張?zhí)斓t ，謝晉奕 ，熊 智 ，顧瑞靜 ，陶明晗 ，李 娟 ， 黃遠(yuǎn)航 ，韓 龍

1.西南林業(yè)大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，云南昆明 650224；

2.西南林業(yè)大學(xué)繼續(xù)教育學(xué)院，云南昆明 650224

鐵核桃（Juglans sigllataDode）屬落葉喬木，主要分布于我國(guó)云南、西藏以及四川等地（張旋等，2022；李煥云，2014）。鐵核桃果仁具有較高出油率（約70%），與普通核桃相比，鐵核桃微量元素、維生素等含量更高，壓榨油油質(zhì)更加香醇，是一種優(yōu)質(zhì)油料（吳舒同，2017）。鐵核桃榨油后會(huì)產(chǎn)生大量副產(chǎn)物鐵核桃餅粕，其中蛋白質(zhì)、脂肪酸以及各種微量元素等含量豐富（高瑞雄等，2018），常用作肥料、飼料。但餅粕中核桃殼占比較高，導(dǎo)致其粗纖維含量大，嚴(yán)重影響鐵核桃餅粕的應(yīng)用價(jià)值。因此，探索合適的方法，減少鐵核桃餅粕中粗纖維的含量，對(duì)其應(yīng)用范圍的擴(kuò)大具有重要的現(xiàn)實(shí)意義。

常見植物來(lái)源農(nóng)副產(chǎn)物（麥麩、菜籽粕、豆粕等），經(jīng)微生物發(fā)酵，大分子營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)能被分解轉(zhuǎn)化為小分子代謝產(chǎn)物，用作動(dòng)物飼料，可為動(dòng)物提供豐富的營(yíng)養(yǎng)（劉敏等，2023；Cheng 等，2021；Kaewpila 等，2021）。此外，發(fā)酵飼料中的活體微生物定植于動(dòng)物消化系統(tǒng)，能起到改善機(jī)體腸道菌群平衡，促進(jìn)消化吸收能力，抑制病原菌的作用（康永剛等，2022 ；Wei 等，2021；Ding 等，2020），從而達(dá)到提高養(yǎng)殖效率的目的。發(fā)酵飼料中粗纖維含量是評(píng)判其營(yíng)養(yǎng)價(jià)值的重要指標(biāo)，纖維素含量過(guò)高，會(huì)對(duì)動(dòng)物的消化吸收產(chǎn)生負(fù)面影響（鄧詩(shī)貴等，2021 ；劉磊等，2018）。有研究表明，利用黑曲霉單菌或黑曲霉多菌混合發(fā)酵可產(chǎn)生纖維素酶，起到降解纖維素的作用（周艷華等，2021 ；高星星等，2012）。基于此，本試驗(yàn)以榨油后的鐵核桃餅粕為原料，黑曲霉和產(chǎn)朊假絲酵母為發(fā)酵菌種，進(jìn)行混菌固態(tài)發(fā)酵研究。以纖維素含量為指標(biāo)，探究纖維素降解的最佳發(fā)酵條件，旨在降低鐵核桃餅粕中粗纖維含量并應(yīng)用于飼料工業(yè)中，實(shí)現(xiàn)副產(chǎn)物的二次利用。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

鐵核桃餅粕：迪慶香格里拉舒達(dá)有機(jī)食品公司，粉碎過(guò)40 目篩；黑曲霉（GDMCC486）、產(chǎn)朊假絲酵母（GDMCC2.148）：廣東省微生物菌種保藏中心；馬鈴薯葡萄糖液體培養(yǎng)基（PDB）：杭州百思生物技術(shù)有限公司；麩皮：市售；硫酸、氫氧化鈉、95%乙醇、乙醚等試劑：云南省楊林工業(yè)開發(fā)區(qū)汕滇藥業(yè)有限公司，均為分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

DHP-9162 立式壓力蒸汽滅菌器：上海博訊實(shí)業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠；ZD-85A 氣浴恒溫振蕩器：金壇市易辰儀器制造有限公司；DHP-9162 電熱恒溫培養(yǎng)箱：上海齊欣科學(xué)儀器有限公司；101–1AB 電熱鼓風(fēng)干燥箱：天津市泰斯特儀器有限公司。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 種子液制備PDB 液體培養(yǎng)基制備：稱取23.05 g PDB 粉末，加熱溶解于500 mL 蒸餾水中，121 ℃滅菌20 min，冷卻備用。

