馬 紀(jì)，孔玄慶，喻 快，歐陽(yáng)文森，李雨露，金晨鐘，郭 軍，李建明，歐曉明,*

（1.湖南人文科技學(xué)院/農(nóng)田雜草防控技術(shù)與應(yīng)用協(xié)同創(chuàng)新中心，湖南婁底 417000；2.湖南化工研究院國(guó)家農(nóng)藥創(chuàng)制工程研究中心/湖南省農(nóng)用化學(xué)品重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，湖南長(zhǎng)沙 410014；3.湖南化研院檢測(cè)技術(shù)有限公司，湖南長(zhǎng)沙 410014）

甲基嘧啶磷(Pirimiphos-methyl)是1974年英國(guó)帝國(guó)化學(xué)工業(yè)集團(tuán)開發(fā)的一種低毒、高效、低殘留的嘧啶類有機(jī)磷殺蟲殺螨劑[1]，屬于膽堿酯酶（ChE）抑制劑，其致毒機(jī)理為阻抑昆蟲神經(jīng)突觸上乙酰膽堿酯酶（AchE）的活性，引起乙酰膽堿（ACh）蓄積，使膽堿神經(jīng)受到持續(xù)沖動(dòng)，導(dǎo)致害蟲持續(xù)興奮后死亡[2-4]。常被用于糧食倉(cāng)儲(chǔ)防蟲，是聯(lián)合國(guó)糧農(nóng)組織和世界衛(wèi)生組織推薦使用的儲(chǔ)糧防護(hù)劑[5]。目前對(duì)甲基嘧啶磷的研究主要集中在合成開發(fā)和復(fù)配[6]、倉(cāng)儲(chǔ)防效[7-8]、殘留[9-10]、分析方法開發(fā)[11]及廢水處理[12]。甲基嘧啶磷在農(nóng)藥登記中均為衛(wèi)生殺蟲劑或用于倉(cāng)儲(chǔ)殺蟲，其除了對(duì)倉(cāng)儲(chǔ)害蟲具有很好的防效外，還對(duì)田間害蟲具有一定的活性，可進(jìn)行甲基嘧啶磷農(nóng)藥登記使用范圍的擴(kuò)大研究。有研究表明[13]，有機(jī)磷農(nóng)藥噴灑后一般只有10%～20%的藥液在作物上附著，剩余大部分均殘存在土壤、水和大氣中，之后隨著降水、沉降和徑流的沖刷而進(jìn)入地下水和江河湖泊中，進(jìn)而對(duì)水生生物造成影響。因此，有必要研究甲基嘧啶磷對(duì)水生生物的毒性效應(yīng)，從而更加全面、可靠地評(píng)價(jià)甲基嘧啶磷的環(huán)境安全性。

目前常用于污染物毒性評(píng)價(jià)的水生生物主要有藻類、溞類和魚類。藻類作為水生生態(tài)系統(tǒng)的初級(jí)生產(chǎn)者，是評(píng)價(jià)水環(huán)境質(zhì)量和污染物生態(tài)毒性的關(guān)鍵生物，如被研究者廣泛應(yīng)用到水環(huán)境毒理試驗(yàn)中的斜生柵藻(Scenedesmus obliquus)對(duì)環(huán)境污染程度就有著高度敏銳性[14]。溞類是浮游動(dòng)物的主要構(gòu)成部分，對(duì)水生生態(tài)系統(tǒng)的功能、結(jié)構(gòu)和生物生產(chǎn)力起著至關(guān)重要作用。溞類中研究使用最多的是大型溞(Daphnia magna)，其分布范圍廣，并對(duì)毒物具有較高的敏銳性，因此常用于評(píng)價(jià)水質(zhì)的好壞，是國(guó)際上標(biāo)準(zhǔn)的試驗(yàn)生物[15]。斑馬魚(Brachydanio rerio)具有易培養(yǎng)、繁殖速度快、對(duì)水體污染程度敏感等優(yōu)點(diǎn)，是水生毒性試驗(yàn)的標(biāo)準(zhǔn)試驗(yàn)生物[16]。因此，本研究參照OECD 測(cè)試指南[17-19]和《化學(xué)農(nóng)藥環(huán)境安全評(píng)價(jià)試驗(yàn)準(zhǔn)則》[20]，選擇斜生柵藻、大型溞和斑馬魚3 種位于水生生態(tài)系統(tǒng)中不同營(yíng)養(yǎng)級(jí)的生物進(jìn)行甲基嘧啶磷的急性毒性試驗(yàn)，以此評(píng)價(jià)其對(duì)三種水生生物的毒性等級(jí)，為后續(xù)評(píng)價(jià)甲基嘧啶磷的環(huán)境危害和風(fēng)險(xiǎn)提供理論依據(jù)，并對(duì)其開發(fā)利用具有一定的指導(dǎo)意義。

