王英林,吳婭芳,劉程,黃志強,劉坤,劉箐

(上海理工大學(xué) 健康科學(xué)與工程學(xué)院,上海,200000)

大腸桿菌O157∶H7(EscherichiacoliO157∶H7)是一種常見的食源性致病菌,為革蘭氏陰性菌,主要存在于牛肉、牛奶、蔬菜、水果及其制品中。有研究顯示大腸桿菌O157∶H7易感人群為兒童和老年人,以及免疫功能低下的人群[1-2]。大腸桿菌O157∶H7可以導(dǎo)致人體非出血性腹瀉、出血性結(jié)腸炎、血栓性血小板減少性紫癜和溶血性尿毒癥綜合征[3-5],少數(shù)感染者出現(xiàn)腸套疊癥狀[6],嚴重感染可導(dǎo)致死亡[7-8]。因此,研制一種準確快速檢測食品中大腸桿菌O157∶H7的檢測方法至關(guān)重要。

目前常用的檢測大腸桿菌O157∶H7的方法包括傳統(tǒng)的培養(yǎng)鑒定法、基于抗原抗體結(jié)合的免疫學(xué)檢法和基于分子水平的分子生物學(xué)檢測方法等。傳統(tǒng)培養(yǎng)鑒定法被認為是檢測大腸桿菌O157∶H7的“金標準”(GB 4789.36—2016《大腸埃希氏菌O157∶H7/NM檢驗》)。但是,該鑒定方法實驗操作復(fù)雜,實驗周期較長(3～7 d),且鑒定工作繁瑣易污染,對操作者有較高的專業(yè)技能要求,這影響了食品污染溯源和食源性疾病診斷工作的時效性和及時性?；诜肿由飳W(xué)和免疫學(xué)的檢測方法能夠提供及時準確的檢測結(jié)果,是近年來研究的主要方向[9]。其中分子生物學(xué)檢測方法主要包括聚合酶鏈式反應(yīng)PCR、多重PCR[10]、環(huán)介導(dǎo)等溫擴增技術(shù)(loop-mediated isothermal amplification, LAMP)[11]等。此類方法盡管檢測限低,鑒定時間較短,但是均需要專業(yè)儀器或熟練操作的技術(shù)人員,并且檢測體系容易被污染導(dǎo)致假陽性結(jié)果,使得這類檢測技術(shù)推廣應(yīng)用受限。免疫學(xué)檢測方法中應(yīng)用最為廣泛的是酶聯(lián)免疫吸附試驗(enzyme linked immunosorbent assay, ELISA)[12],該方法是利用雙抗體夾心原理的定性或定量檢測技術(shù),但其檢測靈敏度低,檢測時間長(6～8 h),達不到及時準確的現(xiàn)場檢測的需求。與ELISA檢測原理相同的免疫層析試紙條(immunochromatographic strip, ICS)[13-14],可實現(xiàn)對靶標進行快速、精準的檢測,并且具有不需要專業(yè)操作人員與價格低廉等優(yōu)勢,被廣泛的應(yīng)用于食品生產(chǎn)和監(jiān)管、環(huán)境保護以及臨床診斷中[15-16]。

影響ICS檢測靈敏度的因素有很多,其中抗體標記物材料的合成與標記是重要因素之一,目前納米材料被廣泛應(yīng)用于抗原抗體的標記,例如納米金溶膠(colloidal gold, AuNP)、納米銀、異硫氰酸熒光素(fluorescein Isothiocyanate, FITC)等。其中AuNP納米顆粒具有與抗體蛋白結(jié)合效果好,顏色鮮亮,制備簡單等優(yōu)點,在免疫層析試紙條檢測方法中廣泛應(yīng)用。為進一步提升ICS檢測靈敏度,可通過對AuNP的表面形狀結(jié)構(gòu)進行修飾以擴大其表面積來增加抗體偶聯(lián)量,如JI等[17]使用金納米花(gold nanoflowers, AuNFs)作為抗體偶聯(lián)材料檢測黃曲霉毒素B-1,其靈敏度比傳統(tǒng)AuNP提升了10倍;ZHANG等[18]使用金納米星作為免疫傳感器的基底,大大增加了偶聯(lián)抗體量,從而實現(xiàn)對人絨毛膜促性腺激素(human chorionic gonadotrophin, HCG)的超靈敏檢測。此外,帶刺狀金納米顆粒、類似流星錘[19]等形態(tài)各異的AuNP,被用于增加抗體蛋白偶聯(lián)量,從而提高試紙條的檢測靈敏度。因此,通過改變膠體金的大小形態(tài),增加其表面積是降低免疫層析試紙條檢測限的有效方法之一。