在無(wú)菌的操作環(huán)境下，從黑曲霉和產(chǎn)朊假絲酵母斜面上挑取一環(huán)菌，分別接種于PDB 液體培養(yǎng)基中，28 ℃，130 r/min 恒溫振蕩（黑曲霉培養(yǎng)2 d，產(chǎn)朊假絲酵母培養(yǎng)1 d）。

1.3.2 鐵核桃餅粕固態(tài)發(fā)酵稱取18.20 g 鐵核桃餅粕粉、1.80 g 麩皮，混合均勻，121 ℃滅菌20 min。冷卻至室溫后，加入無(wú)菌蒸餾水，攪拌均勻，接入不同體積、不同比例的黑曲霉、產(chǎn)朊假絲酵母混合發(fā)酵種子液，置于恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)。發(fā)酵結(jié)束后，樣品50 ℃烘干至恒重，測(cè)定粗纖維含量。

1.3.3 單因素試驗(yàn)設(shè)計(jì)單因素試驗(yàn)設(shè)計(jì)參考柴云雷（2022）和懷寶東等（2020）的方法。

1.3.3.1 料水比對(duì)粗纖維含量的影響 改變培養(yǎng)基料水比（1:0.5、1:0.75、1:1、1:1.25、1:1.5），固定總接種量10%，混菌接種比例1:1，28 ℃，發(fā)酵5 d。發(fā)酵完成后，測(cè)定樣品粗纖維含量。

1.3.3.2 總接種量對(duì)粗纖維含量的影響 改變菌種總接種量（4%、7%、10%、13%、16%），固定料水比1:1，混菌接種比例1:1，28 ℃，發(fā)酵5 d。發(fā)酵完成后，測(cè)定樣品粗纖維含量。

1.3.3.3 混菌接種比例對(duì)粗纖維含量的影響 改變混菌接種比例（3:1、2:1、1:1、1:2、1:3），固定料水比1:1，總接種量10%，28 ℃，發(fā)酵5 d。發(fā)酵完成后，測(cè)定樣品粗纖維含量。

1.3.3.4 發(fā)酵溫度對(duì)粗纖維含量的影響 改變發(fā)酵溫度（24、28、32、36、40 ℃），固定料水比1:1，總接種量10%，混菌接種比例1:1，發(fā)酵5 d。發(fā)酵完成后，測(cè)定樣品粗纖維含量。

1.3.3.5 發(fā)酵時(shí)間對(duì)粗纖維含量的影響 改變發(fā)酵時(shí)間（3、4、5、6、7 d），固定料水比1:1，總接種量10%，混菌接種比例1:1，28 ℃。發(fā)酵完成后，測(cè)定樣品粗纖維含量。

1.3.4 粗纖維含量的測(cè)定參照GB/T 5009.10–2003 《植物類食品中粗纖維的測(cè)定》測(cè)定樣品中粗纖維含量。

1.3.5 響應(yīng)面優(yōu)化試驗(yàn)設(shè)計(jì)綜合考慮單因素試驗(yàn)結(jié)果，選取對(duì)粗纖維含量影響明顯的發(fā)酵溫度（A）、發(fā)酵時(shí)間（B）、混菌接種比例（C）為考察變量，以粗纖維含量為響應(yīng)值（Y），設(shè)計(jì)3 因素3水平響應(yīng)面優(yōu)化試驗(yàn)。對(duì)發(fā)酵條件進(jìn)行優(yōu)化，確定最佳發(fā)酵工藝條件，響應(yīng)面優(yōu)化試驗(yàn)因素水平見表1。

表1 響應(yīng)面試驗(yàn)因素與水平

1.4 數(shù)據(jù)處理

結(jié)果均為試驗(yàn)重復(fù)3 次得出。采用響應(yīng)面分析軟件Design Expert 11.0 的Box-Behnken進(jìn)行試驗(yàn)設(shè)計(jì)和數(shù)據(jù)分析，IBM SPSS Statistics 25.0 軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理，Origin 8.0 軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)的統(tǒng)計(jì)分析，統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性差異為P＜0.05。