1 材料與方法

1.1 儀器與試劑

主要儀器：萬(wàn)分之一電子天平（日本島津公司，AUY220型）；高效液相色譜儀（帶二極管陣列檢測(cè)器和化學(xué)工作站，日本島津公司，LC-20A 型）；紫外可見分光光度計(jì)（日本島津，UV-1750 型）；生物顯微鏡（上海光學(xué)儀器廠，XSP-2C-1 型）；便攜式多參數(shù)數(shù)字化分析儀（美國(guó)哈希，HQ40d）；水總硬度測(cè)定儀（上海三信儀表廠，YD200型）。

主要試劑：丙酮（分析純）、吐溫-80（分析純）、磷酸（色譜純），購(gòu)于國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；乙腈（色譜純），由美國(guó)Honeywell 公司生產(chǎn)；90.0%甲基嘧啶磷原藥，由湖南海利化工股份有限公司生產(chǎn)；曝氣24 h 以上的去氯自來(lái)水，由實(shí)驗(yàn)室提供；水生4號(hào)培養(yǎng)基、ISO標(biāo)準(zhǔn)稀釋水根據(jù)《化學(xué)農(nóng)藥環(huán)境安全評(píng)價(jià)試驗(yàn)準(zhǔn)則》[20]配制，現(xiàn)配現(xiàn)用。

1.2 供試生物

大型溞，實(shí)驗(yàn)室自培養(yǎng)，引種自中國(guó)疾病預(yù)防控制中心環(huán)境與健康相關(guān)產(chǎn)品安全所。試驗(yàn)選用室內(nèi)孤雌繁殖3代以上、出生24 h內(nèi)健康活潑的非頭胎溞。

斑馬魚，購(gòu)買于長(zhǎng)沙市湘陽(yáng)水族館。試驗(yàn)前將斑馬魚置于實(shí)驗(yàn)室條件下（光照與黑暗時(shí)間比例為16 h∶8 h，溫度21～24 ℃）馴養(yǎng)7 d以上，馴養(yǎng)期間及時(shí)清除糞便及食物殘?jiān)劳雎试?%以下方可用于試驗(yàn)。在試驗(yàn)項(xiàng)目開展前24 h 停止飼喂，挑選體長(zhǎng)(2.0±1.0)cm健康活潑的個(gè)體用于試驗(yàn)。

斜生柵藻，實(shí)驗(yàn)室自培養(yǎng)，引種于中國(guó)科學(xué)院水生生物研究所淡水藻種庫(kù)，在實(shí)驗(yàn)室條件下使用10%水生4 號(hào)培養(yǎng)基(HB-4)進(jìn)行轉(zhuǎn)接擴(kuò)大培養(yǎng)，使用轉(zhuǎn)接培養(yǎng)3次以上且達(dá)到同步生長(zhǎng)的藻液用于試驗(yàn)。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 藻類生長(zhǎng)抑制毒性試驗(yàn)

