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豬精液凍存技術(shù)研究進(jìn)展

2023-12-06 17:06:54陳昱光李云香李劍南雷安民
關(guān)鍵詞:精漿豬種精液

陳昱光,李云香,王 嬋,李劍南,賀 鑫,雷安民

(西北農(nóng)林科技大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)院,陜西楊凌 712100)

根據(jù)美國農(nóng)業(yè)部(USDA)發(fā)布的數(shù)據(jù)顯示,2021年世界生豬存欄量為74928萬頭,比2020年上升了15.16%;世界豬肉產(chǎn)量為10 610萬t,與2020年相比上升10.81%;預(yù)計(jì)在未來的幾年里,生豬的需求量將繼續(xù)增長。為了滿足市場的需求,除了擴(kuò)大養(yǎng)殖規(guī)模外,對(duì)豬種進(jìn)行不斷地改良更應(yīng)是努力的方向,在相同的養(yǎng)殖規(guī)模下,優(yōu)良的豬種飼料轉(zhuǎn)化率高、出肉率高,這意味著減少了過量的飼料需求和糞便產(chǎn)生對(duì)環(huán)境的負(fù)面影響[1]。作為可以幫助生豬養(yǎng)殖業(yè)改良生豬性狀、提高生產(chǎn)效益、維護(hù)生豬遺傳多樣性的關(guān)鍵輔助技術(shù),豬精液的冷凍保存一直是研究的重點(diǎn)和難點(diǎn)。

相較于液體保存的精液,冷凍保存的精液具有生物安全性、使用的靈活性以及國際貿(mào)易的優(yōu)勢,因此在理想情況下,冷凍保存的精液是豬授精的第一選擇。此外,豬精子的冷凍保存技術(shù)也是長期保留高價(jià)值遺傳資源的關(guān)鍵技術(shù)。但在豬冷凍保存精液的使用中發(fā)現(xiàn),復(fù)蘇后精子存活率較低、質(zhì)量較差,這導(dǎo)致了在實(shí)際生產(chǎn)中出現(xiàn)授精率低、每胎產(chǎn)仔數(shù)達(dá)不到正常標(biāo)準(zhǔn)等問題,同時(shí)由于冷凍復(fù)蘇后精子受損的影響,也難以保證能否完整保存優(yōu)良種畜的性狀,因此大大妨礙了冷凍保存技術(shù)在實(shí)際生產(chǎn)中的應(yīng)用[2]。

1 豬凍精技術(shù)的應(yīng)用現(xiàn)狀

1.1 人工授精

人工授精是目前應(yīng)用最廣泛的豬育種技術(shù),在發(fā)達(dá)國家育種方案中的應(yīng)用率達(dá)90%以上[3]。最常用于人工授精的是液體儲(chǔ)存的精液(包括低溫保存的精液或鮮精),其繁殖性能較好,繁殖率高于90%,每頭授精成功的母豬活產(chǎn)仔數(shù)可達(dá)到12頭以上,與自然交配后獲得的效果相似。

人工授精也可以用冷凍保存的豬精子,盡管冷凍復(fù)蘇后精液的受精能力要比液體儲(chǔ)存的精液低得多。由于豬精子細(xì)胞膜成分的特殊性,導(dǎo)致其冷凍復(fù)蘇后豬精子復(fù)蘇率和質(zhì)量遠(yuǎn)低于牛、羊等其他大型牲畜,因此難以在生產(chǎn)上得到廣泛應(yīng)用。制約豬精液凍存技術(shù)發(fā)展關(guān)鍵因素在于,目前冷凍復(fù)蘇機(jī)制豬精子損傷的機(jī)制并不完善,因此難以針對(duì)化的改良豬精液凍存配方[4]。

目前,養(yǎng)豬業(yè)的人工授精主要依賴于液體儲(chǔ)存的精液。雖然冷凍精子在某些情況下也被使用,但全球豬基因交換的主要方法仍是通過活體動(dòng)物的運(yùn)輸。運(yùn)輸活體動(dòng)物的成本相對(duì)較高,還需要花費(fèi)疾病預(yù)防測量等相關(guān)檢疫費(fèi)用,這限制了豬遺傳信息在全球范圍內(nèi)的交換。而通過運(yùn)輸冷凍保存的豬精液,可以將成本和風(fēng)險(xiǎn)降至最低。

1.2 凍精技術(shù)