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素試驗(yàn)結(jié)果

2.1.1 料水比對(duì)粗纖維含量的影響由圖1 可知，隨著料水比的增大，樣品中粗纖維的含量呈先下降后上升的趨勢(shì)。當(dāng)料水比為1:0.75～1:1.5，粗纖維含量隨著料水比的增大而減少；在料水比為1:1.5 時(shí)，粗纖維含量達(dá)到最小值，為36.80%；當(dāng)料水比超過(guò)1:1.5，粗纖維含量隨著料水比的增大而增加。原因可能是當(dāng)料水比為1:0.75 時(shí)，培養(yǎng)基中水分過(guò)少，黑曲霉與產(chǎn)朊假絲酵母中只有少部分正常生長(zhǎng)繁殖，大部分因缺少水分無(wú)法存活；隨著料水比的增加，培養(yǎng)基中水分增多，培養(yǎng)基的環(huán)境越來(lái)越適宜黑曲霉和產(chǎn)朊假絲酵母的生存，可產(chǎn)生較多纖維素酶對(duì)樣品中的纖維素分解；但料水比超過(guò)1:1.5 后，培養(yǎng)基中水分過(guò)多，抑制了黑曲霉和產(chǎn)朊假絲酵母的生長(zhǎng)，無(wú)法產(chǎn)生足量的纖維素酶來(lái)分解樣品中的纖維素。料水比為1:0.75～1:1.75 時(shí)，樣品中粗纖維含量變化不顯著，1:1.5 時(shí)樣品中粗纖維含量最低。綜合考慮，選擇鐵核桃餅粕發(fā)酵的最佳料水比為1:1.5。

圖1 料水比對(duì)粗纖維含量的影響

2.1.2 總接種量對(duì)粗纖維含量的影響由圖2 可知，隨著總接種量的增大，樣品中粗纖維含量呈先下降后上升的趨勢(shì)?？偨臃N量為4%～13%時(shí)，粗纖維含量隨著總接種量的增大而減少；總接種量為13% 時(shí)，粗纖維含量達(dá)到最小值，為36.10% ；當(dāng)總接種量超過(guò)13%，粗纖維含量隨著總接種量的增大而增加。原因可能是總接種量逐漸增大，培養(yǎng)基中接入黑曲霉和產(chǎn)朊假絲酵母的量變多，產(chǎn)生纖維素酶的量也隨之增加。但當(dāng)總接種量高于13%，由于培養(yǎng)基里營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)是固定的，接入的黑曲霉和產(chǎn)朊假絲酵母的量過(guò)多，導(dǎo)致營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)不足，限制其生長(zhǎng)繁殖，無(wú)法生產(chǎn)足量的纖維素酶分解樣品中的纖維素。總接種量為4%～16% 時(shí)樣品中粗纖維含量變化不顯著，13% 時(shí)粗纖維含量最小。綜合考慮，選擇鐵核桃餅粕發(fā)酵的最佳總接種量為13%。

圖2 接種量對(duì)粗纖維含量的影響

2.1.3 混菌接種比例對(duì)粗纖維含量的影響由圖3 可知，隨著混菌接種比例的改變，樣品中粗纖維含量呈先下降后上升的趨勢(shì)，不同的接種比例對(duì)發(fā)酵樣品中粗纖維含量的影響不同。當(dāng)混菌接種比例為3:1～2:1，對(duì)粗纖維含量影響不顯著（P＞0.05）；3:1～2:1 時(shí)，隨接種比例的增大纖維素含量顯著降低（P＜0.05）；超過(guò)1:1 后，纖維素含量隨接種比例的增大而增加。黑曲霉與產(chǎn)朊假絲酵母體積比為1:1 時(shí)，樣品中粗纖維含量達(dá)到最小值，為35.10%。綜合考慮，選擇黑曲霉、產(chǎn)朊假絲酵母的接種比例為2:1、1:1、1:2 進(jìn)行后續(xù)的響應(yīng)面優(yōu)化試驗(yàn)。

圖3 混菌接種比例對(duì)粗纖維含量的影響

2.1.4 發(fā)酵溫度對(duì)粗纖維含量的影響由圖4 可知，隨著溫度的升高，樣品中的粗纖維含量呈先下降后上升的趨勢(shì)。當(dāng)溫度為24～28 ℃時(shí)，粗纖維含量隨溫度升高而顯著減少（P＜0.05）；28 ℃時(shí)，粗纖維含量達(dá)到最小值，為35.05% ；28～32 ℃時(shí)，粗纖維含量顯著增加（P＜0.05）；溫度高于32 ℃后，含量呈緩慢增長(zhǎng)趨勢(shì)。原因可能是黑曲霉適于在28 ℃進(jìn)行生長(zhǎng)，此條件下，黑曲霉產(chǎn)生大量的纖維素酶對(duì)原料中的纖維素進(jìn)行分解。過(guò)低（＜28 ℃）或過(guò)高（＞28 ℃）溫度下，黑曲霉生長(zhǎng)速度減慢，產(chǎn)纖維素酶的能力下降，導(dǎo)致樣品中粗纖維含量增加。綜上所述，24～32 ℃的溫度條件下，樣品中粗纖維含量變化顯著（P＜0.05），因此選擇24、28、32 ℃進(jìn)行后續(xù)響應(yīng)面優(yōu)化試驗(yàn)。

