金曉媚 ，何杰艷 ，施吉昌 ，邢 輝 ，王 洪 ，張 桔 ，董莉娟 ，黃麗花 ，陳 敏 ，陳志娟 ，陳會超

（1）云南省疾病預(yù)防控制中心性病艾滋病防制所，云南 昆明 650022;2）昆明醫(yī)科大學(xué)公共衛(wèi)生學(xué)院，云南 昆明 650500;3）大理白族自治州疾病預(yù)防控制中心艾滋病性病防治科，云南 大理 671000;4）中國疾病預(yù)防控制中心性病艾滋病預(yù)防控制中心病毒及免疫研究室，北京 102206）

隨著我國艾滋病抗病毒治療（antiretroviral therapy，ART）有效開展和覆蓋面的增加，顯著降低了我國HIV/AIDS 的死亡率[1]，但長期、大范圍的ART 導(dǎo)致了HIV-1 耐藥株的出現(xiàn)和流行。耐藥株的產(chǎn)生是導(dǎo)致抗病毒治療失敗的一個關(guān)鍵因素，耐藥株的傳播導(dǎo)致原發(fā)性耐藥的發(fā)生，給臨床治療中選擇藥物的過程帶來巨大的考驗，因此需要將ART 前基線耐藥是否會對ART 效果產(chǎn)生影響納入考慮范圍內(nèi)。2014 年世界衛(wèi)生組織提出了治療前耐藥監(jiān)測的指南[2]，在以往耐藥傳播和耐藥發(fā)生監(jiān)測的基礎(chǔ)上，重點關(guān)注治療前的耐藥水平，該監(jiān)測中包括首次治療的人群和停藥再治療的人群，可以綜合反映一個地區(qū)耐藥傳播和耐藥發(fā)生的累計效應(yīng)對治療效果的潛在影響，也被用來作為是否需要采取公共衛(wèi)生應(yīng)對措施的一個指標，如更換不含NNRTI 類藥物的一線治療方案。到2017 年底大理州存活 HIV/AIDS 共7 386人，其中6 203 人已接受抗病治療。目前還沒有學(xué)者對大理州進行過較為全面的治療前耐藥調(diào)查。此研究旨在調(diào)查大理州長期進行ART 后，起始ART 的人群中病毒基因型和耐藥株的流行水平，為該地區(qū)提供科學(xué)依據(jù)，以便于更好地控制HIV-1 耐藥毒株傳播。

1 對象與方法

1.1 研究對象

采用橫斷面調(diào)查方法，招募大理州2018 年1～8 月，年齡≥18 歲，起始抗病毒治療的HIV/AIDS，包括首次治療和停藥后又重新接受治療的HIV/AIDS 患者。在取得書面知情同意后，進行流行病學(xué)信息的收集，包括被調(diào)查者的年齡、性別、婚姻狀況、教育水平、感染途徑、既往抗病毒治療歷史以及CD4+T 淋巴細胞計數(shù)。采集EDTA 抗凝全血樣本，將其分離并存儲在-80 ℃的條件下。本研究經(jīng)云南省生物醫(yī)學(xué)倫理審查委員會批準。

1.2 實驗室檢測

按照標準操作程序，使用凱杰生物技術(shù)（上海）有限公司的QIAsymphony SP，全自動核酸提取儀，從每個血漿樣本中提取HIV-1 病毒RNA，樣本體積為140 μL，采用in-house 方法，通過巢式PCR 對HIV-1 pol 區(qū)基因序列進行擴增，對應(yīng)HXB2 的位置為2253-3553，引物序列和PCR 反應(yīng)程序詳見以前的文獻[1]。在中國CDC 性病艾滋病預(yù)防控制中心病毒免疫研究室完成了HIV-1 RNA 提取和pol 基因區(qū)擴增。使用1%瓊脂糖凝膠電泳對PCR 產(chǎn)物條帶進行觀察，后將陽性樣品送至北京賽諾基因組研究中心有限公司純化和測序。測序引物見已發(fā)表的文獻[3]。

