馬東旺 席琳喬 湯 佳 周小玲 鐘榮珍 譚支良 湯少勛*

(1.中國(guó)科學(xué)院亞熱帶農(nóng)業(yè)生態(tài)研究所,湖南省動(dòng)物營(yíng)養(yǎng)生理與代謝過程重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,亞熱帶農(nóng)業(yè)生態(tài)過程重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,長(zhǎng)沙 410125;2.塔里木大學(xué)動(dòng)物科學(xué)與技術(shù)學(xué)院,阿拉爾 843300;3.張家界繼源生物科技有限公司,張家界 427099;4.中國(guó)科學(xué)院東北地理與農(nóng)業(yè)生態(tài)研究所,長(zhǎng)春 130102)

粗飼料是組成反芻家畜飼糧的必要部分,占反芻家畜飼糧的40%～70%甚至更高[1]。農(nóng)作物秸稈,特別是水稻、小麥及玉米三大類作物秸稈是我國(guó)牛、羊粗飼料的重要組成來源,根據(jù)2022年國(guó)家統(tǒng)計(jì)年鑒數(shù)據(jù)及谷草比計(jì)算[2-3],2021年僅上述三大類作物秸稈產(chǎn)量就達(dá)7億t以上。農(nóng)業(yè)農(nóng)村部發(fā)布的《全國(guó)農(nóng)作物秸稈綜合利用情況報(bào)告》表明,2021年我國(guó)秸稈飼料化利用量達(dá)1.32億t,但其飼料化利用率仍僅占秸稈總產(chǎn)量的18%。隨著我國(guó)草食畜牧業(yè)的持續(xù)快速發(fā)展,對(duì)粗飼料的需求也將日益增長(zhǎng)。而農(nóng)作物秸稈的消化利用除受其自身營(yíng)養(yǎng)特性影響外,其他如秸稈種類、秸稈粉碎的粒度等因素也會(huì)影響秸稈纖維的消化降解,明確農(nóng)作物秸稈消化降解過程中不同因素的作用是提高其利用率的重要基礎(chǔ)。

前人對(duì)不同農(nóng)作物秸稈降解特性的研究表明,秸稈發(fā)酵或降解特性不僅受其種類的影響,而且與秸稈的加工粉碎程度有關(guān)[4-6]。陳曉琳等[5]研究表明,稻草秸稈、小麥秸稈及玉米秸稈體外48 h干物質(zhì)降解率(DMD)以玉米秸稈最高,以小麥秸稈最低。于勝晨等[7]研究發(fā)現(xiàn),玉米秸稈的瘤胃干物質(zhì)及粗蛋白質(zhì)有效降解率顯著高于小麥秸稈和水稻秸稈,而小麥秸稈的瘤胃干物質(zhì)有效降解率顯著低于水稻秸稈,但其瘤胃粗蛋白質(zhì)有效降解率要顯著高于水稻秸稈。除粗飼料種類外,許多研究表明,粗飼料的長(zhǎng)度也會(huì)影響其降解特性以及發(fā)酵后揮發(fā)性脂肪酸(VFA)的組成等[6,8]。減小稻草或蔗渣顆粒長(zhǎng)度或飼糧粗飼料長(zhǎng)度會(huì)提高稻草或蔗渣發(fā)酵時(shí)的產(chǎn)氣量,或增強(qiáng)粗飼料的瘤胃消化程度進(jìn)而提高VFA產(chǎn)量[6,9]。但也有研究發(fā)現(xiàn),飼糧粗飼料長(zhǎng)度的變化不會(huì)影響瘤胃環(huán)境pH以及VFA的濃度[10-11]。

粗飼料在消化道的降解是多種因子共同作用的結(jié)果,纖維降解菌種類、微生物表面物理特性,如表面電荷、微生物細(xì)胞膜疏水性(CSH)及細(xì)胞膜通透性(CMP)等都可能對(duì)微生物的吸附過程及胞內(nèi)酶的釋放產(chǎn)生影響[12-14],進(jìn)而影響對(duì)纖維素的降解。因此,試驗(yàn)通過研究3種農(nóng)作物秸稈在不同粒度下的發(fā)酵特性、微生物表面物理特性以及纖維降解菌的組成等的變化規(guī)律,探明秸稈種類及粒度與微生物表面物理特性、秸稈發(fā)酵特性間的關(guān)系,以期為粗飼料的高效利用效率提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料及處理

試驗(yàn)所選玉米、小麥和水稻等農(nóng)作物秸稈樣品為去除籽實(shí)后的秸稈。將所收集的秸稈經(jīng)65 ℃烘干24 h,在室溫下冷卻1 h后粉碎,然后用3種孔徑(即100、50和20目)的篩網(wǎng)分篩得到3種粒度(PS)范圍的樣品,分別為<0.15 mm、0.15～0.30 mm和>0.90 mm,記為PS1、PS2和PS3,所有樣品裝入塑料自封袋中常溫保存,以備后續(xù)分析。玉米、小麥和水稻秸稈營(yíng)養(yǎng)成分含量以干物質(zhì)計(jì)分別為:有機(jī)物75.8%、73.0%和72.2%;粗蛋白質(zhì)5.2%、8.4%和6.2%;中性洗滌纖維63.6%、68.4%和63.2%;酸性洗滌纖維38.6%、42.6%和43.4%;粗纖維31.2%、34.5%和33.1%,粗脂肪14.3%、10.8%和8.0%。

