羅學(xué)群,朱 琪,周 航,黃朝霞,廖光炯,張文平,杜世章,熊先華,王金玲,花東來(lái)*

(1.綿陽(yáng)師范學(xué)院資源環(huán)境工程學(xué)院,四川綿陽(yáng) 621000;2.綿陽(yáng)師范學(xué)院生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院/大熊貓國(guó)家公園岷山生物多樣性監(jiān)測(cè)分析實(shí)驗(yàn)室,四川綿陽(yáng) 621000;3.北川羌族自治縣國(guó)有林場(chǎng),四川綿陽(yáng) 622700;4.大熊貓國(guó)家公園綿陽(yáng)管理分局,四川綿陽(yáng) 621000;5.四川小寨子溝國(guó)家級(jí)自然保護(hù)區(qū)管理處,四川綿陽(yáng) 622750)

0 引言

斑尾榛雞(Tetrastessewerzowi),屬于雞形目松雞科榛雞屬鳥(niǎo)類,是中國(guó)特有鳥(niǎo)類,主要分布于青海、甘肅、四川、云南西南部和西藏東部高海拔的山林中[1].由于自然形成的斑塊生境、氣候變化以及人為干擾,斑尾榛雞的棲息地出現(xiàn)嚴(yán)重破碎化,其適宜區(qū)域面積呈現(xiàn)遞減趨勢(shì)[2].再加上狩獵、天敵、寄生蟲(chóng)等多種因素,斑尾榛雞種群數(shù)量急劇減少,被中國(guó)瀕危動(dòng)物紅皮書(shū)列為“瀕?！兵B(niǎo)類[3].斑尾榛雞的模式物種來(lái)自甘肅蓮花山,由王香亭等[4]發(fā)現(xiàn)并記錄,初步研究了斑尾榛雞活動(dòng)規(guī)律、食性、繁殖習(xí)性、天敵等.斑尾榛雞的研究區(qū)域也多在蓮花山保護(hù)區(qū)內(nèi)[1],其次是青藏高原地區(qū)[5],對(duì)四川王朗國(guó)家級(jí)自然保護(hù)區(qū)的斑尾榛雞健康狀況方面的研究鮮有涉及[6-7].由于腸道菌群與宿主的健康和習(xí)性關(guān)系密切[8],因此,為了更好地保護(hù)斑尾榛雞,本文以王朗自然保護(hù)區(qū)作為研究地點(diǎn),分析斑尾榛雞菌群特征,以期為因地制宜制定該物種管理和保護(hù)策略提供科學(xué)依據(jù).

1 材料和方法

1.1 糞便樣品收集

研究組在查閱相關(guān)資料并在巡山人員的指引下,于2022—2023年通過(guò)糞便形狀等特征對(duì)小寨子、王朗兩個(gè)保護(hù)區(qū)進(jìn)行了疑似斑尾榛雞糞便樣品的收集工作,共采集了7份樣品,其中小寨子三份,王朗竹根岔兩份,王朗回頭線溝和白沙溝各一份.取樣時(shí),為避免交叉污染均戴有一次性無(wú)菌薄膜手套,采集的糞便放入50 mL無(wú)菌離心管中,再倒入無(wú)水乙醇淹沒(méi)整個(gè)糞便,運(yùn)輸回實(shí)驗(yàn)室后低溫保存.

1.2 糞便宿主物種鑒定

QIAamp? Fast DNA Stool Mini Kit (Qiagen,德國(guó))可有效減少細(xì)菌DNA的含量,增加宿主DNA的濃度.因此采用該試劑盒進(jìn)行糞便DNA提取用于宿主物種鑒定,具體步驟參照該試劑盒說(shuō)明書(shū),最后溶于50 μL試劑盒自帶的TE緩沖液中.

然后用引物(Forward:5’>ATGAAGGGATGTTCTACTGGTTG<3’;Reverse:5’>AACATCTCCGCATGATGAA<3’)擴(kuò)增鳥(niǎo)類的Cytb序列,目的片段長(zhǎng)度為1200 bp[9-10].PCR擴(kuò)增在40 μL反應(yīng)混合液中進(jìn)行:2×T8 High-Fidelity Mast 20 μL, Forward primer (10 μM) 2 μL, Reverse primer (10 μM) 2 μL, DNA模板2 μL, ddH2O 14 μL.PCR反應(yīng)條件是:預(yù)變性98 ℃ 2 min,變性98 ℃ 10 s,退火55 ℃ 15 s,延伸72 ℃ 15 s,最后總延伸72 ℃ 5 min,4 ℃ 保溫,共37次循環(huán).PCR產(chǎn)物在北京擎科生物科技股份有限公司成都分公司進(jìn)行測(cè)序.最后將得到的序列上傳到NCBI進(jìn)行blastn分析.在比對(duì)結(jié)果中,將在NCBI上比對(duì)得到的同源性在99%以上且同源度最高的、排序靠前的、物種信息明確的物種作為鑒定的參考物種.