根據(jù)預(yù)試驗(yàn)結(jié)果，設(shè)置理論濃度為20.82、29.15、40.82、57.14、80.0 mg·L-1(a.i.)。稱取甲基嘧啶磷原藥，用丙酮溶解后加入吐溫80 攪勻，之后用10%水生4 號(hào)培養(yǎng)液分別稀釋至2 倍設(shè)置濃度，再與藻細(xì)胞濃度為2.00×104個(gè)·mL-1的藻液進(jìn)行1∶1 體積混合后，置于250 mL無(wú)菌三角瓶中，手動(dòng)搖勻，試驗(yàn)中同時(shí)設(shè)置空白對(duì)照和溶劑對(duì)照，各處理配制3 個(gè)重復(fù)。試驗(yàn)藻液搖勻后放入人工氣候箱中培養(yǎng)觀察72 h（設(shè)置溫度為23 ℃，光照與黑暗時(shí)間比例為6 h∶6 h，光強(qiáng)為7 200 lx），每天人工搖勻3～5 次。每間隔24 h 測(cè)定藻液中藻細(xì)胞數(shù)和記錄中毒癥狀，并計(jì)算生長(zhǎng)半抑制濃度EC50。

1.3.2 溞類急性活動(dòng)抑制試驗(yàn)

根據(jù)預(yù)試驗(yàn)結(jié)果，試驗(yàn)采用半靜態(tài)法，每隔24 h更換試驗(yàn)藥液，設(shè)置濃度為7.00×10-3、9.10×10-3、0.011 8、0.015 4、0.02 mg·L-1(a.i.)。稱取甲基嘧啶磷原藥，用丙酮溶解后加入吐溫80 攪勻，然后用ISO 標(biāo)準(zhǔn)稀釋水分別配制成上述濃度，試驗(yàn)過(guò)程中同時(shí)設(shè)置空白對(duì)照組和溶劑對(duì)照組，每處理設(shè)置5 個(gè)重復(fù)，其中4 個(gè)重復(fù)中接入10 只試驗(yàn)用溞，1 個(gè)重復(fù)進(jìn)行水體環(huán)境的檢測(cè)，染毒完成后放入恒溫光照培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)48 h（設(shè)置溫度為20 ℃，全黑暗），每間隔24 h 觀察幼溞的中毒癥狀和記錄受抑制數(shù)，并計(jì)算活動(dòng)半抑制濃度EC50。

1.3.3 魚類急性毒性試驗(yàn)

根據(jù)預(yù)試驗(yàn)結(jié)果，試驗(yàn)采用半靜態(tài)法，每隔24 h更換試驗(yàn)藥液。設(shè)置濃度為0.965、1.16、1.39、1.67、2.0 mg·L-1(a.i.)。稱取甲基嘧啶磷原藥，用丙酮溶解后加入吐溫80攪勻，用去氯處理24 h以上曝氣自來(lái)水稀釋成設(shè)置濃度，分別投入10 尾魚，在水浴溫度為24 ℃，全黑暗的條件下培養(yǎng)96 h，試驗(yàn)同時(shí)設(shè)置空白對(duì)照和溶劑對(duì)照，各處理不設(shè)重復(fù)。每日觀察并記錄各處理中斑馬魚的死亡情況和中毒癥狀，并計(jì)算半致死濃度LC50值。

1.4 藥液濃度質(zhì)量檢測(cè)

為確保試驗(yàn)結(jié)果的準(zhǔn)確可靠，參照張國(guó)生等[21]的分析方法并加以調(diào)整，建立了甲基嘧啶磷在不同試驗(yàn)生物培養(yǎng)溶液體系中的濃度分析方法，并對(duì)該方法進(jìn)行驗(yàn)證。綠藻試驗(yàn)0 h、24 h、48 h、72 h 取樣檢測(cè)，大型溞試驗(yàn)0 h、24 h換藥前、48 h取樣檢測(cè)，斑馬魚試驗(yàn)0 h、24 h換藥前和96 h取樣檢測(cè)。高效液相色譜儀的分析條件為色譜柱：InertSustain C18，250 mm×4.6 mm（i.d）不銹鋼柱，5μm；柱溫：40 ℃；檢測(cè)波長(zhǎng)：254 nm；進(jìn)樣量：20 μL；流速：1.0 mL·min-1；流動(dòng)相：V(甲醇)∶V(純水)＝80∶20。在上述條件下，甲基嘧啶磷的保留時(shí)間約10.4 min；采用外標(biāo)法定量。