本研究中,以AuNPs與AuNFs為抗體標記探針,研制了2種基于不同標記材料的免疫層析試紙條,用于檢測食品中的大腸桿菌O157∶H7。并對2種不同材料標記的試紙條性能進行了對比。以期建立敏感度高、特異性強,可為大腸桿菌O157∶H7的檢測提供簡便、快速的可視化方法。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

LB培養(yǎng)基、NB培養(yǎng)基、Agar培養(yǎng)基等,山東拓普生物工程有限公司;四氯金酸(HAuCl4)、牛白蛋白,Sigma ALdrich(上海)貿(mào)易有限公司;NC膜,Sartorius公司;樣品墊、結(jié)合墊、吸水紙、PVC粘板,上海杰一生物技術(shù)有限公司;雌性BALB/c雌性小鼠,上海杰思捷實驗動物有限公司;其他化學(xué)試劑均購自國藥集團化學(xué)試劑有限公司與上海Sangon Biotech公司。

大腸桿菌O157∶H7(ATCC 43895)等食源性菌(表1)為本實驗室保藏。

表1 實驗菌株Table 1 Experimental strains

牛奶、牛肉、果凍,上海某超市。

1.2 儀器與設(shè)備

System 9700 PCR儀,Gene Company公司;CTS300XYZ微電腦自動斬切機購,上海金標生物科技有限公司;S25-2型恒溫磁力攪拌器,上?？蓸穬x器有限公司;SpectraMaxM2酶標儀,美谷分子儀器(上海)有限公司;CC-3073-02 CO2細胞恒溫培養(yǎng)箱,Blue pard公司;ZQPZ 288R恒溫培養(yǎng)箱,天津市萊玻特瑞儀器設(shè)備有限公司;PE28-standard pH測量計,METTLER TOLEDO公司。

1.3 實驗方法

1.3.1 大腸桿菌O157∶H7單克隆抗體制備

大腸桿菌O157∶H7單克隆抗體采用動物體內(nèi)誘生法,具體方法如下:將在55 ℃預(yù)熱30 min后的不完全弗氏佐劑按0.6 mL/只小鼠腹腔注射進行預(yù)處理,3～d腹腔后接種約106個雜交瘤細胞,約10 d后,可見小鼠腹部膨大,用2 mL注射器抽取腹水,即可獲得大量大腸桿菌O157∶H7單克隆抗體。

1.3.2 AuNPs與AuNFs的制備與表征

根據(jù)化學(xué)還原法[20]制備AuNPs溶液,具體制備方法如下:取198.0 mL雙蒸水,轉(zhuǎn)速為500 r/min,115 ℃加熱至沸騰,立即加入2 mL(10 g/L)HAuCl4溶液,沸騰20 s,同時迅速加入5.4 mL檸檬酸三鈉溶液(10 mg/mL)繼續(xù)加熱10 min后,停止加熱,冷卻至室溫。酒紅色的AuNPs溶液在4 ℃避光保存。

AuNFs采用對苯二酚還原法[21](也稱為金種子介導(dǎo)法)合成。具體步驟如下:將100.0 mL雙蒸水加熱至50 ℃,然后依次加入2.0 mL金籽溶液(AuNP溶液)、1.0 mL HAuCl4溶液(10 mg/mL)、2.0 mL檸檬酸鈉溶液(10 mg/mL)。檸檬酸鈉將HAuCl4溶液中的Au3+還原為Au+。保持溶液溫度在50 ℃,并快速加入1.2 mL的對苯二酚溶液(30 mmoL/L)。對苯二酚將Au+還原成Au,Au在小的球形納米顆粒表面形成小的突起,形成花狀的外觀,即AuNFs。當(dāng)溶液的顏色變成深藍色時,繼續(xù)攪拌加熱10 min,然后停止加熱,冷卻至室溫。深藍色的AuNFs溶液在4 ℃避光保存。