1.3 亞型鑒定和耐藥分析

成功獲取了序列后筆者采用Gene Codes 公司的Sequencher 5.1 軟件進行了序列拼接，多序列比對和序列整理使用的是Bioedit 軟件。為獲得HIV-1 的亞型或重組型，筆者使用了Mega 6.0 軟件來構(gòu)建Neighbor-Joining（NJ）系統(tǒng)進化樹，接著利用Bootstrap 值大于70%的標準來鑒定HIV-1的亞型或重組型。重組分析采用了HIV 數(shù)據(jù)庫提供的RIP 3.0 分析工具進行深入研究。（http://www.hiv.lanl.gov）。并且借助斯坦福大學(xué)（http://hivdb.stanford.edu）的HIVdb 數(shù)據(jù)庫對所得序列進行耐藥位點和耐藥程度的判斷，耐藥程度分為敏感、潛在耐藥、低度耐藥、中度耐藥和高度耐藥。具體判定為耐藥的條件是在2014 年WHO 治療前耐藥監(jiān)測指南[2]推薦的12 種監(jiān)測藥物中，至少有1 種以上的藥物顯示出低度以上的耐藥性。

1.4 統(tǒng)計學(xué)處理

運用SPSS 21.0 軟件進行統(tǒng)計學(xué)分析。采用例數(shù)、比例或構(gòu)成比（%）描述計數(shù)資料，人口學(xué)特征和HIV-1 基因型分布的比較采用χ2檢驗。雙側(cè)檢驗，以P＜0.05 為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 研究對象人口學(xué)特征

2018 年1～8 月在大理州收集初始抗病毒治療的HIV/AIDS 患者122 例，采集血液樣品用于HIV-1 pol 區(qū)基因擴增，測序后得到滿足耐藥分析的pol 區(qū)基因序列樣品共114 份。

獲得pol 區(qū)基因序列的114 份樣品中，111 例（97.4%）為初始治療，3 例（2.6%）為停藥后重新入組治療，無既往預(yù)防服藥和母嬰阻斷的病例。男女性別比例為1.6∶1；平均年齡43 歲（19～78 歲）；漢族占74.6%（85/114），其他民族占25.4%（29/114）?；橐鰻顩r，未婚者占21.9%（25/114），已婚者占70.2%（80/114），離異/喪偶者占7.9%（9/114）。異性性傳播是主要傳播途徑，占81.6%（93/114），同性性傳播占9.6%（11/114），注射吸毒傳播占8.8%（10/114），見表1。艾滋病患者在所有研究對象中占到33.3%（38/114）。

表1 2018 年大理州初始抗病毒治療的HIV/AIDS 人口學(xué)特征基本情況Tab.1 Demographic characteristics of the subjects

2.2 HIV-1 基因型分布特征

研究對象中存在7 種HIV-1 的基因型，按照從高到低的順序排列，構(gòu)成比如下：CRF08_BC（59.6%，68/114）、CRF07_BC（25.4%，29/114）、CRF01_AE（7.0%，8/114）、URFs（4.4%，5/114）、CRF85_BC（1.8%，2/114）、C 亞型（0.9%，1/114）、CRF55_01B（0.9%，1/114）。在URFs 中，主要為BC 重組，占60%（3/5），其他包括CRF01_AE/B（20%，1/5）和CRF01_AE/BC（20%，1/5）。

HIV-1 基因型在性別、民族、婚姻狀況和CD4+T 淋巴細胞計數(shù)的分布上差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞ 0.05），而在年齡和感染途徑的分布，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05），見表2。CRF08_BC 在注射吸毒傳播和異性性傳播中均有分布，在同性性傳播中未檢測到，分布差異有統(tǒng)計學(xué)意義（χ2=15.495，P≤ 0.001；χ2=11.667，P=0.001）；CRF01_AE 則主要分布在性傳播人群中，且同性性傳播人群中比例較異性性傳播人群中高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（χ2=8.991，P=0.003）。在年齡分布中，CRF08_BC 主要分布在31 歲以上年齡組中，在 ≤ 30 歲年齡組中比例較低，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（χ2=4.970，P=0.026）；而CRF01_AE 主要分布于 ≤ 30 歲年齡組，同31 歲以上年齡組中分布相比差異有統(tǒng)計學(xué)意義（χ2=23.270，P≤ 0.001）。

表2 2018 年大理州初始抗病毒治療的HIV/AIDS 中HIV-1 基因型分布情況[n（%）]Tab.2 Demographic characteristics and genotype distribution of the subjects [n（%）]