1.2 試驗(yàn)動(dòng)物與飼養(yǎng)管理

選取2頭體重和年齡相近、體況良好、安裝有瘤胃瘺管的去勢(shì)成年瀏陽(yáng)黑山羊作為瘤胃液供體動(dòng)物。動(dòng)物飼糧粗料為稻稈,精料組成為豆粕24.00%、玉米47.00%、麩皮22.00%、石粉2.23%、食鹽0.77%、預(yù)混料4.00%。整個(gè)試驗(yàn)期,每頭瘺管羊每天補(bǔ)給粗料500 g,精料300 g,于每日08:00和18:00分2次飼喂粗料和精料,自由飲水。

1.3 體外發(fā)酵

參照Menke等[15]方法配制人工瘤胃緩沖液。接種瘤胃液前用恒溫磁力攪拌器加熱人工瘤胃緩沖液,溫度為39.5 ℃,通入CO2保持溶液厭氧環(huán)境(刃天青變成無(wú)色)。晨飼前1 h,通過瘤胃瘺管等量采集2只山羊瘤胃食糜裝入保溫瓶運(yùn)回實(shí)驗(yàn)室,然后用4層脫脂紗布過濾瘤胃食糜并混合,按瘤胃液與人工瘤胃緩沖液體積比為1∶4的比例配制培養(yǎng)液。

參考Zhang等[16]方法進(jìn)行體外發(fā)酵培養(yǎng)。稱取1.0 g底物放入145 mL發(fā)酵瓶中,在39.5 ℃的恒溫培養(yǎng)箱中預(yù)熱。取出發(fā)酵瓶,通入CO2,以保證發(fā)酵瓶中為厭氧環(huán)境。然后依次向每個(gè)發(fā)酵瓶中加入60 mL上述培養(yǎng)液,并將發(fā)酵瓶放入全自動(dòng)體外厭氧發(fā)酵設(shè)備中培養(yǎng)。分別在不同時(shí)間進(jìn)行3批次培養(yǎng),每批次每個(gè)處理2個(gè)平行。全自動(dòng)體外厭氧發(fā)酵設(shè)備由發(fā)酵瓶、恒溫培養(yǎng)箱、壓力測(cè)定系統(tǒng)和計(jì)算機(jī)控制系統(tǒng)組成,可實(shí)現(xiàn)氣體產(chǎn)量的全自動(dòng)記錄。記錄48 h發(fā)酵階段的實(shí)時(shí)產(chǎn)氣量。

1.4 樣品采集與分析

pH:48 h后終止發(fā)酵,立即用pH計(jì)(REX PHS-3C,上海儀器設(shè)備廠)測(cè)定每個(gè)發(fā)酵瓶中發(fā)酵液的pH。

發(fā)酵液表面張力(ST):終止發(fā)酵后將發(fā)酵液迅速送到實(shí)驗(yàn)室,用KRüSS Tensiometer K100(德國(guó)KRüSS公司)表面張力儀在39 ℃的條件下測(cè)定發(fā)酵液的ST。

DMD:用37 μm的尼龍布在真空泵負(fù)壓條件下抽濾厭氧培養(yǎng)瓶中的發(fā)酵液,收集發(fā)酵底物,包裹之后放于鋁盒中105 ℃烘干,稱重。DMD計(jì)算公式如下:

DMD(%)=100×(1-M1/M2)。

式中:M1表示發(fā)酵后底物干物質(zhì)質(zhì)量;M2為發(fā)酵前粗料的初始質(zhì)量。

微生物蛋白(MCP)濃度:取2 mL發(fā)酵液,以酵母嘌呤與氮的比值為標(biāo)準(zhǔn),采用嘌呤法估算發(fā)酵液中微生物總氮濃度[17],MCP濃度表示為MCP相對(duì)于發(fā)酵液體積的量。

VFA與氨態(tài)氮(NH3-N)濃度:取2 mL抽濾后發(fā)酵液于4 ℃、15 000 r/min離心10 min,取1 mL上清液,加入0.10 mL 25%偏磷酸固定,靜置15 min后再次在4 ℃、15 000 r/min離心10 min,取0.60 mL上清液裝于測(cè)定瓶中,在氣相色譜儀(安捷倫 7890A,美國(guó))中測(cè)定發(fā)酵液樣品中VFA濃度。取0.40 mL上清液,參考Zhang等[16]的方法測(cè)定NH3-N濃度。

Zeta電荷(ZP):參考Pelletier等[18]的方法測(cè)定ZP。取抽濾后的發(fā)酵液2 mL,12 000 r/min離心10 min,去除上清液,得細(xì)胞沉淀。用5 mL 1 mmol/L KNO3溶液洗滌細(xì)胞2次(漩渦振蕩2 min使細(xì)胞沉淀懸浮在溶液中,12 000 r/min再次離心10 min,重復(fù)上述操作),將洗滌好的細(xì)胞沉淀懸浮在5 mL 1 mmol/L KNO3溶液中,放于冰盒中靜置30 min。用Zeta Potential Analyzer測(cè)定ZP。