1.4.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制

采用萬(wàn)分之一電子天平準(zhǔn)確稱取0.052 4 g 甲基嘧啶磷標(biāo)準(zhǔn)品置于小燒杯中，用甲醇配制成濃度為500 mg·L-1(a.i.)的標(biāo)準(zhǔn)溶液100 mL。再用甲醇稀釋成甲基嘧啶磷0.02、0.05、0.2、0.5、2.0、5.0 mg·L-1(a.i.)濃度的系列標(biāo)準(zhǔn)溶液，取樣上機(jī)檢測(cè)。以峰面積總和y、進(jìn)樣濃度（mg·L-1）x作標(biāo)準(zhǔn)曲線，得到標(biāo)準(zhǔn)曲線方程為y=56 796.43x+554.40（R2=0.999 9），結(jié)果表明甲基嘧啶磷在2個(gè)濃度區(qū)間內(nèi)線性均為良好。

1.4.2 樣品前處理方法

藻試驗(yàn)和魚試驗(yàn)水樣：量取20 mL 試驗(yàn)水樣，轉(zhuǎn)移至50 mL 的離心管中，加入20 mL 乙腈和3 g 氯化鈉，用手劇烈震蕩5 min，然后靜止3 min，取上層乙腈相，過(guò)0.45 μm 濾膜待測(cè)。溞試驗(yàn)水樣：由于對(duì)大型溞急性毒性試驗(yàn)組濃度較低，故需對(duì)水樣進(jìn)行濃縮，量取100 mL 試驗(yàn)水樣，轉(zhuǎn)移至250 mL 的分液漏斗中，加入5.0 g 氯化鈉，分別用50 mL 二氯甲烷萃取3 次，過(guò)無(wú)水硫酸鈉，轉(zhuǎn)移至三角瓶中，旋蒸（50 ℃）濃縮至近干，用2 mL甲醇溶液定容，過(guò)0.45μm濾膜待測(cè)。

1.4.3 添加回收

分別向綠藻培養(yǎng)液、大型溞培養(yǎng)液和曝氣自來(lái)水中添加甲基嘧啶磷標(biāo)準(zhǔn)品配制的溶液，使其濃度分別為0.05、0.1、1.0、10 mg·L-1(a.i.)；0.002 mg·L-1(a.i.)和0.02 mg·L-1(a.i.)；0.05、0.5、5.0 mg·L-1(a.i.)，每個(gè)濃度設(shè)置5個(gè)重復(fù)，上機(jī)檢測(cè)，結(jié)果見表1。綠藻培養(yǎng)液中，添加回收率在92.50%～103.72%范圍內(nèi)，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差分別為0.86%、2.75%、0.63%和0.39%；在大型溞培養(yǎng)液中，添加回收率在82.84%～95.28%，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為1.30%和0.60%；在曝氣自來(lái)水中，添加回收率在97.66%～105.20%，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為1.80%、0.92%和0.41%。本分析方法符合各驗(yàn)證內(nèi)容的質(zhì)量控制要求，可用于分析檢測(cè)甲基嘧啶磷在各基質(zhì)中的濃度。

表1 甲基嘧啶磷添加回收率

1.5 數(shù)據(jù)處理

采用SPSS 16.0統(tǒng)計(jì)軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析處理，根據(jù)質(zhì)量濃度的對(duì)數(shù)和抑制數(shù)/死亡數(shù)進(jìn)行線性擬合，分別計(jì)算甲基嘧啶磷對(duì)斜生柵藻、大型溞、斑馬魚的毒力方程、EC50/LC50及其95%置信限。