圖4 發(fā)酵溫度對(duì)粗纖維含量的影響

2.1.5 發(fā)酵時(shí)間對(duì)粗纖維含量的影響由圖5 可知，隨著發(fā)酵時(shí)間的延長(zhǎng)，樣品中的粗纖維含量呈先下降后上升的趨勢(shì)。當(dāng)時(shí)間為3～6 d 時(shí)，粗纖維含量隨著發(fā)酵時(shí)間的延長(zhǎng)而減少；發(fā)酵時(shí)間在6 d 時(shí)，粗纖維含量達(dá)到最小值，為34.55%；當(dāng)發(fā)酵時(shí)間超過(guò)6 d 后，粗纖維含量再次增多。原因可能是發(fā)酵在6 d 前，黑曲霉和產(chǎn)朊假絲酵母剛適應(yīng)環(huán)境，生長(zhǎng)繁殖速度逐漸加快，產(chǎn)生的纖維素酶越來(lái)越多，所以樣品中粗纖維含量隨著時(shí)間延長(zhǎng)而減少；6 d 時(shí)黑曲霉和產(chǎn)朊假絲酵母生長(zhǎng)繁殖最旺，產(chǎn)纖維素酶最多，此時(shí)樣品中粗纖維含量最少；發(fā)酵時(shí)間過(guò)長(zhǎng)（＞6 d），培養(yǎng)基中的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)消耗殆盡，黑曲霉和產(chǎn)朊假絲酵母開始逐漸衰亡，無(wú)法再產(chǎn)生纖維素酶來(lái)分解樣品中的纖維素。綜上所述，5～7 d 時(shí)樣品中粗纖維含量變化顯著（P＜0.05），因此選擇5、6、7 d 進(jìn)行后續(xù)響應(yīng)面優(yōu)化試驗(yàn)。

圖5 響應(yīng)曲面圖

圖5 發(fā)酵時(shí)間對(duì)粗纖維含量的影響

2.2 響應(yīng)面優(yōu)化試驗(yàn)結(jié)果

2.2.1 響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)與結(jié)果以發(fā)酵溫度（A）、發(fā)酵時(shí)間（B）、混菌接種比例（C）為自變量，粗纖維含量（Y）為響應(yīng)值，采用Design Expert 11.0 軟件優(yōu)化鐵核桃餅粕發(fā)酵的最優(yōu)工藝參數(shù)，試驗(yàn)結(jié)果見表2。經(jīng)回歸擬合得到發(fā)酵溫度、發(fā)酵時(shí)間、接種比例的二次多元回歸方程 為：Y=32.28–0.2388A-0.1800B+0.0838C-0.0150AB+0.0375AC-0.1850BC+1.88A2+0.842 7B2+0.5102C2。

表2 響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果

由表3 可知，在模型中F=92.77，P＜0.0001，模型差異性極度顯著，說(shuō)明方程與實(shí)際情況的擬合良好。失擬項(xiàng)F=6.41，P=0.0523，失擬項(xiàng)差異不顯著（P＞0.05），說(shuō)明模型與試驗(yàn)因素?cái)M合良好。在回歸方程方差分析結(jié)果中，相關(guān)系數(shù)（R2）越大，表明實(shí)際值與模型預(yù)測(cè)值之間的相關(guān)性越高，本試驗(yàn)中R2=0.9917，說(shuō)明該回歸方程擬合程度較高，試驗(yàn)誤差小（楊宗玲等，2021 ；江成英等，2021）。校正系數(shù)R2Adj=0.981，表明該模型可以解釋98.1%的數(shù)據(jù)變化（劉月等，2018）。綜上所述，以發(fā)酵樣品中粗纖維含量為響應(yīng)值所建立的鐵核桃餅粕發(fā)酵工藝模型合理，可用該模型和方程優(yōu)化鐵核桃餅粕發(fā)酵工藝參數(shù)。

表3 響應(yīng)面二次模型方差分析

模型結(jié)果中F值越大，影響作用越強(qiáng)（Wang等，2018 ；Alara 等，2018）。各因素F值大小表明，發(fā)酵溫度對(duì)發(fā)酵樣品中粗纖維含量的影響極顯著（P＜0.01），發(fā)酵溫度對(duì)發(fā)酵樣品中粗纖維含量的影響顯著（P＜0.05）。3 個(gè)因素對(duì)發(fā)酵樣品中粗纖維含量的影響大小排序?yàn)椋喊l(fā)酵溫度（A）＞發(fā)酵時(shí)間（B）＞混菌接種比例（C），二次項(xiàng)A2、B2、C2均極顯著（P＜0.01）。