CSH:參考Bellon-Fontaine等[19]和Hori等[20]的MATS方法測(cè)定微生物CSH。取2 mL抽濾后發(fā)酵液,4 ℃、12 000 r/min離心10 min,去除上清液,得細(xì)胞沉淀。用6 mL 0.1 mol/L磷酸鹽緩沖液(PBS)(pH 6.6)洗滌2次(操作同上),最終得到6 mL 0.1 mol/L PBS的細(xì)胞懸浮液。取2 mL細(xì)胞懸浮液,用紫外分光光度計(jì)(日本島津,UV2450)測(cè)定其在400 nm的吸光度(OD)(A0);然后再向每個(gè)樣品管中加入2 mL十六烷,室溫孵育10 min,然后再旋渦振蕩混合2 min,待混合物完全兩相分離,小心地移出水相(避免產(chǎn)生乳濁液)并測(cè)定其在400 nm的OD(A1)。CSH計(jì)算公式如下:

CSH(%)=100×(1-A1/A0)。

CMP:參考王福遠(yuǎn)等[21]方法采用熒光光度分析法測(cè)定。用熒光劑異硫氰酸熒光素-右旋糖苷來測(cè)定細(xì)胞膜通透性,濃度分別設(shè)為:0、10、20、30、40和50 mg/L,制備標(biāo)準(zhǔn)曲線;用雙蒸水配制25 mg/L的FITC-Dextran,測(cè)定其光密度值作為空白對(duì)照,制備熒光劑標(biāo)準(zhǔn)曲線。發(fā)酵結(jié)束后,取3 mL發(fā)酵上清液,加入1 mL 100 mg/L的FITC-Detran溶液(A0)以保證FITC-Dextran在發(fā)酵液中的初始濃度為25 mg/L (0.25 mg FITC-Dextran于10 mL的離心管發(fā)酵液中),37 ℃避光厭氧培養(yǎng)1 h,取2 mL培養(yǎng)液厭氧條件下,經(jīng)4 ℃、10 000 r/min離心10 min,取上清液1.5 mL,使用熒光分光光度計(jì)檢測(cè)(激發(fā)波長(zhǎng)488 nm,發(fā)射波長(zhǎng)520 nm)OD(A1,發(fā)酵液中FITC-Detran最終濃度)。另取發(fā)酵液1 mL,4 ℃,10 000 r/min離心10 min,取0.75 mL上清液加0.25 mL雙蒸水搖勻,同樣條件下測(cè)定其熒光分光光度值(A0),以去除發(fā)酵原液對(duì)測(cè)定值的影響。CMP計(jì)算公式如下:

CMP(%)=100×[(A0-A1)/A0]。

1.5 發(fā)酵液總細(xì)菌及纖維降解菌數(shù)量

取1 mL未過濾培養(yǎng)液,根據(jù)制造商的說明,使用QIAamp DNA Stool Minikit(德國(guó)凱杰)提取基因組DNA。使用NanoDrop ND1000(NanoDrop Technologies,美國(guó))對(duì)純化的DNA進(jìn)行定量。采用Denma等[22]的方法設(shè)計(jì)總細(xì)菌、黃色瘤胃球菌及產(chǎn)琥珀酸絲狀桿菌的引物序列,參照Koike等[23]的方法設(shè)計(jì)白色瘤胃球菌的引物序列,引物序列如表1所示。用這些引物擴(kuò)增得到的純化PCR產(chǎn)物生成質(zhì)粒DNA,通過連續(xù)稀釋質(zhì)?？截悢?shù),構(gòu)建Ct值與質(zhì)?？截悢?shù)之間的標(biāo)準(zhǔn)曲線。以稀釋后的基因組DNA為模板,使用諾唯贊的Taq DNA Polymerase在ABI 7900HT系統(tǒng)(應(yīng)用生物系統(tǒng),美國(guó))進(jìn)行定量PCR檢測(cè)。通過將Ct值與標(biāo)準(zhǔn)曲線的關(guān)系來確定總細(xì)菌及纖維降解菌的拷貝數(shù)。

表1 引物序列Table 1 Primer sequences

1.6 數(shù)據(jù)計(jì)算

運(yùn)用LE體外發(fā)酵產(chǎn)氣模型[24]將各時(shí)間點(diǎn)測(cè)得的總產(chǎn)氣量進(jìn)行擬合,采用最小二乘法計(jì)算動(dòng)態(tài)發(fā)酵產(chǎn)氣參數(shù),模型公式如下:

y=Vf[1-exp(-k×t)]/[1+exp(b-k×t)]。

式中:y表示t時(shí)間點(diǎn)底物的產(chǎn)氣量(mL/g);Vf表示理論最大產(chǎn)氣量(mL/g);k表示產(chǎn)氣分率(/h);b為產(chǎn)氣曲線形狀指標(biāo);b>0表示曲線為s形;b<0表示曲線為非s形,下同。

采用以下計(jì)算公式計(jì)算產(chǎn)氣動(dòng)力學(xué)參數(shù):

FRD0=k/[1+exp(b)];
T0.5=ln[2+exp(b)]/k。

式中:FRD0表示發(fā)酵初期(<12 h)產(chǎn)氣分率(/h);T0.5表示達(dá)到最大產(chǎn)氣量一半所需的發(fā)酵時(shí)間(h)[25]。

1.7 統(tǒng)計(jì)分析

采用SAS 8.2統(tǒng)計(jì)軟件的GLM過程對(duì)所有數(shù)據(jù)進(jìn)行方差分析,統(tǒng)計(jì)模型如下:

