溫鑫,劉光文,寧宇航,TESFAY Mesfin Angaw ,林建強*,任一林,林慧彬,宋欣,林建群

1(微生物技術(shù)國家重點實驗室(山東大學(xué)),山東 青島,266237) 2(青島龍鼎生物技術(shù)有限公司,山東 青島,266108)3(山東省中醫(yī)藥研究院,山東 濟南,250014)

人類的一日三餐離不開糖的攝入。食用適量的糖,不僅可以滿足人們身體機能需求,而且還可以帶來幸福感。然而,隨著生活水平的提高,人們攝入過多的糖,使得肥胖、糖尿病、齲齒、心臟病等疾病的患病率提高[1]。近些年,具有高吸收、高熱量特點的傳統(tǒng)食用糖(例如蔗糖、白糖、葡萄糖等)逐漸呈現(xiàn)出被低熱量、低吸收特點的稀有糖(例如木糖醇、赤蘚糖醇、D-阿洛酮糖等)取代的趨勢[2]。國際稀有糖協(xié)會(International Society of Rare Sugars, ISRS)定義稀有糖為自然界中存在但含量極少的一類單糖及其衍生物[3]。稀有糖不僅具有甜味,而且熱量低,更重要的是具有對人體健康有益的生理功能,發(fā)展前景巨大。

稀有糖D-塔格糖,分子式為C6H12O6,分子質(zhì)量為180.16,結(jié)構(gòu)式如圖1所示,是D-半乳糖的同分異構(gòu)體、D-山梨糖的C-3位差向異構(gòu)體和D-果糖的C-4位差向異構(gòu)體,外觀為白色晶體顆?；蚴前咨勰?易溶于水,微溶于乙醇,是一種天然存在的低熱量功能性甜味劑,甜度是蔗糖的92%[4],熱量是1.5 kcal/g[5]。D-塔格糖已被美國食品藥品監(jiān)督管理局(Food and Drug Administration, FDA)認(rèn)可為一般認(rèn)為安全(Generally Recognized as Safe,GRAS)的成分[5-7]。2014年,我國國家衛(wèi)生和計劃生育委員會批準(zhǔn)D-塔格糖為新食品原料[6]。D-塔格糖不僅具有預(yù)防齲齒和肥胖、降低血糖等作用,而且對腸道健康有益[8]。

圖1 D-塔格糖、D-半乳糖、D-山梨糖和D-果糖的結(jié)構(gòu)式比較Fig.1 Structural formula comparison of D-tagatose, D-galactose, D-sorbose, and D-fructose

本文簡述了D-塔格糖的生理功能及應(yīng)用,介紹了生物合成D-塔格糖所需主要的生物酶,歸納了近幾年D-塔格糖的生物合成研究進(jìn)展,并對D-塔格糖的生物合成作出了展望。

1 D-塔格糖的生理功能及應(yīng)用

1.1 低熱量甜味劑,可以發(fā)生美拉德反應(yīng),應(yīng)用于食品

D-塔格糖的甜度是蔗糖的92%,但熱量僅為蔗糖的37.5%(蔗糖熱量為4 kcal/g)[5],是一種低熱量甜味劑。它能夠與食品中的蛋白質(zhì)發(fā)生美拉德反應(yīng),從而改善食品的色澤和風(fēng)味,在烘焙食品、飲料和糖果中具有重要應(yīng)用。

1.2 預(yù)防肥胖,降低血糖,輔助治療Ⅱ型糖尿病

D-塔格糖是一種低熱量功能性甜味劑,可代替蔗糖等傳統(tǒng)甜味劑應(yīng)用于食品中,可以緩解肥胖和降低血糖[9]。在醫(yī)藥保健領(lǐng)域,D-塔格糖可用于制備治療Ⅱ型糖尿病和肥胖的藥物[10-12]。

1.3 優(yōu)異益生元,有利于人體腸道健康

D-塔格糖能夠被結(jié)腸中的腸道菌群發(fā)酵,刺激腸道內(nèi)益生菌的生長,而抑制腸道內(nèi)致病菌的生長[13]。另外,D-塔格糖發(fā)酵過程中能夠產(chǎn)生對人體腸道健康有益的短鏈脂肪酸,例如丁酸等,可促進(jìn)結(jié)腸上皮細(xì)胞的生長繁殖,抑制結(jié)腸癌的發(fā)生[14]。