2.3 治療前HIV-1 耐藥情況

在獲得基因序列的114 例樣品中，25 例（21.9%，25/114）攜帶耐藥突變位點，其中1 例（0.9%，1/114）攜帶核苷類反轉(zhuǎn)錄酶抑制劑（NRTIs）的耐藥位點，耐藥位點為M41L，針對齊多夫定（AZT）和司他夫定（D4T）低度耐藥；22 例（19.3%，22/114）攜帶非核苷類反轉(zhuǎn)錄酶抑制劑（NNRTIs）的耐藥位點，但只有1 例出現(xiàn)低度以上耐藥，所攜耐藥位點K103N，V108I，H221Y 對依非韋倫（EFV）和奈韋拉平（NVP）高度耐藥；2 例（1.8%，2/114）攜帶蛋白酶抑制劑（PI）的耐藥位點，均為耐藥敏感。比例較高的突變位點E138A（9.6%，11/114）和V179D/E（9.6%，11/114）均為輔助耐藥突變位點，獨立存在不引起耐藥，按照WHO 治療前耐藥監(jiān)測的耐藥判斷標準，HIV-1 耐藥率為1.8%（2/114），其 中NRTIs 耐藥率為0.9%（1/114），NNRTIs 耐藥率為0.9%（1/114），見表3。

表3 大理州HIV/AIDS 抗病毒治療前HIV-1 耐藥位點與耐藥程度 [n（%）]Tab.3 HIV-1 resistance sites and degree of resistance before antiretroviral therapy [n（%）]

3 討論

本研究結(jié)果顯示大理州HIV/AIDS 中HIV-1基因型主要以CRF08_BC 為主，其次是CRF07_BC 和CRF01_AE，這和既往監(jiān)測數(shù)據(jù)一致[4-7]，表明大理州自HIV-1 流行以來，CRF08_BC 仍然是當?shù)刈钪饕腍IV-1 流行株。但近年來，大理州也發(fā)現(xiàn)了少量的獨特型重組形式（unique recombinant forms，URFs）和其它流行重組形式（circulating recombinant forms，CRFs）。本次調(diào)查發(fā)現(xiàn)了5 例URFs（4.4%，5/114）和2 例CRFs（1.8%，2/114），其中URFs 中以BC 重組常見。

大理州HIV-1 基因型在傳播途徑中的構(gòu)成存在差異，表現(xiàn)為異性性傳播和注射吸毒傳播中以CRF08_BC 為主，同性性傳播中以CRF07_BC 和CRF01_AE 為主，這與云南省總體的流行特征一致[8-9]。URFs 在注射吸毒、同性性傳播和異性性傳播人群中分布差異無統(tǒng)計學(xué)意義，BC 重組仍主要存在于注射吸毒人群，表明該地區(qū)基因型重組變異僅在小范圍的人群中通過不同感染途徑產(chǎn)生。2 例CRFs 主要存在于異性性傳播人群中，包括最早在中國東部地區(qū)的MSM 中鑒定出來的CRF55_01B[10]和流行于四川省南部地區(qū)的CRF85_BC[11]，前者從2015 年起就在大理州有少量報道但并未形成大量流行，后者則是新鑒定出的流行重組型，其流行模式較獨特，主要流行于異型性傳播的50歲及以上人群，異性性傳播（尤其是商業(yè)性傳播）是驅(qū)動CRF85_BC 流行起來的重要因素[12]。而本次調(diào)查的2 例基因型為CRF85_BC 的HIV/AIDS年齡均在50 歲左右，并且都曾經(jīng)有過商業(yè)性行為，提示應(yīng)加強對當?shù)?0 歲及以上年齡高風(fēng)險人群的安全性教育和HIV 流行病學(xué)監(jiān)測。