Yijk=μ+Ri+Vj+Pk+RiVj+RiPk+VjPk+RiVjPk+Eijk。

式中,Yijk為依變量;μ為總體平均值;Ri為批次i的影響;Vj為秸稈種類j的影響;Pk表示粒度k的影響;RiVj表示批次與秸稈種類j的交互作用;RiPk表示批次i與粒度k的交互作用;VjPk表示秸稈種類j與粒度k的交互作用;RiVjPk表示批次i、秸稈種類j與粒度k間的交互作用;Eijk表示隨機(jī)殘差。采用Tukey’s檢驗(yàn)對(duì)最小二乘方法的結(jié)果進(jìn)行多重比較,P<0.05表示差異顯著,0.05≤P<0.10表示有顯著性趨勢(shì)。

2 結(jié)果與分析

2.1 體外產(chǎn)氣特性

不同秸稈種類在3種粒度下體外發(fā)酵累積產(chǎn)氣量如圖1所示,秸稈種類及粒度對(duì)其體外發(fā)酵產(chǎn)氣量有明顯的影響,在總體產(chǎn)氣量方面,玉米秸稈表現(xiàn)出比水稻秸稈和小麥秸稈更高的產(chǎn)氣量,而PS1粒度下3種秸稈在發(fā)酵初始階段相對(duì)PS2和PS3粒度具有更快的產(chǎn)氣速度。

PS1、PS2和PS3分別表示粒度為<0.15 mm、0.15～0.30 mm和>0.90 mm。下同。PS1, PS2 and PS3 indicate particle sizes<0.15 mm, 0.15 to 0.30 mm and >0.90 mm, respectively. The same as below.圖1 不同秸稈種類及粒度的秸稈體外發(fā)酵產(chǎn)氣量Fig.1 Gas production from in vitro fermentation of different straw species and particle sizes of straws

如表2所示,不同秸稈及不同粒度的理論最大產(chǎn)氣量及產(chǎn)氣分率(k)無(wú)顯著差異(P>0.05),二者的交互作用也不顯著(P>0.05)。秸稈產(chǎn)氣曲線形狀(b)、初始發(fā)酵速率(FRD0)及達(dá)到最大產(chǎn)氣量一半所需時(shí)間(T0.5)受秸稈種類及粒度的顯著影響(P<0.05)。水稻秸稈及小麥秸稈的b值顯著高于玉米秸稈(P<0.05),FRD0按玉米秸稈>水稻秸稈>小麥秸稈的順序顯著降低(P<0.05),而小麥秸稈的T0.5值顯著高于玉米秸稈和水稻秸稈(P<0.05)。當(dāng)秸稈粒度降低到PS1以下時(shí),b值及T0.5值顯著降低(P<0.05)。同時(shí)發(fā)現(xiàn),玉米秸稈的粒度由PS2降低到PS1時(shí)其FRD0值提高幅度顯著高于水稻秸稈和小麥秸稈(秸稈種類×粒度,P<0.05)。

表2 秸稈種類及粒度對(duì)秸稈體外發(fā)酵產(chǎn)氣參數(shù)的影響Table 2 Effects of straw species and particle size on in vitro fermentation gas production parameters of straws

2.2 體外發(fā)酵特性

如表3所示,秸稈種類以及粒度對(duì)秸稈DMD、發(fā)酵液NH3-N濃度、pH以及MCP濃度存在顯著影響(P<0.05)。同時(shí)發(fā)現(xiàn),秸稈種類及粒度對(duì)DMD、NH3-N和MCP濃度有顯著的交互作用(P<0.05)。水稻秸稈、小麥秸稈及玉米秸稈粒度分別為PS3、PS2及PS1時(shí)DMD最高,而分別為PS1、PS3及PS3時(shí)DMD最低。對(duì)于NH3-N濃度,水稻秸稈表現(xiàn)出隨秸稈粒度的增大呈先上升后下降的現(xiàn)象,小麥秸稈和玉米秸稈則表現(xiàn)出隨秸稈粒度的增大而下降的現(xiàn)象。玉米秸稈發(fā)酵時(shí)其發(fā)酵液pH顯著低于水稻秸稈和小麥秸稈(P<0.05),而粒度為PS3時(shí)發(fā)酵液pH顯著高于粒度較小的2種秸稈(P<0.05),但其pH都在6.8以上。3種秸稈間發(fā)酵液中MCP濃度按玉米秸稈>小麥秸稈>水稻秸稈的順序顯著降低(P<0.05),而在3種粒度間,MCP濃度則隨粒度的增大而顯著下降(P<0.05)。同時(shí)發(fā)現(xiàn)秸稈種類與粒度對(duì)MCP濃度有顯著的交互作用(P<0.05)。

表3 秸稈種類及粒度對(duì)秸稈體外發(fā)酵特性的影響Table 3 Effects of straw species and particle size on in vitro fermentation characteristics of straws

如表4所示,3種秸稈發(fā)酵后發(fā)酵液TVFA濃度及丙酸摩爾百分比按玉米秸稈>水稻秸稈>小麥秸稈的順序顯著降低(P<0.05),而乙丙比則按小麥秸稈>水稻秸稈>玉米秸稈的順序顯著降低(P<0.05)。玉米秸稈發(fā)酵后乙酸摩爾百分比顯著低于小麥秸稈和水稻秸稈(P<0.05);水稻秸稈的發(fā)酵液中丁酸和戊酸摩爾百分比顯著低于玉米秸稈和小麥秸稈(P<0.05);而小麥秸稈異丁酸和異戊酸摩爾百分比顯著高于水稻秸稈和玉米秸稈(P<0.05)。