1.3 糞便樣品菌群分析

為提高腸道菌群DNA的純度,采用PowerFecal? DNA Isolation Kit(MOBIO,美國(guó))進(jìn)行糞便菌群DNA提取.將大約0.25 g樣品加入到試劑盒提供的PowerBead Tubes中,其余步驟參照試劑盒,最后采用DNA溶解液(試劑盒配備)溶解DNA,并將DNA濃度調(diào)整到50 ng/μL.

糞便菌群分析采用細(xì)菌的16S rRNA V3-4的通用引物338F(5’>ACTCCTA CGGGAGGCAGCA<3’)、806R(5’>GGACTACHVGGGTWTCTAAT<3’)[11].總體積為30 μL的PCR反應(yīng)體系為:2×reaction buffer (KOD FX Neo Buffer)15 μL,KOD FX Neo 0.6 μL, dNTP(2.0 mM each)6 μL,Forward primer(10 μM)0.9 μL,Reverse primer(10 μM)0.9 μL,DNA Template 1 μL,ddH2O 5.6 μL.PCR反應(yīng)條件是:預(yù)變性98 ℃ 2 min,變性 98 ℃ 30 s,退火 50 ℃ 30 s,延伸 72 ℃ 60 s,最后延伸72 ℃ 5 min,4 ℃ 保溫,共30次循環(huán).PCR產(chǎn)物的建庫(kù)及測(cè)序在北京擎科生物科技股份有限公司進(jìn)行,采用illumina Novaseq 6000 PE250進(jìn)行測(cè)序.

每份樣品的原始數(shù)據(jù)下機(jī)通過(guò)去除接頭和barcode,然后進(jìn)行質(zhì)量篩查得到高質(zhì)量的序列.同時(shí),從NCBI上下載了50份來(lái)自紅原雞的糞便菌群16S rDNA v3-4的數(shù)據(jù)[12]用于本研究.

對(duì)得到的雙端序列采用QIIME2(版本號(hào)2021.2,https://qiime2.org)[13]進(jìn)行分析,包括利用FLASH軟件(版本號(hào)1.2.7)[14]進(jìn)行配對(duì)連接,重疊區(qū)域的堿基長(zhǎng)度大于10 bp,且不允許錯(cuò)配;采用DADA2的流程進(jìn)行質(zhì)控和feature輸出結(jié)果(100%相似度);feature的分類信息采用SILVA參考數(shù)據(jù)庫(kù)(version 138)[15].菌群的α和β多樣性分析采用QIIME2流程,數(shù)據(jù)的可視化基于在線網(wǎng)站https://view.qiime2.org進(jìn)行.組間菌群差異分析采用Wen[16]的方法,可視化基于該文獻(xiàn)提供的edgeR火山圖流程.

2 結(jié)果

2.1 糞便宿主鑒定

糞便DNA宿主的Cytb序列顯示小寨子的1個(gè)樣品來(lái)自綠尾虹雉;王朗的1個(gè)樣品來(lái)自紅喉雉鶉,2個(gè)樣品來(lái)自斑尾榛雞;剩下的3個(gè)樣品由于提取的糞便宿主DNA擴(kuò)增失敗而不能鑒定物種.其中,在王朗竹根岔采集的糞便樣品雖然Cytb擴(kuò)增失敗,但其糞便形態(tài)與已經(jīng)確認(rèn)來(lái)自斑尾榛雞的比較相似,兩樣品采集點(diǎn)間距在5 m左右,因此該樣品也來(lái)自斑尾榛雞,有較高可信度(見(jiàn)討論部分).這樣來(lái)自王朗的3份樣品用于本研究的斑尾榛雞菌群分析.

2.2 王朗斑尾榛雞腸道菌群組成

對(duì)下機(jī)序列進(jìn)行拼接、質(zhì)控、去除低質(zhì)量序列和嵌合體后,3個(gè)樣本共獲得194 296條合格的16S rDNA序列,每個(gè)樣本的有效序列數(shù)48 704～76 068條.基于100%相似度的feature稀釋性曲線顯示各個(gè)樣本曲線均趨向平坦(圖1),說(shuō)明測(cè)序所得序列能夠完全展示各個(gè)樣品細(xì)菌群落多樣性,可以進(jìn)行后續(xù)分析.

王朗斑尾榛雞細(xì)菌群落分屬31個(gè)門.表1顯示了門水平的細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)組成,其中豐度占比小于0.01的物種歸為others.結(jié)果顯示王朗斑尾榛雞菌群主要的門類為變形菌門(Proteobacteria)、放線菌門(Actinobacteriota)、厚壁菌門(Firmicutes)、藍(lán)細(xì)菌門(Cyanobacteria)、擬桿菌門(Bacteroidota)、酸桿菌門(Acidobacteriota)等.王朗斑尾榛雞還有大量的未分類的菌群,平均相對(duì)豐度為11.7%,在樣本W(wǎng)Z07F中高達(dá)33.7%.