2.2.2 因素交互作用分析在其他試驗(yàn)因素固定的情況下，考察各因素及兩因素交互對(duì)響應(yīng)值的影響以獲得最佳發(fā)酵工藝條件。通過(guò)Box-Behnken 試驗(yàn)結(jié)果可得到響應(yīng)面曲線圖，響應(yīng)曲線能直觀反映各因素對(duì)發(fā)酵樣品中粗纖維含量的影響，曲線越陡峭，影響程度越大。

由圖5a 可知，發(fā)酵溫度與發(fā)酵時(shí)間相比，發(fā)酵溫度的曲線更陡峭；發(fā)酵溫度與混菌接種比例相比，發(fā)酵溫度的曲線更陡峭（圖5b）；發(fā)酵時(shí)間與混菌接種比例相比，發(fā)酵時(shí)間的曲線更陡峭（圖5c）。說(shuō)明發(fā)酵溫度對(duì)發(fā)酵樣品中粗纖維含量的影響最大，其次是發(fā)酵時(shí)間，混菌接種比例對(duì)粗纖維含量的影響最小。響應(yīng)曲面圖中，交互作用項(xiàng)發(fā)酵溫度和發(fā)酵時(shí)間的曲線最陡峭，說(shuō)明兩者交互作用對(duì)發(fā)酵樣品中粗纖維含量的影響最為明顯，各交互因素對(duì)發(fā)酵樣品中粗纖維含量的影響大小排序?yàn)椋篈B＞AC＞BC，這與表3 分析結(jié)果一致。

2.2.3 最佳發(fā)酵工藝條件確定通過(guò)軟件利用Box-Behnken 試驗(yàn)結(jié)果并對(duì)回歸方程最值進(jìn)行求解，得到模型極值點(diǎn)，即發(fā)酵溫度28.259 ℃、發(fā)酵時(shí)間6.100 d、接種比例1:0.99 時(shí)，Y 值最小，為32.26%。為驗(yàn)證結(jié)果是否可靠，結(jié)合實(shí)際操作的可行性，以發(fā)酵溫度28 ℃、發(fā)酵時(shí)間6 d、接種比例1:1 為鐵核桃餅粕最佳發(fā)酵工藝。此條件下進(jìn)行3 次平行試驗(yàn)，粗纖維平均含量為32.07%。該結(jié)果實(shí)際值與預(yù)測(cè)值相近（相差0.19%），說(shuō)明基于Box-Behnken 響應(yīng)面試驗(yàn)所得模型回歸方程具有可靠性，可用于鐵核桃餅粕發(fā)酵飼料研究。

3 結(jié)論

本研究以鐵核桃餅粕為主要原料，黑曲霉和產(chǎn)朊假絲酵母雙菌種組合進(jìn)行固態(tài)發(fā)酵，采用響應(yīng)面分析法對(duì)發(fā)酵工藝進(jìn)行優(yōu)化。料水比、總接種量、混菌接種比例、發(fā)酵溫度、發(fā)酵時(shí)間均對(duì)粗纖維含量產(chǎn)生影響。選取發(fā)酵溫度、發(fā)酵時(shí)間和接種比例3 個(gè)顯著影響的因素，以粗纖維含量為響應(yīng)值，進(jìn)行Box-Behnken 試驗(yàn)設(shè)計(jì)與分析。試驗(yàn)結(jié)果表明，交互作用項(xiàng)發(fā)酵溫度和發(fā)酵時(shí)間對(duì)發(fā)酵樣品中粗纖維含量的影響最為明顯，各因素對(duì)發(fā)酵樣品中粗纖維含量的影響順序依次為發(fā)酵溫度＞發(fā)酵時(shí)間＞混菌接種比例。優(yōu)化后確定最佳的發(fā)酵工藝條件為：發(fā)酵溫度28 ℃、發(fā)酵時(shí)間6 d、接種比例1:1，在此條件下，發(fā)酵樣品中粗纖維含量為32.07%，與發(fā)酵前相比降低了9.01%。該結(jié)果為鐵核桃餅粕發(fā)酵飼料的進(jìn)一步開發(fā)與研究提供了新的思路和理論基礎(chǔ)。