表4 秸稈種類及粒度對(duì)秸稈體外發(fā)酵液揮發(fā)性脂肪酸的影響Table 4 Effects of straw species and particle size on volatile fatty acids in in vitro fermentation liquid of straws

當(dāng)秸稈粒度為PS2時(shí)其TVFA濃度顯著高于PS3(P<0.05),PS1和PS3間無(wú)顯著差異(P>0.05)。秸稈粒度為PS3時(shí)其丙酸摩爾百分比顯著低于PS1和PS2(P<0.05),而PS1的戊酸摩爾百分比顯著高于PS2和PS3(P<0.05),PS1和PS2的異戊酸摩爾百分比顯著高于PS3(P<0.05)。

戊酸及異丁酸摩爾百分比受秸稈種類及粒度交互作用的顯著影響(P<0.05)。玉米秸稈發(fā)酵后其發(fā)酵液中戊酸摩爾百分比隨粒度的增大而下降,而小麥秸稈和水稻秸稈則表現(xiàn)出先下降后上升或不變的現(xiàn)象(秸稈種類×粒度,P=0.002);玉米秸稈和小麥秸稈發(fā)酵時(shí)異丁酸摩爾百分比隨粒度的增大而上升,而水稻秸稈發(fā)酵時(shí)異丁酸摩爾百分比則表現(xiàn)出先下降后平穩(wěn)的現(xiàn)象(秸稈種類×粒度,P=0.005)。

2.3 發(fā)酵液及微生物表面物理特性

如表5所示,不同種類秸稈發(fā)酵48 h后,發(fā)酵液ST、微生物CSH及CMP存在顯著差異(P<0.05)。小麥秸稈發(fā)酵后發(fā)酵液ST顯著高于玉米秸稈(P<0.05),而玉米秸稈發(fā)酵后微生物CSH顯著高于水稻秸稈和小麥秸稈(P<0.05),3種秸稈間微生物CMP按水稻秸稈>玉米秸稈>小麥秸稈的順序依次顯著降低(P<0.05)。

表5 秸稈種類及粒度對(duì)秸稈體外發(fā)酵液表面張力及微生物表面物理特性的影響Table 5 Effects of straw species and particle size on surface tension of fermentation liquor and physical characteristics of microbial surface in in vitro fermentation liquid of straws

3種粒度間,發(fā)酵液ST以PS3最高,顯著高于PS1和PS2(P<0.05)。微生物CSH及其CMP也以PS3最高,顯著高于PS1和PS2(P<0.05),后兩者間無(wú)顯著差異(P>0.05)。

同時(shí)發(fā)現(xiàn),CSH受秸稈種類與粒度交互作用的顯著影響(P<0.05),水稻秸稈和玉米秸稈發(fā)酵時(shí)微生物CSH隨粒度的增大先略微降低,然后再上升,而小麥秸稈則表現(xiàn)出一直上升的現(xiàn)象。

2.4 總細(xì)菌及纖維降解菌數(shù)量

如表6所示,小麥秸稈發(fā)酵后總細(xì)菌數(shù)量顯著低于水稻秸稈與玉米秸稈(P<0.05),而水稻秸稈發(fā)酵后白色瘤胃球菌數(shù)量顯著低于玉米秸稈與小麥秸稈(P<0.05)。3種粒度間總細(xì)菌數(shù)量以PS2最低,顯著低于其他2種粒度(P<0.05),黃色瘤胃球菌數(shù)量隨秸稈粒度的增大呈下降趨勢(shì)(P=0.05),而白色瘤胃球菌數(shù)量以PS1最低,顯著低于其他2種粒度(P<0.05)。產(chǎn)琥珀酸絲狀桿菌數(shù)量以PS3最高,顯著高于其他2種粒度(P<0.05)。

表6 秸稈種類及粒度對(duì)秸稈體外發(fā)酵液總細(xì)菌及纖維降解菌數(shù)量的影響Table 6 Effects of straw species and particle size on number of total bacteria and cellulolytic bacteria in in vitro fermentation liquid of straws log10 (拷貝數(shù)/mL)

發(fā)酵后白色瘤胃球菌和產(chǎn)琥珀酸絲狀桿菌數(shù)量受秸稈種類與粒度二者交互的顯著影響(P<0.05)。小麥秸稈與玉米秸稈發(fā)酵時(shí)白色瘤胃球菌數(shù)量隨粒度的增大先快速上升后平穩(wěn),而水稻秸稈則表現(xiàn)為略微降低,然后上升的現(xiàn)象。而對(duì)于產(chǎn)琥珀酸絲狀桿菌數(shù)量,水稻秸稈與玉米秸稈發(fā)酵時(shí)先隨粒度的增大而先下降,然后上升,而小麥秸稈則表現(xiàn)先快速上升,然后緩慢上升的現(xiàn)象。