1.4 抗齲齒,有利于保護(hù)牙齒健康

因為D-塔格糖不能被口腔中的微生物所利用,所以有利于減少口腔中酸性物質(zhì)的產(chǎn)生,降低牙齒腐蝕,從而有效預(yù)防牙齦炎、齲齒、口臭等牙齒疾病的發(fā)生[13]。

1.5 作為底物生產(chǎn)其他稀有糖醇

根據(jù)生物轉(zhuǎn)化法生產(chǎn)己糖策略,即Izumoring 策略[15],從D-塔格糖出發(fā),經(jīng)合適的酶催化可以得到D-山梨糖、D-塔格糖醇和半乳糖醇等具有重要生理功能的稀有糖醇(圖2)。

2 D-塔格糖的生產(chǎn)方法

2.1 自然提取法

自然界中的D-塔格糖主要存在于熱帶常青樹樹膠、苔蘚、地衣、熱可可、奶酪和酸奶中,含量及其微少[13,16-17]。從這些物質(zhì)中直接提取D-塔格糖所需原材料用量大,成本非常高,難以實現(xiàn)D-塔格糖的工業(yè)化生產(chǎn)。

2.2 化學(xué)合成法

D-塔格糖可以由D-半乳糖通過化學(xué)合成法得到,所用化學(xué)催化劑為堿金屬鹽,其催化D-半乳糖與金屬氫氧化物發(fā)生異構(gòu)化反應(yīng),生成金屬氫氧化物-D-塔格糖復(fù)合物;再經(jīng)過酸中和,使得復(fù)合物釋放出D-塔格糖[13-14,18]。但是化學(xué)合成法生產(chǎn)D-塔格糖反應(yīng)過程比較復(fù)雜,容易產(chǎn)生副產(chǎn)物,使得目的產(chǎn)物D-塔格糖的純度降低,給后期分離純化帶來不便,而且化學(xué)試劑的使用會造成環(huán)境負(fù)擔(dān),不符合綠色生產(chǎn)理念[19]。

2.3 生物合成法

D-塔格糖的生物合成主要有兩種方式,一種是利用單酶促反應(yīng)合成D-塔格糖,另一種是利用多酶促反應(yīng)合成D-塔格糖。根據(jù)Izumoring 策略(圖2),選擇合適的單一的醛糖異構(gòu)酶、D-塔格糖 3-差向異構(gòu)酶和氧化還原酶可以分別催化D-半乳糖、D-山梨糖和半乳糖醇生成D-塔格糖。但是,D-半乳糖、D-山梨糖和半乳糖醇的價格比較高,難以真正應(yīng)用于工業(yè)化生產(chǎn),限制了D-塔格糖的工業(yè)化生產(chǎn)。當(dāng)前,有研究人員選擇價格低廉的乳糖、麥芽糊精、牛奶乳清粉等作為底物,利用多酶促反應(yīng)的方式合成D-塔格糖,并且取得了一定的研究成果。生物合成法生產(chǎn)D-塔格糖具有生產(chǎn)效率高、產(chǎn)物純度高、反應(yīng)條件溫和、成本低等優(yōu)點,成為D-塔格糖工業(yè)化生產(chǎn)的首選方法[20]。

3 單酶促反應(yīng)合成D-塔格糖

3.1 L-阿拉伯糖異構(gòu)酶催化D-半乳糖合成D-塔格糖

單酶法生物合成稀有糖能夠充分挖掘該酶的理化性質(zhì)并應(yīng)用于稀有糖的生產(chǎn),具有簡便高效、酶催化劑利用率高以及生產(chǎn)效率高等優(yōu)點。L-阿拉伯糖異構(gòu)酶(L-arabinose isomerase,L-AI)是目前生物合成D-塔格糖研究最多的一種酶,可以催化D-半乳糖為D-塔格糖。該酶的微生物來源廣泛,包括AcidothermuscellulolyticsATCC43068[21],Bacillussubtilisstr.168[22],Lactobacillussakei23K[23],LactobacillusfermentumCGMCC2921[24],BacillusthermoglucosidasiusKCTC 1828[25],AlicyclobacillushesperidumURH17-3-68[26],BacilluscoagulansNL01[27],PseudoalteromonashaloplanktisATCC 14393[28],Geobacillusstearothermophilus[4],ClostridiumhylemonaeDSM 15053[29],LactobacillusbrevisMF 465792[30],EnterococcusfaeciumDBFIQ E36[31],BifidobacteriumadolescentisCICC 6178[32],KlebsiellapneumoniaeDSM 681[33]等。上述微生物來源的L-阿拉伯糖異構(gòu)酶酶學(xué)性質(zhì)如表1所示,最適反應(yīng)溫度為40～75 ℃,最適反應(yīng)pH值為5.0～8.0,多種金屬離子為該酶的激活劑,如Mn2+,Co2+和Mg2+。其中,大部分L-AI對L-阿拉伯糖和D-半乳糖具有底物特異性,有少部分僅對L-阿拉伯糖具有底物特異性,而對D-半乳糖無底物特異性,例如來自于Bacillussubtilisstr.168[22]和PseudoalteromonashaloplanktisATCC 14393[28]的L-AI。另外,來自于AcidothermuscellulolyticsATCC43068[21],Lactobacillussakei23K[23],LactobacillusfermentumCGMCC2921[24],BifidobacteriumadolescentisCICC 6178[32]等的L-AI酶對D-半乳糖表現(xiàn)出較強的底物特異性。