目前已有公司建立了豬精子冷凍保存的商品化方案,針對(duì)主流豬種,可以使復(fù)蘇后精子活率達(dá)到76%~85%,但其妊娠率和每窩仔豬數(shù)量仍達(dá)不到鮮精的標(biāo)準(zhǔn),不足以在生產(chǎn)實(shí)際中進(jìn)行大范圍應(yīng)用,特別是中國地方豬種,其凍精復(fù)蘇后存活率往往不足40%,這對(duì)我國的育種保種進(jìn)程有一定的限制[5]。同時(shí)研究發(fā)現(xiàn)公豬之間個(gè)體的差異性對(duì)復(fù)蘇后精子活力和質(zhì)量影響顯著。收集并冷凍長白豬的精液時(shí),觀察到存在30%公豬的精液在復(fù)蘇后表現(xiàn)出非常低的活力。此外,即使是同一頭豬,在不同的時(shí)間、年齡、季節(jié)對(duì)其精液的冷凍保存,復(fù)蘇后也觀察到精液質(zhì)量存在顯著差異。

1.3 種質(zhì)資源的交換與保護(hù)

長期以來的市場需求決定了生豬養(yǎng)殖業(yè)對(duì)于料重比高、生長速度快、瘦肉率高的豬種的追求,導(dǎo)致了養(yǎng)殖企業(yè)對(duì)于品種豬的盲目引進(jìn)與雜交利用,極不利于豬種遺傳資源的保存與生態(tài)多樣性的維護(hù)。探索出優(yōu)良的豬精子冷凍技術(shù)與方案,能夠大大降低優(yōu)良品種豬的引進(jìn)成本,同時(shí)也可以有效保存現(xiàn)有的各類豬種的種質(zhì)資源。因此,豬凍精技術(shù)的建立,是加強(qiáng)全國豬種遺傳資源保護(hù)、引進(jìn)優(yōu)良豬種及優(yōu)良種豬育種的必要手段,是保證全國養(yǎng)豬業(yè)持續(xù)發(fā)展的基礎(chǔ)和必要條件。

2 豬精子損傷機(jī)制的研究

2.1 凍融致豬精子損傷

冷凍復(fù)蘇過程包括一系列可能改變細(xì)胞結(jié)構(gòu)的步驟,會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞膜受損、膽固醇流失、獲能樣變化以及DNA碎片化,還可能破壞二硫鍵導(dǎo)致核蛋白結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性降低[9]。除了冷凍介質(zhì)、溫度和滲透壓變化引起的負(fù)面影響外,冷凍復(fù)蘇過程還會(huì)造成細(xì)胞內(nèi)ROS失衡,引發(fā)脂質(zhì)過氧化,使細(xì)胞發(fā)生凋亡樣變化和DNA氧化損傷[10]。此外,凍融過程會(huì)破壞線粒體等細(xì)胞器,降低這些細(xì)胞器的活性,從而影響精子活力[11]。線粒體損傷也增加了活性氧的產(chǎn)生,且造成活性氧水平的升高程度因物種而異。

豬精子經(jīng)歷凍融后還會(huì)導(dǎo)致精子內(nèi)肌動(dòng)蛋白、絲裂霉素和溶質(zhì)載體家族成員等關(guān)鍵蛋白的再分配和重新定位;損害膜離子通道相關(guān)蛋白的功能;并改變特定精子蛋白的酪氨酸磷酸化模式。

2.2 豬精子對(duì)ROS損傷敏感

與新鮮精液相比,低溫保存(17℃)的豬精子和冷凍豬精子的受精能力較低。這是由于處理過程中的化學(xué)和物理變化,會(huì)影響細(xì)胞內(nèi)氧化平衡。豬精子內(nèi),高水平ROS產(chǎn)生的病理效應(yīng)的關(guān)鍵要點(diǎn)是造成不飽和脂肪酸(PUFAs)的過氧化[13]。研究表明,豬精子的質(zhì)膜上富含不飽和脂肪酸,當(dāng)大量的碳碳鍵被ROS氧化就造成了精子內(nèi)脂質(zhì)過氧化反應(yīng),這將直接導(dǎo)致豬精子凋亡樣變化的出現(xiàn)[13]。