3 討 論

3.1 體外發(fā)酵特性

飼草的體外發(fā)酵產(chǎn)氣參數(shù)在很大程度上可反映其在瘤胃內(nèi)的降解動(dòng)力學(xué)特性。飼草中可發(fā)酵碳水化合物含量越多,瘤胃的產(chǎn)氣量也越高,同時(shí)也預(yù)示著其DMD也越高。FRD0表示飼草發(fā)酵12 h以內(nèi)的產(chǎn)氣分率,T0.5表示達(dá)到最大產(chǎn)氣量一半所需的發(fā)酵時(shí)間,FRD0值越大表示飼草在發(fā)酵初始階段產(chǎn)氣速率越高,T0.5值越小表示可發(fā)酵碳水化合物在發(fā)酵前期的降解程度越高。本研究中玉米秸稈相對(duì)小麥秸稈具有較高的FRD0和T0.5值,表明其比小麥秸稈在發(fā)酵初期具有更高的有機(jī)物降解率。而秸稈的FRD0不僅與秸稈中可溶性成分含量有關(guān),而且與秸稈表面定植纖維降解菌的數(shù)量相關(guān),如玉米秸稈中性洗滌可溶物含量(26.4%)要高于小麥秸稈(21.6%),同時(shí)其3種纖維降解菌數(shù)量也要高于小麥秸稈,這可能是隨粒度增大玉米秸稈FRD0下降程度大于小麥秸稈的主要原因。有研究認(rèn)為,粗料在反芻動(dòng)物瘤胃中正常消化時(shí)間在30 h左右[26],而本研究發(fā)現(xiàn),發(fā)酵48 h時(shí)玉米秸稈DMD顯著高于水稻秸稈,而水稻秸稈顯著高于小麥秸稈,這預(yù)示著在相對(duì)較短的體內(nèi)消化過程中,小麥秸稈相對(duì)玉米秸稈和水稻秸稈為家畜提供的可利用營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)更少。陳曉琳等[5]研究中也發(fā)現(xiàn),玉米秸稈和水稻秸稈的干物質(zhì)有效降解率要高于小麥秸稈。而秸稈粒度由PS3以上降低到PS1以下時(shí),FRD0值顯著提高,T0.5值顯著降低,表明通過提高秸稈粉碎程度有利于提高秸稈的初始階段的發(fā)酵速率,進(jìn)而提高干物質(zhì)的降解,表3中DMD數(shù)據(jù)也證明了這一結(jié)果。同時(shí)本研究發(fā)現(xiàn),秸稈種類與粒度對(duì)DMD存在顯著的交互作用,即玉米秸稈DMD在粒度由PS1增大到PS2時(shí)快速降低,小麥秸稈則表現(xiàn)出粒度由PS2增大到PS3時(shí)快速降低,而水稻秸稈則一直變化較小。這意味著不同種類秸稈DMD隨粒度的增加并不完全呈線性變化。其原因可能與粒度達(dá)到一定程度后,秸稈中可溶物質(zhì)或可消化物質(zhì)的含量并不呈線性變化有關(guān)。如齊慧等[27]研究表明,當(dāng)蘆葦秸稈粒度由<0.85 mm降到<0.18 mm時(shí)其水提液中葡萄糖與木糖含量、可溶性葡聚糖和木聚糖含量都呈冪函數(shù)式下降,而半纖維素與木質(zhì)素含量分別呈指數(shù)式和線性下降。而郭棟豪等[28]研究發(fā)現(xiàn),當(dāng)玉米秸稈粒度由>0.450 mm降到<0.075 mm時(shí)其水提液中葡萄糖含量?jī)绾瘮?shù)式下降,木糖含量先快速下降,然后緩慢降低,而可溶性葡聚糖和木聚糖含量分別呈線性上升和先下降后上升的二次曲線變化。

NH3-N是瘤胃微生物合成菌體蛋白的主要原料,其濃度高低是微生物對(duì)飼料氮的降解與利用的綜合結(jié)果,而MCP濃度直接反映秸稈在瘤胃中降解后可合成MCP的程度。有研究認(rèn)為,瘤胃中適宜的NH3-N濃度為6.30～27.50 mg/dL[29]。本研究中,各處理NH3-N濃度在這一范圍之內(nèi),說明微生物的生長(zhǎng)不受影響。而本研究中玉米秸稈發(fā)酵時(shí)具有較低的NH3-N濃度,可能與其MCP合成較高有關(guān)(MCP濃度顯著高于水稻秸稈和小麥秸稈)。而水稻秸稈發(fā)酵時(shí)NH3-N和MCP濃度都較低,可能與水稻秸稈中的蛋白質(zhì)主要以結(jié)構(gòu)性蛋白質(zhì)為主,從而限制了微生物對(duì)蛋白質(zhì)的降解有關(guān)[30],進(jìn)而導(dǎo)致其雖然具有比小麥秸稈更高的DMD,但其MCP濃度反而低于小麥秸稈。而秸稈粒度從PS3以上降低到PS1以下時(shí),NH3-N濃度會(huì)提高11.40%,其原因可能是秸稈粒度減小時(shí)可為微生物提供更多可降解位點(diǎn),進(jìn)而提高微生物對(duì)秸稈有機(jī)物的降解(如秸稈粒度減小時(shí)DMD相對(duì)提高8.27%),進(jìn)而也提高了對(duì)粗蛋白質(zhì)的降解,相應(yīng)地為微生物的生長(zhǎng)提供更多碳源和氮源,進(jìn)而合成更多MCP(MCP濃度相對(duì)提高25.90%)。本研究還發(fā)現(xiàn),NH3-N及MCP濃度受秸稈種類及粒度的交互作用影響,即小麥秸稈NH3-N及MCP濃度隨粒度的增大先分別快速下降和上升,然后變化平穩(wěn)和快速下降,水稻秸稈的NH3-N及MCP濃度隨粒度的增大表現(xiàn)出相似的先略微上升后略微下降的平穩(wěn)變化,而玉米秸稈的NH3-N濃度隨粒度的增大表現(xiàn)出與水稻秸稈相似的變化,但其MCP濃度則隨粒度的增大先快速下降,然后維持平穩(wěn)。3種秸稈的NH3-N及MCP濃度隨粒度的增大與DMD表現(xiàn)出相似的變化規(guī)律,因此二者受秸稈種類與粒度交互作用影響的主要因素與秸稈DMD的變化相關(guān)。

