn)主要針對PAE促進(jìn)皮膚組織、胃腸道黏膜創(chuàng)面修復(fù)開展研究,尚無PAE應(yīng)用于角膜創(chuàng)傷修復(fù)的報道。本研究結(jié)果表明,PAE對角膜組織的創(chuàng)傷修復(fù)同樣具有促進(jìn)作用,為角膜損傷的治療提供了新的思路。

本研究結(jié)果雖表明PAE對角膜組織的損傷修復(fù)具有促進(jìn)作用,但是本研究的樣本量相對較少,PAE促進(jìn)角膜上皮損傷修復(fù)的效果與hEGF滴眼液組相比差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。本研究中所使用的美洲大蠊提取液成分復(fù)雜,具體的有效成分和作用機(jī)制還需要進(jìn)一步研究明確。此外,研究中所使用的美洲大蠊提取液濃度單一,藥物的最佳有效濃度也需要擴(kuò)大樣本量,進(jìn)一步探索。