精子耐低溫性與質(zhì)膜的組成直接相關(guān),特別是膽固醇/磷脂比率和磷脂部分飽和脂肪酸的豐度,因?yàn)檫@些成分決定了精子的膜流動(dòng)性。例如,牛精子比豬精子表現(xiàn)出更高的彈性,這歸因于牛精子中較高的膽固醇/磷脂比率(牛:0.45,野豬:0.26)和較低的蛋白質(zhì)/磷脂比率(牛:0.80,野豬:1.26)[13]。豬精子細(xì)胞膜上含有大量的不飽和脂肪酸,更易在冷凍應(yīng)激誘導(dǎo)的ROS代謝紊亂作用下發(fā)生脂質(zhì)過氧化級(jí)聯(lián)反應(yīng),導(dǎo)致細(xì)胞膜損傷并發(fā)生鐵死亡,因此,豬精子質(zhì)膜容易不穩(wěn)定,易失去選擇通過性,允許Ca2+、碳酸氫鹽和培養(yǎng)基成分進(jìn)入胞內(nèi)[13],破壞細(xì)胞內(nèi)穩(wěn)態(tài),促進(jìn)蛋白質(zhì)和mRNA的降解,降低精子的存活率[14]。

2.3 可能存在的調(diào)控機(jī)制

根據(jù)研究顯示,細(xì)胞死亡過程通常受到不同基因的調(diào)控;例如,參與凋亡調(diào)控的一些關(guān)鍵基因是Caspases、TP53、FAS、BCL-2和BAX。調(diào)控鐵死亡的基因包括GPx4、Nrf2、LSH、TFR1和SLC7A11。細(xì)胞壞死受到LEF1、RIP1和RIP3的調(diào)控,最后,自噬進(jìn)程受到ATG5、ATG7、DRAM3和TFEB基因的調(diào)控[14]。因此,針對(duì)性的用細(xì)胞死亡相應(yīng)調(diào)控基因的激活或抑制劑可以有效誘導(dǎo)或抑制細(xì)胞死亡進(jìn)程。

近年來的研究發(fā)現(xiàn),冷凍復(fù)蘇所導(dǎo)致的細(xì)胞膜脂質(zhì)過氧化失控與細(xì)胞鐵死亡過程聯(lián)系密切,是鐵死亡過程的重要一環(huán)。以往的研究通常會(huì)將凍存復(fù)蘇與豬精子凋亡聯(lián)系到一起,但最近的研究顯示,凍存復(fù)蘇并未引起豬精子內(nèi)DNA片段化和Caspase激活等凋亡現(xiàn)象[15],且凋亡抑制劑并不能緩解豬精子凍存損傷,但鐵死亡抑制劑可以有效抑制膜脂質(zhì)過氧化和精子死亡,或可以考慮冷凍復(fù)蘇過程誘導(dǎo)了豬精子細(xì)胞鐵死亡發(fā)生的可能性。

2.4 蛋白質(zhì)組學(xué)與生物標(biāo)志物制

精子功能驗(yàn)證的黃金標(biāo)準(zhǔn)是使卵子成功受精并發(fā)育為可存活的胚胎。想要準(zhǔn)確判斷冷凍精子的生殖潛能,需要更好地了解精子的功能。精子功能調(diào)控的分子機(jī)制對(duì)于優(yōu)化冷凍精子處理方式和維持其生育能力至關(guān)重要。大多數(shù)與受精相關(guān)的分子機(jī)制都依賴于蛋白質(zhì)的功能,這使得蛋白質(zhì)組學(xué)成為生殖生物學(xué)中最強(qiáng)大的研究工具。因此,對(duì)精液蛋白質(zhì)組學(xué)的研究是了解精子功能生物學(xué)和分析受精能力受損原因的必要條件。導(dǎo)致冷凍豬精子受精能力受損的潛在分子機(jī)制還不明確,精液蛋白質(zhì)組學(xué)在解決這一挑戰(zhàn)中可以發(fā)揮關(guān)鍵作用[29]。