表1 不同微生物來源的L-AI酶學(xué)性質(zhì)Table 1 Enzymatic properties of L-AI from different microbial sources

在大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)中異源表達(dá)來自于BacilluscoagulansNL01的L-AI,在 60 ℃和 pH 7.5 的條件下進(jìn)行全細(xì)胞催化,當(dāng)?shù)孜顳-半乳糖的質(zhì)量濃度為150 g/L和250 g/L時,所得D-塔格糖的轉(zhuǎn)化率分別為32%和27%,轉(zhuǎn)化時間分別為32 h和48 h[27]。利用來自于BifidobacteriumadolescentisCICC 6178的經(jīng)純化的L-AI酶催化100 mmol/LD-半乳糖(含6 mmol/L Mn2+),在 55 ℃和 pH 6.5 的條件下反應(yīng)10 h,D-塔格糖轉(zhuǎn)化率為56.7%[32]。在大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)中異源表達(dá)來自于KlebsiellapneumoniaeDSM 681的L-AI,底物為100 g/LD-半乳糖(含1 mmol/L Mn2+),在 50 ℃和 pH 8.0 的條件下進(jìn)行全細(xì)胞催化反應(yīng)30 min,D-塔格糖的轉(zhuǎn)化率為33.5%[33]。

芽孢表面展示技術(shù)是通過將目標(biāo)酶與芽孢衣殼蛋白進(jìn)行融合表達(dá),依賴于芽孢衣殼蛋白的錨定作用將目標(biāo)酶展示在芽孢表面,從而實現(xiàn)酶的固定化,固定化酶能夠在極端環(huán)境下保持催化活性,而且克服了底物和產(chǎn)物穿膜障礙[10],是一種有益的酶固定化方法嘗試。LIU等[16]通過芽孢表面展示技術(shù)將來源于LactobacillusfermentumCGMCC2921的L-AI展示在Bacillussubtilis168芽孢表面,得到的重組L-AI芽孢表現(xiàn)出相對較高的催化活性和較強的熱穩(wěn)定性,在80 ℃下保存30 min仍保留87%的酶活性。利用該重組L-AI芽孢作為生物催化劑,以100 g/LD-半乳糖為底物,在70 ℃反應(yīng)24 h,D-塔格糖的轉(zhuǎn)化率約為75%。GUO等[10]同樣采用芽孢表面展示技術(shù)將來源于LactobacillusbrevisPC16的L-AI展示在BacillussubtilisDB403芽孢表面,利用重組L-AI芽孢作為生物催化劑,以125 g/LD-半乳糖(含1 mmol/L Mn2+)為底物,在 67 ℃和 pH 6.5 的條件下反應(yīng)28 h,D-塔格糖的轉(zhuǎn)化率為79.7%,而且重組L-AI芽孢具有良好的重復(fù)利用性能,5次循環(huán)后,比活性仍保留87%,D-塔格糖的轉(zhuǎn)化率為40.7%。芽孢表面展示技術(shù)的缺點是芽孢產(chǎn)量較低,難以工業(yè)化應(yīng)用。表2匯總了上述催化D-半乳糖合成D-塔格糖的文獻(xiàn)報道。