在屬分類水平上共檢測(cè)到的細(xì)菌覆蓋了582個(gè)細(xì)菌屬,如表2所示,所有樣本中豐度占比小于0.01的物種歸為others,占比為2.9%～34.6%.結(jié)果顯示平均相對(duì)豐度占比前10的優(yōu)勢(shì)屬為Pseudomonas、Escherichia_Shigella、unclassified_Cyanobacteriales、Paenibacillus、unclassified_Muribaculaceae、Sporosarcina、unclassified_Lachnospiraceae、uncultured_Bacteroidales_bacterium、Lachnospiraceae_NK4A136_group和Lactobacillus.同時(shí),大量的序列不能歸入已知屬,表2中的名稱前加-unclassified來(lái)表示,這顯示王朗斑尾榛雞中有大量的未知菌群.

斑尾榛雞菌群的α多樣性結(jié)果顯示其多樣性覆蓋度均高于99%,表明測(cè)序結(jié)果覆蓋度較好且具有很高的可信度.三個(gè)樣本的Chao 1和ACE指數(shù)與觀察到的feature數(shù)一樣(圖2A).Shannon指數(shù)和Simpson指數(shù)反映群落分布多樣性,Shannon指數(shù)越大、Simpson指數(shù)越小,說(shuō)明群落多樣性越高.本研究中樣本W(wǎng)Z07F的Shannon指數(shù)最高,而其Simpson與WZ08F比較接近.等級(jí)豐度曲線可直觀地反映樣本中物種的豐富度和均勻度,三個(gè)樣本中,樣本W(wǎng)Z07F等級(jí)豐度曲線在橫軸上的跨度最大,因此該樣品菌群的豐富度最高;同時(shí),該樣本在垂直方向上曲線最平緩,因此其菌群分布較均勻.

圖2 王朗斑尾榛雞腸道菌群alpha多樣性(A和B)和等級(jí)豐度曲線(C)Fig.2 The Alpha diversity results (A and B) and Rank Abundance Curve (C) of gut bacteria of Wanglang grouse

2.3 王朗斑尾榛雞腸道菌群與紅原雞的差異分析

以Puetz[12]發(fā)表的紅原雞菌群作為對(duì)照,用于評(píng)估王朗斑尾榛雞菌群組成的多樣性和健康情況.為了比較群體之間的菌群差異,只在一個(gè)樣本中出現(xiàn)的feature被過(guò)濾,同時(shí)序列數(shù)少于3的低豐度菌群也被過(guò)濾,這樣總共1 238個(gè)feature用于比較紅原雞和斑尾榛雞之間的菌群差異.紅原雞和斑尾榛雞菌群alpha多樣性指標(biāo),包括Pielou evenness,Richness和Shannon,差異并不顯著(P>0.05).基于Bray-Curtis距離、Jaccard指數(shù)、Unweighted UniFrac距離和Weighted UniFrac距離的主成分分析(PCoA)顯示紅原雞和王朗斑尾榛雞的菌群差異顯著(圖3).Bray-Curtis距離和Weighted UniFrac距離未能區(qū)分紅原雞和斑尾榛雞(圖3A和3D),但Jaccard指數(shù)和Unweighted UniFrac距離均顯著將這兩個(gè)物種的菌群分開(kāi)(permanova-pairwise,p<0.001)(圖3B和3C),表明王朗斑尾榛雞與紅原雞的菌群差異主要在于稀有菌群上.圖4顯示了紅原雞和斑尾榛雞菌群的菌群差異情況,圖中標(biāo)注了差異最大的5個(gè)feature,其中斑尾榛雞富集的feature分別屬于大腸桿菌志賀菌屬(Escherichia-Shigella)、假單胞菌屬(Pseudomonas)和節(jié)桿菌屬(Arthrobacter),紅原雞富集的feature分別屬于羅斯氏菌屬(Romboutsia)和乳酸桿菌屬(Lactobacillus).