2 結(jié)果與分析

2.1 中毒癥狀

在試驗(yàn)周期內(nèi)，各試驗(yàn)條件均符合試驗(yàn)要求。斜生柵藻試驗(yàn)中，為減少光解，將光照時(shí)間進(jìn)行了調(diào)整，采用6 h光照和6 h黑暗交替，溫度范圍為21.2～23.7 ℃，光強(qiáng)為6 881～7 193 lx，pH 值為7.19～8.01；大型溞試驗(yàn)中，試驗(yàn)用水的硬度為141 mg·L-1，試驗(yàn)期間溫度范圍為19.0～21.7 ℃，溶解氧范圍為7.75～8.22 mg·L-1，pH值范圍為7.38～7.61，全黑暗處理；斑馬魚試驗(yàn)中，試驗(yàn)用水的水質(zhì)硬度為107 mg·L-1，溫度范圍為22.0～24.6 ℃，溶解氧范圍為7.58～8.42 mg·L-1，pH值范圍為7.54～8.15，全黑暗處理。

試驗(yàn)期間，3 種供試生物的空白對(duì)照組與溶劑對(duì)照組未出現(xiàn)異常，大型溞和斑馬魚中未出現(xiàn)死亡。斜生柵藻試驗(yàn)中，隨著甲基嘧啶磷濃度升高，藻液中藻細(xì)胞數(shù)量減少，通過(guò)鏡檢觀察可發(fā)現(xiàn)高濃度處理中藻細(xì)胞個(gè)體偏小，72 h 時(shí)觀察發(fā)現(xiàn)高濃度處理中的藻液顏色明顯淺于低濃度，具有明顯的梯度；大型溞試驗(yàn)中，藥劑處理中的大型溞均出現(xiàn)了活動(dòng)抑制的個(gè)體，且抑制數(shù)與藥劑濃度呈正相關(guān)，部分大型溞游動(dòng)遲緩、沉于杯底或漂浮于水面；斑馬魚試驗(yàn)中，主要癥狀表現(xiàn)為活動(dòng)能力變?nèi)?、部分浮于水面游?dòng)且游動(dòng)緩慢，高濃度組中毒斑馬魚部分失去平衡、鰓部充血，試驗(yàn)過(guò)程中斑馬魚死亡數(shù)與染毒濃度呈正相關(guān)。

2.2 毒性效應(yīng)

各試驗(yàn)中藥液的濃度分析結(jié)果見表2。斜生柵藻試驗(yàn)中，每24 h 進(jìn)行藥液濃度檢測(cè)，試驗(yàn)結(jié)束時(shí)，濃度變化率為29.86%～41.11%，因此在數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析中以實(shí)測(cè)濃度的幾何平均值進(jìn)行計(jì)算；大型溞和斑馬魚試驗(yàn)中每24 h 更換試驗(yàn)藥液，其濃度變化率均未超過(guò)20%，在數(shù)據(jù)分析中，采用0 h時(shí)的實(shí)測(cè)濃度。

甲基嘧啶磷對(duì)3 種水生生物的毒性濃度詳見表3。對(duì)斜生柵藻生長(zhǎng)率的72 h 半抑制濃度（72 h-ErC50）為2.678 mg·L-1(a.i.)，95% 置信區(qū)間為2.419～3.060 mg·L-1(a.i.)；對(duì)斜生柵藻生物量72 h-EyC50為1.437 mg·L-1(a.i.)，95%置信區(qū)間為1.338～1.539 mg·L-1(a.i.)。72 h-EyC50數(shù)據(jù)較72 h-ErC50數(shù)據(jù)小，其毒性更高，因此，利用72 h-EyC50值對(duì)斜生柵藻的毒性等級(jí)進(jìn)行判定。對(duì)大型溞48 h-EC50為5.27×10-3mg·L-1(a.i.)，95% 置信區(qū)間為4.76×10-3～5.83×10-3mg·L-1(a.i.)。對(duì)斑馬魚96 h-LC50為32.69 mg·L-1(a.i.)，95%置信區(qū)間為0.428～0.584 mg·L-1(a.i.)。根據(jù)毒性分析結(jié)果可知，隨著暴露時(shí)間的延長(zhǎng)，甲基嘧啶磷對(duì)大型溞和斑馬魚的LC50/EC50數(shù)值越小，可見甲基嘧啶磷暴露對(duì)這兩種生物的毒性隨時(shí)間推移越高。根據(jù)《化學(xué)農(nóng)藥環(huán)境安全評(píng)價(jià)試驗(yàn)準(zhǔn)則》[20]，可判定甲基嘧啶磷對(duì)斜生柵藻為中毒，對(duì)大型溞為劇毒，對(duì)斑馬魚為高毒。