利用紫外分光光度計掃描紫外吸收圖譜測定其顆粒大小,采用透射電鏡觀察其形狀和顆粒均勻程度。

1.3.3 AuNPs與AuNFs最適標記pH的確定

AuNPs與AuNFs標記抗體最重要的條件是pH和抗體濃度。因此,對這2個重要條件進行探索優(yōu)化。優(yōu)化最適pH時,首先在100 uL AuNPs與AuNFs溶液中加入不同體積(0、0.3、0.6、0.9、1.2、1.5、1.8、2.1 μL)的0.2 mol/L K2CO3,調(diào)節(jié)納米金溶液的pH。充分振蕩混合均勻后,加入5 μg抗體,振蕩10 min,使AuNPs與AuNFs探針與單克隆抗體偶聯(lián)。將10 μL 復(fù)合物用移液槍點在結(jié)合墊上,室溫下晾干。取100 μL新鮮培養(yǎng)的大腸桿菌O157∶H7緩慢滴加于免疫層析試紙條的樣品墊,10 min后觀察免疫層析試紙條上的檢測線(T線)和質(zhì)控線(C線)的顏色強度,試紙條每次測定重復(fù)3遍。當(dāng)復(fù)合溶液的pH在抗體蛋白的等電點附近(即最適pH)時,抗體蛋白能與納米金粒子充分結(jié)合且不易于析出,因此T線和C線均顯示高強度的顏色信號;pH不適宜時,T線和C線均不顯示或顯示低強度顏色信號。剩余的復(fù)合物溶液加入10 μL 10%NaCl溶液,振蕩10 min后觀察溶液的顏色變化及納米金析出情況。樣品的顏色越深,結(jié)合能力越好,pH越合適。

1.3.4 AuNPs與AuNFs最適標記抗體濃度的確定

探索AuNPs與AuNFs最適標記抗體濃度,取100 μL AuNPs與AuNFs溶液中加入上述最適K2CO3添加量(即K2CO3最適添加體積),分別加入等體積、不同質(zhì)量濃度(0.1、0.3、0.9、1.2、2.4、3.6、4.8、6 μg/100 μL)的大腸桿菌O157∶H7單克隆抗體,充分振蕩混勻使AuNPs與AuNFs探針與單克隆抗體偶聯(lián)。后續(xù)操作同上。

1.3.5 AuNPs與AuNFs標記抗體

AuNPs標記抗體的方法如下:將最佳濃度的大腸桿菌O157∶H7抗體逐滴加入(30 μL/min)到最佳pH條件下的AuNPs溶液中,4 ℃下使用磁力攪拌器均勻攪拌1 h。然后加入1/10 AuNPs溶液體積的10%牛白蛋白溶液,持續(xù)攪拌1 h。12 000 r/min高速離心15 min,去除上清液。沉淀加入10 mL新鮮配制的抗體保存液重懸,充分混合均勻后,再次12 000 r/min離心15 min,去除上清液。沉淀使用1 mL的新鮮配制的抗體保存液重懸,充分混合均勻后4 ℃低溫避光保存。

AuNFs標記抗體的方法如下:將最佳濃度的大腸桿菌O157∶H7抗體逐滴加入(30 μL/min)到最佳pH條件下的AuNFs溶液中,然后在4 ℃下攪拌1 h。將1/2溶液體積10 mg/mL PEG-1500加入溶液中,在4 ℃ 下混合30 min。然后,然后加入1/10 AuNFs溶液體積的20%牛白蛋白溶液,溫和攪拌30 min?；旌先芤涸? ℃下以5 000 r/min離心20 min,除去上清液,用新鮮配制的抗體保存液重懸沉淀,其體積為AuNFs溶液體積的1/10,在4 ℃低溫避光保存。

1.3.6 AuNPs與AuNFs試紙條的制備

AuNPs與AuNFs試紙條主要包括5個部分[22]如圖1-b所示。將制備的抗大腸桿菌O157∶H7單克隆抗體和羊抗鼠IgG抗體(1.0 mg/mL)通過點樣儀以1.0 μL/cm的速度分別將T線與C線噴涂在NC膜上,置于40 ℃干燥12 h。結(jié)合墊使用AuNPs-Ab與AuNFs-Ab溶液浸泡30 min,置與40 ℃干燥12 h。待結(jié)合墊和NC膜晾干后,進行組裝,切割成3 mm試紙條后備用。

a-AuNPs與AuNFs合成流程圖;b-免疫層析試紙條構(gòu)造圖;c-免疫層析試紙條檢測原理圖圖1 AuNPs與AuNFs合成流程及雙抗體夾心試紙條結(jié)構(gòu)圖Fig.1 Preparation procedure of AuNPs/AuNFs and structure of the immunochromatographic test strip