為評估一線抗病毒治療方案中藥物的有效性，2014 年WHO 發(fā)布了治療前耐藥監(jiān)測指南。治療前耐藥監(jiān)測的對象包括初始治療和停藥后重新入組治療的HIV/AIDS。因此治療前耐藥既受耐藥傳播的影響，也受耐藥發(fā)生的影響[13]。根據(jù)推薦的方法，在一些中低收入國家開展的治療前耐藥監(jiān)測顯示治療前耐藥流行率已經(jīng)超過10%。其中治療前耐藥流行率增高主要是因為NNRTIs 耐藥的顯著上升。最近WHO 耐藥監(jiān)測報告顯示在30 個國家中，21 個對NNRTIs 類藥物EFV 和NVP 的耐藥水平已經(jīng)超過了10%[13]。根據(jù)治療前耐藥監(jiān)測指南，一旦治療前NNRTIs 的耐藥率超過10%，就需要采取公共衛(wèi)生干預(yù)措施，或者通過治療前耐藥檢測指導(dǎo)抗病毒治療方案的選擇。為應(yīng)對NNRTIs 耐藥升高，2019 年WHO 更新了抗病毒治療指南，推薦使用含整合酶抑制劑DTG 聯(lián)合NRTI 的骨干藥物作為治療HIV/AIDS 的首選一線治療方案[14]。

本研究中97.4%的研究對象為初始治療，僅3 例為停藥后重新入組治療，無既往預(yù)防服藥和母嬰阻斷的病例。這3 例研究對象中均未檢測到耐藥突變位點。監(jiān)測結(jié)果顯示，本地治療前耐藥總體上處于低流行水平，目前的抗病毒治療方案還是有效的，尚不需要啟動公共衛(wèi)生的應(yīng)對措施。另外從以往新近感染人群監(jiān)測的結(jié)果來看，云南省耐藥傳播水平總體也處于低度水平[15]。

在檢測到的耐藥突變中，E138A 和V179D/E的比例較高，但這2 個突變均為輔助耐藥突變位點。E138A 是一個多態(tài)性的耐藥基因突變位點，在未治療患者中的流行率在1%～6%之間，還存在亞型間的差異，在A 亞型和C 亞型中E138A 的突變較高[16]。E138A 突變能夠降低利匹韋林（RPV）和依曲韋林（ETR）敏感性2 倍[17]，導(dǎo)致對RPV 和ETR 輕度耐藥，但這2 種藥物都不屬于WHO 治療前耐藥監(jiān)測的藥物[14]，也不在我國免費抗病毒治療方案中的一線治療方案。本研究顯示E138A位點突變主要在CRF08_BC 中檢測到，與之前其他地區(qū)的研究一致[18-19]，考慮E138A 突變?yōu)镃RF08_BC 病毒的多態(tài)性位點。V179D/E 單獨存在僅引起潛在耐藥，通常作為輔助耐藥突變調(diào)節(jié)其他NNRTIs耐藥突變的效應(yīng)。

目前感染者在治療前都未進行基因型耐藥的檢測，因此攜帶耐藥基因的HIV/AIDS 在抗病毒治療中出現(xiàn)的耐藥性或藥物壓力選擇會導(dǎo)致更多耐藥突變的產(chǎn)生，進而造成傳播。因此需要進一步加強耐藥監(jiān)測，及時評估我國免費抗病治療的效果，特別是應(yīng)該關(guān)注NNRTIs 的耐藥。因為NNRTIs 的耐藥遺傳屏障低，容易引起多個獨立性的NNRTIs 耐藥位點產(chǎn)生，高度耐藥合并嚴重的交叉耐藥可以由單個或雙個主要突變引發(fā)[20]。作為我國HIV 抗病毒治療的一線藥物，NNRTIs的高耐藥率對ART 的治療有效性具有潛在的影響。

本研究存在一些局限性。首先筆者并未獲得所有納入本研究調(diào)查對象的HIV 基因序列，提取和擴增失敗可能是由于樣本儲存運輸條件受限導(dǎo)致病毒RNA 降解。其次研究調(diào)查周期較短及樣本數(shù)受限，導(dǎo)致可能無法完全準確地反映大理州2018 年HIV/AIDS 中病毒基因型的種類和HIV-1抗病毒治療前耐藥的流行水平。

綜上所述，大理州HIV/AIDS 中病毒基因型較復(fù)雜，與云南省主要HIV-1 基因型流行一致，治療前耐藥尚處于低度水平，但從全球的耐藥發(fā)展規(guī)律來看，仍需要加強HIV 耐藥監(jiān)測工作，以維持治療前耐藥的低度流行水平及時掌握耐藥基因突變的數(shù)據(jù)，適時選擇和調(diào)整一線抗病毒治療方案，保證公共衛(wèi)生抗病毒治療策略的有效維持。