表2 催化D-半乳糖合成D-塔格糖Table 2 Synthesis of D-tagatose from D-galactose

因為受到熱力學(xué)平衡的限制,異構(gòu)酶催化的反應(yīng)具有轉(zhuǎn)化率低的特點,降低了生產(chǎn)效率也不利于產(chǎn)品的分離純化。雖然提高反應(yīng)溫度可以使反應(yīng)平衡偏向產(chǎn)物一側(cè),但是過高的溫度不僅會降低酶的活性,而且易導(dǎo)致糖的褐變影響產(chǎn)品質(zhì)量,特別是在堿性條件下。因此,研發(fā)反應(yīng)溫度低、反應(yīng)pH偏酸性、催化活性高、耐熱性強的酶催化劑將有益于工業(yè)化應(yīng)用。

3.2 D-塔格糖 3-差向異構(gòu)酶催化D-山梨糖生產(chǎn)D-塔格糖

D-塔格糖 3-差向異構(gòu)酶(D-tagatose 3-epimerase, DTE)或D-阿洛酮糖 3-差向異構(gòu)酶(D-psicose 3-epimerase,DPE)是生物合成D-阿洛酮糖的常用酶,它們具有廣泛的底物特異性。例如,來自于Agrobacteriumtumefaciens[34]和Arthrobacterglobiformis[35]的DPE酶和來自于Caballeroniafortuita的DTE酶[36]皆能實現(xiàn)D-山梨糖和D-塔格糖之間的相互轉(zhuǎn)化,其中利用來自于Caballeroniafortuita的DTE酶進(jìn)行生物催化時,D-塔格糖與D-山梨糖之間的平衡比為30.7∶69.3(圖3)。但是,由于D-山梨糖價格昂貴,以其為底物生產(chǎn)D-塔格糖在工業(yè)生產(chǎn)中缺乏經(jīng)濟性,因此關(guān)于催化D-山梨糖生產(chǎn)D-塔格糖的研究不多。

A-雷達(dá)分布圖(對D-塔格糖的比活性設(shè)為100%);B-HPLC圖譜;C-平衡化圖3 重組DTE酶底物特異性的雷達(dá)分布,D-塔格糖和D-山梨糖的異構(gòu)化反應(yīng)HPLC圖譜和相應(yīng)的平衡比(圖片修改自文獻(xiàn)[36])Fig.3 The radar distribution of substrate specificity of recombinant DTE, the HPLC profiles of epimerization reactions between the D-tagatose and D-sorbose, and the corresponding equilibriumratios (Image modified from reference[36])

3.3 半乳糖醇脫氫酶催化半乳糖醇生產(chǎn)D-塔格糖

半乳糖醇2-脫氫酶(galactitol 2-dehydrogenase,GDH)能夠在輔酶NAD+存在下將多種多價脂肪醇和多元醇分別氧化成相應(yīng)的酮和酮糖。JAGTAP等[37]在大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)中異源表達(dá)來自于Rhizobiumleguminosarumbv.viciae3841的GDH酶,采用His-tag親和層析技術(shù)純化GDH酶蛋白,經(jīng)十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳測得酶的分子質(zhì)量為28 kDa,經(jīng)凝膠過濾色譜測得酶的分子質(zhì)量為114 kDa,表明該酶為同四聚體,經(jīng)酶學(xué)性質(zhì)分析得到其最適溫度為35 ℃,最適反應(yīng)pH值為9.5,當(dāng)?shù)孜餅榘肴樘谴紩r動力學(xué)參數(shù)Km為8.8 mmol/L,Kcat為835 min-1,Kcat/Km為94.9 (mmol/L)-1·min-1,表明該酶對半乳糖醇具有較好的底物特異性。該GDH酶催化半乳糖醇反應(yīng)30 min,D-塔格糖的轉(zhuǎn)化率高達(dá)72%,并通過旋光性的測定,驗證氧化產(chǎn)物為D-塔格糖。

雖然利用半乳糖醇脫氫酶催化半乳糖醇生產(chǎn)D-塔格糖可以獲得較高的D-塔格糖轉(zhuǎn)化率,但是該氧化反應(yīng)需要添加輔酶NAD+,并且底物半乳糖醇價格高,作為工業(yè)化生產(chǎn)原料缺乏經(jīng)濟性。