1.3.7 AuNPs與AuNFs靈敏度和特異性測定

靈敏度驗證:將大腸桿菌O157∶H7培養(yǎng)至濃度1.0×108CFU/mL以上,使用pH 7.8 PB緩沖液通過10倍梯度稀釋至濃度范圍101～108CFU/mL,分別取各梯度溶液100 μL滴加AuNPs與AuNFs至免疫層析試紙條樣品墊,10 min后觀察試紙條檢測結(jié)果確定其靈敏度。

特異性驗證:對實驗室保藏的3株大腸桿菌O157∶H7標準菌株和20株常見的其他食源性致病菌驗證AuNPs與AuNFs試紙條的特異性。

1.3.8 AuNPs與AuNFs試紙條模擬帶菌試驗

為了證明2種免疫層析試紙條在食品樣品檢測中的可行性,用AuNPs與AuNFs試紙條試紙條檢測人工污染的食品,來模擬檢測被大腸桿菌O157∶H7污染的實際樣品。具體方法如下:將從本地超市購買的牛奶、牛肉和果凍樣品取25 mL或25 g分別添加到LB培養(yǎng)基(225 mL),均質(zhì)2 min后置于121 ℃高溫高壓滅菌15 min,待降至室溫后在無菌環(huán)境中加入約250 CFU大腸桿菌O157∶H7,使其終濃度達到約1 CFU/mL,培養(yǎng)12 h,期間每1 h從細菌培養(yǎng)瓶中收集1 mL培養(yǎng)液并立即加入0.3%的甲醛溶液后置于4 ℃冰箱。待培養(yǎng)結(jié)束后分別進行免疫層析試紙條檢測和ELISA快速檢測試劑盒檢測,并對比檢測結(jié)果。

1.3.9 AuNPs與AuNFs重復(fù)性實驗

將大腸桿菌O157∶H7培養(yǎng)至濃度1.0×108CFU/mL以上,使用pH 7.8 PB緩沖液通過10倍梯度稀釋至濃度范圍104～108CFU/mL,取3個批號的試紙條進行檢測,每個濃度水平3個平行,計算檢出概率值(probability of detection, POD)(檢出陽性結(jié)果次數(shù)占所有檢測結(jié)果的比率)。

2 結(jié)果與分析

2.1 AuNPs與AuNFs納米顆粒的表征

金納米粒子的粒徑大小和形狀均勻程度對試紙條的靈敏度和穩(wěn)定性至關(guān)重要。由圖2-a和圖2-e可知,制備的AuNPs與AuNFs溶液呈清澈透亮。由圖2-b和圖2-f的TEM結(jié)果顯示,合成的AuNPs呈現(xiàn)相對大小均勻的球體,而AuNFs呈現(xiàn)相對大小均一且表面為不規(guī)則花狀的納米金;通過紫外吸收光譜檢測,AuNPs的最大吸收峰為520～530 nm,AuNFs吸收峰為570～580 nm。與AuNPs相比,AuNFs的尺寸更大,表面更不規(guī)則,因此與AuNPs相比AuNFs會獲得更大的比表面積。較大的比表面積可能會減少抗體與納米金結(jié)合時產(chǎn)生的空間阻抗效應(yīng),納米金能夠與更多的目標抗體相結(jié)合,從而提升試紙條檢測的靈敏度。

a-AuNPs溶液圖;b-AuNPs透射電鏡;c-AuNPs紫外吸收圖譜;d-AuNFs溶液圖;e-AuNFs透射電鏡;f-AuNFs紫外吸收圖譜圖2 AuNPs與AuNFs表征Fig.2 Characterization of AuNPs and AuNFs

2.2 AuNPs與AuNFs試紙條最適pH值試驗結(jié)果

不同標記pH值下制備的試紙條檢測結(jié)果發(fā)現(xiàn),由圖3-a可知,當(dāng)100 μL AuNPs溶液中加入0.9 μL 0.2 mol/L K2CO3時,C、T線顏色最深,且微孔顏色最亮;由圖3-b可知,當(dāng)100 μL AuNFs溶液中加入0.6 μL 0.2 mol/L K2CO3時,C、T線顏色最深,且微孔顏色呈亮藍色。