反芻動(dòng)物機(jī)體70%～80%的能量來源于瘤胃中的VFA[31],秸稈發(fā)酵時(shí)產(chǎn)生更多的VFA意味著可為反芻家畜提供更多的能量來源。本研究中,玉米秸稈和稻草秸稈發(fā)酵時(shí)相對(duì)小麥秸稈具有更高的TVFA濃度,從其組成來看,增加的VFA主要為丙酸。此結(jié)果與汪營(yíng)等[32]的結(jié)果不完全一致,可能是由于不同研究中所選秸稈的營(yíng)養(yǎng)組成及纖維結(jié)構(gòu)等存在差異所致。同時(shí)發(fā)現(xiàn)玉米秸稈和水稻秸稈的乙丙比顯著低于小麥秸稈,汪營(yíng)等[32]也發(fā)現(xiàn)水稻秸稈發(fā)酵時(shí)乙丙比要低于小麥秸稈。這說明玉米秸稈和水稻秸稈更趨向于丙酸型發(fā)酵,而小麥秸稈趨向于乙酸型發(fā)酵。此外,本研究發(fā)現(xiàn)提高秸稈粉碎程度可顯著提高發(fā)酵液中TVFA的濃度,但當(dāng)秸稈粒度為PS1時(shí),其TVFA濃度反而比中間粒度的濃度略低,但高于最大粒度的秸稈,其增加量主要來源于乙酸和丙酸,但發(fā)酵液中乙丙比并沒有顯著差異,說明提高粉碎程度并未改變瘤胃發(fā)酵模式。發(fā)酵液中TVFA的濃度并未隨秸稈粒度的增加而持續(xù)增加,可能與秸稈粉碎到PS1以下后微生物的活力并未持續(xù)增加有關(guān),如2種較小粒度秸稈具有相近的MCP濃度。

3.2 發(fā)酵液及微生物表面物理特性

瘤胃液低ST可促進(jìn)食物快速濕潤(rùn)和消化[33],研究發(fā)現(xiàn)通過調(diào)節(jié)瘤胃液ST可調(diào)節(jié)瘤胃發(fā)酵和飼料利用[34]。本研究發(fā)現(xiàn),玉米秸稈及水稻秸稈以及較小粒度秸稈發(fā)酵時(shí),發(fā)酵液的ST更低,這可能是其發(fā)酵過程中更多的微生物代謝產(chǎn)物(如VFA等也可以降低溶液的ST)降低了發(fā)酵液的ST,而這更有利于微生物對(duì)底物的黏附與降解[35]。

ZP表示微生物表面固液界面上的電勢(shì)差,是反映微生物表面物理化學(xué)特性的因素之一,它與微生物的黏附過程及生物膜的形成有關(guān)[12]。ZP絕對(duì)值越高,則微生物聚集程度越低,體系越穩(wěn)定,并且死亡細(xì)菌的ZP絕對(duì)值更低[36]。本研究發(fā)現(xiàn),3個(gè)種類秸稈及3種粒度秸稈發(fā)酵48 h后微生物表面ZP沒有顯著差異,表明發(fā)酵體系中微生物的穩(wěn)定性不受秸稈種類及粒度的影響。

微生物CSH是評(píng)價(jià)細(xì)胞表面特性的一個(gè)重要指標(biāo),其不僅影響微生物的黏附和互相凝集的能力,而且還影響它們攝取降解有機(jī)質(zhì)的效率[37]。從化學(xué)角度看,疏水性細(xì)胞傾向于黏附在疏水性基質(zhì)上,而親水性細(xì)胞表面傾向于黏附在親水性基質(zhì)上[38],微生物CSH越強(qiáng),其黏附性也越強(qiáng)[36]。本研究中,玉米秸稈發(fā)酵時(shí)微生物CSH顯著高于水稻秸稈和小麥秸稈,表明其對(duì)底物的黏附作用可能要高于后面二者。有研究表明,秸稈纖維素呈現(xiàn)親水性,而木質(zhì)素則呈疏水性[39]。較小粒度秸稈發(fā)酵時(shí)其微生物CSH要低于粒度較大秸稈,可能是秸稈在粉碎過程其木質(zhì)素結(jié)構(gòu)受到破壞,進(jìn)而降低了其疏水性。由于這方面的研究文獻(xiàn)相對(duì)較少,具體原因需要進(jìn)一步研究。此外,在本研究中秸稈種類與粒度對(duì)微生物CSH還表現(xiàn)出交互作用的影響,即當(dāng)秸稈粒度由小增大時(shí),水稻秸稈和玉米秸稈發(fā)酵時(shí)微生物CSH先降低,然后再上升,而小麥秸稈則一直表現(xiàn)為上升現(xiàn)象。有研究表明,微生物CSH受培養(yǎng)時(shí)間、培養(yǎng)基以及微生物自身特性等多種因素的共同影響[40-41],微生物CSH受秸稈種類與粒度交互作用影響的機(jī)理目前并不清楚。