4 多酶促反應(yīng)催化廉價底物合成D-塔格糖

4.1 催化乳糖生產(chǎn)D-塔格糖

乳糖是由一分子D-葡萄糖和一分子D-半乳糖組成的雙糖,由于其價格遠(yuǎn)低于D-半乳糖、D-山梨糖和半乳糖醇,成為生產(chǎn)D-塔格糖的首選底物。ZHANG等[38]構(gòu)建了Lactiplantibacillusplantarum工程菌株,敲除了半乳糖激酶基因,阻斷D-半乳糖代謝;同時表達(dá)水解乳糖為D-葡萄糖和D-半乳糖的β-半乳糖苷酶(β-galactosidase,β-GAL)以及催化D-半乳糖為D-塔格糖的L-阿拉伯糖異構(gòu)酶,從而實現(xiàn)一鍋法由乳糖直接生物合成D-塔格糖。利用該工程菌株在65 ℃和pH 7.5條件下進(jìn)行靜息細(xì)胞反應(yīng),以175 g/L乳糖為底物,反應(yīng)56 h,D-塔格糖的轉(zhuǎn)化率為33%。

4.2 催化乳清粉生產(chǎn)D-塔格糖

乳制品工業(yè)廢棄物作為一種廉價原料被用以生產(chǎn)稀有糖產(chǎn)品[39-40]。ZHANG等[41]報道了通過連續(xù)全細(xì)胞催化和發(fā)酵技術(shù)將一種富含乳糖的乳制品副產(chǎn)品,即奶酪乳清粉(cheese whey powder,CWP)轉(zhuǎn)化為3種低熱量甜味劑D-塔格糖、D-阿拉伯醇和半乳糖醇(圖4)。首先,利用一株共表達(dá)β-半乳糖苷酶和L-阿拉伯糖異構(gòu)酶的大腸桿菌工程菌株水解CWP中的乳糖為D-半乳糖和葡萄糖并將D-半乳糖異構(gòu)化為D-塔格糖。隨后,利用MetschnikowiapulcherrimaE1發(fā)酵D-葡萄糖和剩余的D-半乳糖為D-阿拉伯醇和半乳糖醇。最終,利用428.57 g/L CWP(含300 g/L乳糖)得到68.35 g/LD-塔格糖、60.12 g/LD-阿拉伯醇和28.26 g/L半乳糖醇。該報道同時實現(xiàn)了中間代謝產(chǎn)物D-葡萄糖和殘留D-半乳糖的充分利用,利用工業(yè)副產(chǎn)物生產(chǎn)出一系列有價值產(chǎn)品。

圖4 利用連續(xù)全細(xì)胞催化和發(fā)酵技術(shù)將富含乳糖的乳制品 廢棄物生物轉(zhuǎn)化生產(chǎn)D-塔格糖、D-阿拉伯醇和半乳糖醇[41]Fig.4 Biocatalytic conversion of a lactose-rich dairy waste into D-tagatose, D-arabitol and galactitol using sequential whole cell and fermentation technologies[41]

4.3 催化麥芽糊精生產(chǎn)D-塔格糖

DAI等[42]構(gòu)建了一個由α-葡聚糖磷酸化酶(α-glucan phosphorylase,αGP)、磷酸葡萄糖變位酶(phosphoglucomutase,PGM)、葡萄糖6-磷酸異構(gòu)酶(glucose 6-phosphate isomerase, PGI)、D-塔格糖1,6-二磷酸醛縮酶(D-tagatose 1,6-bisphosphate aldolase,GatZ)和磷酸乙醇酸磷酸酶(phos-phoglycolate phosphatase,PGP)組成的大腸桿菌全細(xì)胞生物催化體系,進(jìn)一步利用CRISPR-Cas9技術(shù)敲除了導(dǎo)致中間產(chǎn)物代謝的基因(圖5),以增加中間產(chǎn)物的積累,利用最終得到的大腸桿菌工程菌株作為生物催化劑,以10 g/L 麥芽糊精為底物,反應(yīng)3 h得到了3.383 g/LD-塔格糖,轉(zhuǎn)化率為33.83 g/L。

圖5 重組大腸桿菌模塊化途徑工程促進(jìn)麥芽糊精生物合成D -塔格糖[42]Fig.5 Enhanced biosynthesis of D-tagatose from maltodextrin through modular pathway engineering of recombinant Escherichia coli[42]

多酶促反應(yīng)在生物合成和轉(zhuǎn)化方面具有很大的潛力。與單酶促反應(yīng)相比,多酶促反應(yīng)可以實現(xiàn)更復(fù)雜的反應(yīng),實現(xiàn)由低成本底物生產(chǎn)高附加值產(chǎn)品,避免中間產(chǎn)物分離,減少中間產(chǎn)物抑制,甚至改變反應(yīng)平衡[5]。但是由于各種酶的比例不平衡、中間產(chǎn)物的代謝通量不平衡以及各種酶的最佳反應(yīng)條件不同等原因使得D-塔格糖的轉(zhuǎn)化率不高。后期,可以利用合成生物學(xué)、代謝工程、蛋白質(zhì)工程等技術(shù)優(yōu)化酶的合成與表達(dá)、提升酶的性能,增加各種酶分子間的協(xié)同作用,提高D-塔格糖的轉(zhuǎn)化率。