精液蛋白,無論是來自精漿還是精子,都是衡量精子功能和生育能力潛在的生物標(biāo)志物,因?yàn)樗鼈冊谏婕暗骄庸δ苌飳W(xué)的相關(guān)分子途徑中發(fā)揮著關(guān)鍵作用。精液蛋白的任何定性和定量的改變都可能導(dǎo)致精子受精能力的喪失。研究發(fā)現(xiàn)頂體蛋白、纖維連接蛋白、熱休克蛋白和電壓依賴的陰離子通道蛋白水平與精子的低溫耐受性呈正相關(guān)[16],而和三磷酸異構(gòu)酶的蛋白水平呈負(fù)相關(guān)[29]。此外,評(píng)估冷凍保存對(duì)整個(gè)精子蛋白質(zhì)組的影響也是優(yōu)化冷凍過程的必要條件。最近發(fā)表的兩項(xiàng)比較新鮮和冷凍復(fù)蘇公豬精子蛋白質(zhì)組學(xué)的研究顯示,在新鮮精子和冷凍精子之間鑒定出41個(gè)定量不同的蛋白質(zhì),以及32個(gè)在超低溫保存過程經(jīng)歷相關(guān)豐度變化的蛋白質(zhì)[17]。這些結(jié)果清楚地表明,低溫保存重塑了公豬精子的相應(yīng)蛋白質(zhì),這也與其他物種哺乳動(dòng)物中進(jìn)行的研究結(jié)論相符合[18]。以上的結(jié)果都為冷凍精子受損機(jī)制的研究提供了潛在的標(biāo)志物。當(dāng)然,在這些發(fā)現(xiàn)應(yīng)用于該領(lǐng)域之前,必須進(jìn)行相應(yīng)的驗(yàn)證,包括蛋白質(zhì)印記(Western blot,WB)、ELISA等,以確保所鑒定的蛋白質(zhì)可以作為可靠的生物標(biāo)志物。

3 豬精子冷凍技術(shù)改善手段

3.1 前期處理時(shí)間

有研究表明,精子在收集后不立即冷凍,冷凍保存的結(jié)果會(huì)更好。冷凍前在15~17℃孵育持續(xù)3 h以上能夠優(yōu)化凍存效果,而這種優(yōu)化處理的最佳時(shí)間段是10~24 h[19]。這一時(shí)期可以通過平衡或維持精子的脂質(zhì)結(jié)構(gòu),從而有助于質(zhì)膜的穩(wěn)定。但精子在該時(shí)期變得更耐低溫的詳細(xì)機(jī)制仍未闡明,研究人員推測與熱應(yīng)激相關(guān)的精子蛋白(如熱休克蛋白70)的磷酸化有關(guān)。

3.2 抗氧化劑

迄今為止,許多研究證實(shí)了在冷凍介質(zhì)中補(bǔ)充抗氧化劑可以抵消ROS對(duì)精子的負(fù)面影響?,F(xiàn)階段絕大多數(shù)的研究集中于在豬精子冷凍介質(zhì)中添加合成或天然抗氧化劑,這的確對(duì)維持豬精子功能產(chǎn)生了積極的作用。在整個(gè)精子冷凍復(fù)蘇的步驟中,精子會(huì)在每個(gè)不同的溫度變化階段,包括從室溫至17℃(冷凍前孵育階段)、17℃至4℃(冷卻步驟結(jié)束,冷凍步驟開始前)、從冷凍狀態(tài)至37℃(解凍后),重新達(dá)到熱平衡狀態(tài),在此過程中精子所處的液體環(huán)境和處理時(shí)間也有所不同,因此在開發(fā)新的精子冷凍復(fù)蘇策略時(shí),可以考慮在孵育液、解凍液以及授精培養(yǎng)基也添加抗氧化劑來進(jìn)一步優(yōu)化方案[20]。

3.3 冷凍保護(hù)劑

可滲透性冷凍保護(hù)劑有甘油、二甲基亞砜、乙二醇、甲醇、丙二醇和二甲基乙酰胺等[21]。其中甘油是豬精子的最佳滲透性冷凍保護(hù)劑,其最佳作用濃度在2%~3%之間[6]。蛋黃和乳糖則是最常見的不滲透性冷凍保護(hù)劑,用作豬精子的冷凍延長劑。在蛋黃提取物中發(fā)現(xiàn)的磷脂可以防止精子發(fā)生冷休克和Ca2+內(nèi)流,而蛋黃的低密度脂蛋白部分表現(xiàn)出最好的低溫保護(hù)功能。此外,使用表面活性劑,如 Orvus ES Paste,可以促進(jìn)蛋黃蛋白與質(zhì)膜的相互作用,當(dāng)與蛋黃共用時(shí)可以改善精子冷凍效果[22]。但需要注意的是冷凍保護(hù)劑在常溫下會(huì)對(duì)細(xì)胞的存活起到不利的影響,所以通常會(huì)在4℃平衡階段加入以減少毒害作用。