3 結(jié)論與討論

本研究中，甲基嘧啶磷對(duì)3 種水生生物的毒性具有一定的差異，對(duì)大型溞毒性最高，斑馬魚次之，斜生柵藻最低。甲基嘧啶磷屬于有機(jī)磷硫代磷酸酯類化合物，有研究表明有機(jī)磷類殺蟲劑會(huì)對(duì)水生動(dòng)物神經(jīng)系統(tǒng)造成損害，其主要原因是水生動(dòng)物的AChE 更容易與有機(jī)磷結(jié)合形成穩(wěn)固的磷酰化膽堿酯酶，導(dǎo)致ACh 代謝紊亂，在水生動(dòng)物體內(nèi)大量堆積，使其受體持續(xù)興奮，引起動(dòng)物體抽搐麻痹，最終死亡[22-24]，因此，甲基嘧啶磷對(duì)大型溞和斑馬魚的活性高于斜生柵藻；同時(shí)，還有研究表明硫代磷酸酯類有機(jī)磷殺蟲劑在短時(shí)間暴露下會(huì)影響魚類嗅覺，造成嚴(yán)重的行為障礙[25]，本研究結(jié)果與此結(jié)論相符。同時(shí)，Berntssen 等還從染毒甲基嘧啶磷的大西洋鮭魚的肝臟、肌肉、腎臟和膽汁中鑒定出甲基嘧啶磷代謝物[26]。綜上所述，在甲基嘧啶磷的使用中，應(yīng)避免其進(jìn)入施用地周邊的流動(dòng)水體，防止藥液進(jìn)入湖泊、河流對(duì)水生生態(tài)系統(tǒng)造成危害。

本研究結(jié)果表明，甲基嘧啶磷對(duì)斜生柵藻為中毒、對(duì)大型溞為劇毒、對(duì)斑馬魚為高毒，可見其對(duì)水生生物的毒性較高，但只根據(jù)急性毒性數(shù)據(jù)不能全面、準(zhǔn)確地反映甲基嘧啶磷對(duì)水生生態(tài)系統(tǒng)存在的風(fēng)險(xiǎn)。在農(nóng)藥登記資料中，環(huán)境影響部分需提供化學(xué)農(nóng)藥對(duì)水生生物的毒性資料，結(jié)合PPDB、EPA、EFSA等數(shù)據(jù)庫(kù)所得的甲基嘧啶磷的理化性質(zhì)、環(huán)境歸趨和GAP 使用方法等方面的數(shù)據(jù)信息，采用TOP-RICE 模型[27]和《環(huán)境風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估指南》[28]進(jìn)行甲基嘧啶磷對(duì)水生生態(tài)系統(tǒng)的環(huán)境風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估，利用模型計(jì)算出的預(yù)測(cè)環(huán)境濃度（PEC）和毒性終點(diǎn)數(shù)據(jù)、不確定因子計(jì)算出預(yù)測(cè)無(wú)效應(yīng)濃度（PNEC）比值，判斷風(fēng)險(xiǎn)的可接受程度，以此評(píng)價(jià)農(nóng)藥對(duì)水生生態(tài)系統(tǒng)的風(fēng)險(xiǎn)性。本研究為甲基嘧啶磷進(jìn)一步的風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估提供了生態(tài)毒理方面的數(shù)據(jù)支撐。