微生物細(xì)胞保持適宜的通透性與流動(dòng)性是保證其與外界進(jìn)行物質(zhì)交換,維持其自身生長(zhǎng)代謝的重要條件,當(dāng)細(xì)胞膜的通透性及流動(dòng)性發(fā)生改變時(shí),其生理功能也可能發(fā)生改變[42]。適當(dāng)提高CMP可使胞內(nèi)酶更容易流向胞外,進(jìn)而提高干物質(zhì)降解[43]。本研究中,水稻秸稈及玉米秸稈發(fā)酵時(shí)微生物CMP更高,而增大秸稈粒度時(shí)微生物CMP也隨之提高。微生物CMP在多少范圍內(nèi)較為適宜目前并不清楚,引起這一變化的機(jī)制也需進(jìn)一步研究。

3.3 瘤胃纖維降解菌

瘤胃中纖維降解菌主要包括產(chǎn)琥珀酸絲狀桿菌、黃色瘤胃球菌、黃色瘤胃球菌、溶纖維丁酸弧菌和梭菌屬等[44]。產(chǎn)琥珀酸絲狀桿菌、黃色瘤胃球菌和白色瘤胃球菌是最有代表性的3種纖維分解菌,它們消化纖維素的能力要強(qiáng)于瘤胃中的其他纖維分解菌,在牛瘤胃的總纖維分解菌中所占比例分別為33.0%、2.6%和46.0%[23]。本試驗(yàn)中,3種秸稈發(fā)酵時(shí)的主要纖維降解菌為產(chǎn)琥珀酸絲狀桿菌和黃色瘤胃球菌,牛瘤胃纖維降解菌分布不一致,這可能與本試驗(yàn)中所有動(dòng)物及飼料不一樣有關(guān)。同時(shí)玉米秸發(fā)酵時(shí),其3種纖維降解菌數(shù)量最高也可能是其DMD最高的原因之一。

粉碎會(huì)改變瘤胃微生物及酶與底物的接觸面積,從而改變瘤胃的發(fā)酵[45],引起瘤胃微生物組成的變化,最終影響發(fā)酵速度和終產(chǎn)物的形成[46]。本研究發(fā)現(xiàn),隨著秸稈粒度的增加,總細(xì)菌、產(chǎn)琥珀酸絲狀桿菌及白色瘤胃球菌數(shù)量逐漸增大,其原因可能是秸稈粒度的增加延遲了微生物接觸可發(fā)酵有機(jī)物的時(shí)間,導(dǎo)致在發(fā)酵后期時(shí)才表現(xiàn)出更高的總細(xì)菌與纖維降解菌數(shù)量[47]。而黃色瘤胃球菌數(shù)量表現(xiàn)出隨秸稈粒度增加而降低的現(xiàn)象,上述結(jié)果表明,相對(duì)較小粒度的秸稈,秸稈粒度較大時(shí)有更多的黃色瘤胃球菌參與纖維的降解。

在本研究中發(fā)現(xiàn),秸稈種類與粒度對(duì)秸稈發(fā)酵時(shí)產(chǎn)琥珀酸絲狀桿菌及白色瘤胃球菌數(shù)量存在顯著的交互作用。即玉米秸稈與水稻秸稈發(fā)酵時(shí)產(chǎn)琥珀酸絲狀桿菌數(shù)量隨秸稈粒度的增大而先下降后上升,而小麥秸稈則表現(xiàn)出先快速升,然后平穩(wěn)上升的現(xiàn)象,同時(shí)玉米秸稈與小麥秸稈發(fā)酵時(shí)白色瘤胃球菌數(shù)量隨秸稈粒度的增大先快速上升,而再平穩(wěn)或緩慢下降,而水稻秸稈則表現(xiàn)出先緩慢上升然后又緩慢下降的現(xiàn)象。由于纖維降解菌在分解底物的增殖過程中受多種因素(如底物的碳氮營(yíng)養(yǎng)組成、不同細(xì)菌間的競(jìng)爭(zhēng)、細(xì)菌生長(zhǎng)階段、植物的表面結(jié)構(gòu)、細(xì)菌生存pH、離子強(qiáng)度環(huán)境等)的影響,如玉米秸稈、水稻秸稈及小麥秸稈在相同粒度下其比表面積并不相同,并表現(xiàn)出隨秸稈粒度減少呈非線性的變化現(xiàn)象[48]。另外,水稻秸稈在粉碎過程中其表面硅質(zhì)受到不同程度去除,進(jìn)而改變水稻秸稈表面的疏水性[49],最終引起纖維降解菌黏附與增殖的變化。因此,引起秸稈種類與粒度對(duì)2種纖維降解菌產(chǎn)生交互影響的內(nèi)在機(jī)制究竟是什么還有待深入研究。

4 結(jié) 論

不同農(nóng)作物秸稈在體外發(fā)酵特性、纖維降解菌組成及微生物細(xì)胞表面物理特性方面存在顯著差異。玉米秸稈相對(duì)水稻秸稈和小麥秸稈具有更高的FRD0、DMD、TVFA和MCP濃度、總細(xì)菌和白色瘤胃球菌數(shù)量,以及微生物CSH。提高秸稈粉碎程度會(huì)有效提高秸稈的發(fā)酵時(shí)的FRD0、DMD、MCP和NH3-N濃度以及黃色瘤胃球菌數(shù)量。同時(shí)秸稈發(fā)酵特性與微生物細(xì)胞膜表面物理特性還受秸稈種類與粒度交互作用的影響,在對(duì)不同秸稈粉碎時(shí)還應(yīng)考慮其粉碎程度。