(A) Bray-Curtis距離(B) Jaccard指數(shù)(C)Unweighted UniFrac 距離(D)Weighted UniFrac 距離圖3 紅原雞和王朗斑尾榛雞腸道菌群主成分分析(PCoA)Fig.3 the PCoA results of gut bacteria of Wanglang grouse and red junglefowl in this study

圖4 紅原雞和王朗斑尾榛雞腸道菌群差異分析火山圖Fig.4 The volcano map of gut bacteria difference analysis between red roosters and Wanglang grouse

3 討論

本研究在2023年2月和5月對(duì)王朗自然保護(hù)區(qū)斑尾榛雞主要活動(dòng)區(qū)域竹根岔、白沙溝、回頭線溝進(jìn)行了采樣.經(jīng)過(guò)Cytb序列鑒定,發(fā)現(xiàn)白沙溝WB07F樣品和竹根岔采集的WZ07F樣品鑒定為斑尾榛雞,而回頭線溝的樣品鑒定為紅喉雉鶉(Tetraophasisobscurus).來(lái)自竹根岔的另外一個(gè)樣本W(wǎng)Z08F由于提取的宿主DNA量太少未能通過(guò)物種鑒定,該樣本與WZ07F樣本采集點(diǎn)距離較近且糞便形態(tài)相似.由于斑尾榛雞的遷徙能力較弱且成群活動(dòng),因此WZ08F有很大可能也來(lái)自斑尾榛雞.

食性、年齡和季節(jié)均會(huì)影響鳥(niǎo)類腸道菌群的多樣性.以昆蟲(chóng)為食物的大山雀腸道菌群以變形菌門、厚壁菌門和軟壁菌門為主,而以種子為食物的個(gè)體腸道菌群以變形菌門、軟壁菌門和藍(lán)細(xì)菌門為主[17].王娟[18]等綜述了不同食性野生鳥(niǎo)類的腸道微生物特征,研究發(fā)現(xiàn)植食性鳥(niǎo)類食物組成較為單一,腸道微生物多樣性相對(duì)較低,以變形菌門、放線菌門和厚壁菌門為主,而雜食性鳥(niǎo)類腸道微生物因食物組成多樣,主要以厚壁菌門、變形菌門、擬桿菌門、放線菌門為主.從目前的研究結(jié)果來(lái)看,大多數(shù)研究表示斑尾榛雞是植食性鳥(niǎo)類,主要以柳、榛的鱗芽、葉和云杉種子以及其他植物的花、花序、葉、嫩枝梢為食[4,19],但仍有斑尾榛雞覓食昆蟲(chóng)的報(bào)道,比如斑尾榛雞取食小毛蟲(chóng)、偽步行蟲(chóng)、金花蟲(chóng)等,在5—7月的繁殖季節(jié),雌性斑尾榛雞也經(jīng)常食用無(wú)脊椎動(dòng)物(主要是螞蟻)[19-20].本研究結(jié)果顯示王朗地區(qū)斑尾榛雞腸道優(yōu)勢(shì)菌門含有變形菌門、厚壁菌門、擬桿菌門、放線菌門等(表1),這個(gè)結(jié)果與莫麒穎[17]的發(fā)現(xiàn)一致.根據(jù)王娟等[18]的結(jié)果,我們推測(cè)王朗地區(qū)的斑尾榛雞屬于雜食性.

紅原雞的腸道菌群作為對(duì)照用于評(píng)估王朗斑尾榛雞的腸道菌群健康狀況.結(jié)果顯示,與紅原雞菌群相比,斑尾榛雞富集的菌包括大腸桿菌志賀菌屬(Escherichia-Shigella)、假單胞菌屬(Pseudomonas)和節(jié)桿菌屬(Arthrobacter)(圖4).志賀氏菌屬和假單胞菌屬是腸道機(jī)會(huì)致病菌,其豐度增高可導(dǎo)致微生態(tài)失調(diào),因此與消化道的多種疾病密切相關(guān)[21].節(jié)桿菌屬細(xì)菌大多存在于環(huán)境中,可以降解諸多苯衍生物、多環(huán)芳烴、N-雜環(huán)化合物等環(huán)境有機(jī)污染物[22],但其在宿主體內(nèi)的作用還鮮有報(bào)道.而紅原雞中富集的菌包括羅斯氏菌屬(Romboutsia)和乳酸桿菌屬(Lactobacillus)(圖4)有助于維持腸道微生態(tài)平衡、抵抗疾病[23].因此,相對(duì)于紅原雞,斑尾榛雞腸道微生態(tài)失調(diào)的風(fēng)險(xiǎn)更高.有研究發(fā)現(xiàn)幼鳥(niǎo)和成年鳥(niǎo)的腸道微生物組差異較大[24].因此,為了更好地分析王朗地區(qū)斑尾榛雞的菌群特征,還需要開(kāi)展更廣泛的研究工作,包括收集不同季節(jié)和不同年齡斑尾榛雞的糞便樣品.

盡管本研究只有三份樣本來(lái)自斑尾榛雞,但這三份樣本來(lái)自王朗保護(hù)區(qū)的2個(gè)斑尾榛雞主要分布地,因此在一定程度上反應(yīng)了王朗保護(hù)區(qū)斑尾榛雞的菌群情況,為后續(xù)大規(guī)模研究奠定了堅(jiān)實(shí)的基礎(chǔ).