5 D-塔格糖的分離純化及結(jié)晶

D-塔格糖的分離純化是至關(guān)重要的一步,影響后期D-塔格糖的結(jié)晶和產(chǎn)品品質(zhì)。黃聞霞等[43]報道了采用Ca2+型離子交換樹脂分離D-半乳糖和D-塔格糖,分離得到的D-塔格糖的純度為98%,回收率為83%;分離得到的D-塔格糖溶液再經(jīng)陰陽離子交換樹脂脫鹽脫色,脫鹽率達(dá)到93%,D-塔格糖的回收率達(dá)到87%。隨后,通過添加乙醇實現(xiàn)D-塔格糖的結(jié)晶。蘇齊等[44]利用模擬移動床色譜分離D-塔格糖和D-半乳糖,發(fā)現(xiàn)當(dāng)閥門切換時間為6.43 min 時,分離得到D-塔格糖的純度達(dá)到100%,回收率達(dá)到99.93%。近些年,模擬移動床色譜因其具有分離效率高、溶劑利用率高和能耗低等優(yōu)勢在稀有糖的生產(chǎn)過程中被廣泛應(yīng)用。

目前,關(guān)于D-塔格糖結(jié)晶研究的報道很少。生物合成D-塔格糖時容易產(chǎn)生其他雜糖(例如D-葡萄糖、D-果糖等),且工業(yè)分離時往往不能被完全除去從而會影響D-塔格糖晶體的成核和生長,影響D-塔格糖晶體的形態(tài)、粒徑分布和純度等。WANG等[45]研究了3種雜質(zhì)糖(D-麥芽糖、D-果糖、D-葡萄糖)對D-塔格糖晶體成核速率的影響,發(fā)現(xiàn)雜質(zhì)糖在D-塔格糖晶體表面的吸附會阻礙D-塔格糖晶體的生長(圖6)。

圖6 不同實驗條件下D-塔格糖晶體的掃描電子顯微鏡圖像[45]Fig.6 Scanning electron microscopy images of D-tagatose crystals under different experimental conditions[45]

WANG等還通過單晶生長實驗研究了雜質(zhì)糖對D-塔格糖晶體生長速率的影響,并利用分子動力學(xué)模擬揭示了D-塔格糖在分子尺度上的晶體成核和生長機理。D-塔格糖工業(yè)結(jié)晶工藝目前報道不多。

6 總結(jié)與展望

作為一種功能性天然甜味劑,D-塔格糖不僅在食品領(lǐng)域具有重要應(yīng)用價值,而且在醫(yī)藥和保健領(lǐng)域也發(fā)揮著至關(guān)重要的作用。我國雖然已經(jīng)批準(zhǔn)D-塔格糖為新食品原料,但是國內(nèi)D-塔格糖仍未實現(xiàn)大規(guī)模生產(chǎn),原因主要有以下幾點:a)仍未獲得一種具有生產(chǎn)強度高、熱穩(wěn)定性強和轉(zhuǎn)化率高的酶催化劑;b)食品級宿主菌的開發(fā)力度不強;c)底物成本高;d)產(chǎn)物分離純化難度高。針對以上原因,建議重點研究:a)利用蛋白質(zhì)工程、酶工程等技術(shù)改造酶分子結(jié)構(gòu),得到催化活性高、轉(zhuǎn)化率高、熱穩(wěn)定性高的酶分子;b)開發(fā)經(jīng)GRAS認(rèn)證的食品級宿主菌作為生物催化載體,包括枯草芽孢桿菌、酵母菌、乳酸菌等;c)充分發(fā)揮多酶促反應(yīng)在生物合成和轉(zhuǎn)化方面的潛力,平衡各種酶分子的表達(dá)水平以及中間代謝通量,增加各種酶分子間的協(xié)同作用,利用低成本底物大規(guī)模生產(chǎn)D-塔格糖;d)優(yōu)化D-塔格糖分離純化和結(jié)晶工藝。通過上述努力,構(gòu)建工業(yè)化生產(chǎn)D-塔格糖的簡單、高效、創(chuàng)新性工藝路線。