3.4 精漿

通常精漿會(huì)在冷凍保存前被移除,因?yàn)檠芯咳藛T認(rèn)為精漿的存在會(huì)降低精子復(fù)蘇后的存活率。然而,并不是所有來自精漿的蛋白質(zhì)都對(duì)精子有害。有研究指出僅去除低分子量蛋白質(zhì)(12~14 ku)可改善冷凍保存效果,而添加精漿中部分物質(zhì)至冷凍介質(zhì)中可增加冷凍精子的活力和膜完整性[23]。

復(fù)蘇后加入精漿是否對(duì)精子有利存在對(duì)立的結(jié)果。一些研究人員指出,精漿對(duì)復(fù)蘇后精子活力和膜完整性有積極影響,也有研究結(jié)果表明加入精漿后精子頂體和膜完整性下降[24]。這種矛盾的結(jié)果同樣也出現(xiàn)在對(duì)復(fù)蘇精子生殖性能的研究中,有研究表明復(fù)蘇后添加精漿可提高精子生殖性能[25],而另外一些研究則顯示這種處理無明顯差異甚至有不利影響。這些矛盾的結(jié)果可能歸因于添加精漿的比例,因?yàn)樘砑?0%的精漿(復(fù)蘇后4 h精子活力30%)效果明顯比添加10%精漿(復(fù)蘇后4 h精子活力20%)要更好[25]。

3.5 凍精的儲(chǔ)存

雖然檢測同批次冷凍效果好和效果差的豬精液后發(fā)現(xiàn)其脂質(zhì)過氧化水平和復(fù)蘇后ROS總量沒有顯著差異,但有報(bào)道稱液氮存儲(chǔ)會(huì)增加細(xì)胞內(nèi)的ROS水平,這可能會(huì)對(duì)低溫保存樣品的壽命造成影響[26]。Li J等分別對(duì)冷凍儲(chǔ)存2年,4年和8年的同一批豬精液質(zhì)量進(jìn)行評(píng)估,并與早期復(fù)蘇結(jié)果(冷凍后15 d)進(jìn)行比較。與冷凍后15 d復(fù)蘇的精子樣本相比,冷凍儲(chǔ)存4或8年的精子樣品中總精子活力有所下降。值得注意的是,研究結(jié)果表明多于2年的冷凍儲(chǔ)存時(shí)間會(huì)對(duì)豬精子運(yùn)動(dòng)能力造成不利影響,因此在做人工授精時(shí)需要額外增加精液數(shù)量[26]。

4 討論

目前用冷凍復(fù)蘇的公豬精子進(jìn)行人工授精多是作為品種改良的手段在養(yǎng)殖場中小范圍使用[27]。豬精子冷凍保存的主要優(yōu)點(diǎn)是可以儲(chǔ)存來自優(yōu)良性狀公豬的遺傳物質(zhì);構(gòu)建種質(zhì)庫以防自然災(zāi)害(如豬瘟導(dǎo)致的大面積撲殺)所造成的遺傳信息丟失;并且相較于鮮精和活體運(yùn)輸,冷凍保存的豬精子極大地促進(jìn)了優(yōu)良豬種遺傳信息在國際之間交流的同時(shí),也具備更高的生物安全性[28]。相信在不久的將來,冷凍保存的精子在實(shí)踐生產(chǎn)中可以得到更廣泛的應(yīng)用。

最新的研究進(jìn)展顯示,冷凍復(fù)蘇的豬精子進(jìn)行人工授精后的生育結(jié)果已經(jīng)得到了改善,但迄今為止,最先進(jìn)的凍精技術(shù)依然避免不了低溫保存對(duì)精子本身的負(fù)面影響,人工授精后效果達(dá)不到鮮精的標(biāo)準(zhǔn)。這主要是凍存致豬精子損傷的分子機(jī)制仍不明確所導(dǎo)致[29],未來豬精子凍存技術(shù)的改進(jìn),除了于冷凍精子所處液體環(huán)境中添加抗氧化劑外,或可將目光對(duì)準(zhǔn)于凍存致精子細(xì)胞死亡的相關(guān)機(jī)理研究以及利用蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)闡明凍精受損的潛在分子機(jī)制上來。

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