因此,后續(xù)試驗選擇100 μL AuNPs溶液中添加0.9 μL 0.2 mol/L K2CO3,100 μL AuNFs溶液中添加0.6 μL 0.2 mol/L K2CO3。

2.3 AuNPs與AuNFs試紙條最適標記抗體濃度試驗結(jié)果

不同標記抗體濃度下制備的試紙條檢測結(jié)果發(fā)現(xiàn),由圖4-a可知,當(dāng)100 μL AuNPs溶液中加入1.2 μg抗體時,C、T線顏色最深,且微孔顏色最亮;由圖4-b可知,當(dāng)100 μL AuNFs溶液中加入4.8 μg抗體時,C、T線顏色最深,且微孔顏色最深。

a-AuNPs試紙條最適抗體濃度;b-AuNFs試紙條最適抗體濃度圖4 AuNPs與AuNFs最適抗體濃度Fig.4 Optimal antibody concentrations of AuNPs and AuNFs

因此,后續(xù)試驗在所用抗體量比最佳抗體濃度增加20%,即100 μL AuNPs溶液中添加2.88 μg抗體,100 μL AuNFs溶液中添加5.76 μg抗體。

2.4 AuNPs與AuNFs試紙條靈敏度

在本研究中,為了測定兩種免疫層析試紙條的靈敏度,將培養(yǎng)至3.2×108CFU/mL的大腸桿菌O157∶H7稀釋成不同濃度梯度的菌懸液(108～101CFU/mL),以pH 7.8的PB緩沖溶液為陰性對照,分別取100 μL滴加在免疫層析試紙條的樣品墊。結(jié)果如圖5-a所示。AuNPs試紙條檢測大腸桿菌O157∶H7的檢測限為3.2×105CFU/mL,圖5-b所示AuNFs試紙條檢測大腸桿菌O157∶H7的檢測限為3.2×104CFU/mL,比AuNPs試紙條檢測限高出10倍。表明AuNFs作為抗體標記材料可以降低免疫層析試紙條的檢測限。

a-AuNPs;b-AuNFs圖5 AuNPs與AuNFs試紙條靈敏度Fig.5 Sensitivity of AuNPs and AuNFs strips

2.5 AuNPs與AuNFs試紙條特異性

如圖6-a和圖6-b可知,AuNPs與AuNFs試紙條只有在檢測大腸桿菌O157∶H7(ATCC 43895、ATCC 43889和NCTC 12900)時C線和T線分別出現(xiàn)了條帶,而試紙條檢測其他20株常見的食源性致病菌結(jié)果顯示,僅在C線觀察到1條條帶,T線處均未出現(xiàn)條帶。結(jié)果表明,AuNPs與AuNFs試紙條均對大腸桿菌O157∶H7檢測具有較高的特異性,與其他食源性是病菌沒有交叉反應(yīng)。

a-AuNPs;b-AuNFs圖6 AuNPs與AuNFs試紙條特異性Fig.6 Specificity of AuNPs and AuNFs strips

2.6 AuNPs與AuNFs試紙條模擬帶菌試驗結(jié)果

對人工污染的果凍、牛奶和牛肉在不同培養(yǎng)時期的樣品分別使用AuNPs與AuNFs試紙條進行檢測,結(jié)果如圖7所示,AuNPs試紙條對果凍、牛奶和牛肉樣品分別在孵育5、6、5 h時,試紙條的C線和T線均顯色,呈陽性結(jié)果。AuNFs試紙條對果凍、牛奶和牛肉樣品分別在孵育5、5、4 h時,試紙條的C線和T線均顯色,呈陽性結(jié)果。其中對于牛奶與牛肉樣品的檢測AuNFs試紙條比AuNPs試紙條提前1 h檢出。與ELISA試劑盒檢測結(jié)果相比,如表2所示,果凍和牛肉樣品檢測結(jié)果均為前增菌8 h時可以檢出大腸桿菌O157∶H7;牛奶樣品中大腸桿菌O157∶H7前增菌10 h可被ELISA試劑盒檢出陽性結(jié)果。通過對比檢測結(jié)果可知,基于AuNPs與AuNFs試紙條檢測食品模擬帶菌陽性結(jié)果檢出的前增菌時間比ELISA試劑盒縮短了2～4 h。綜上所述,AuNPs與AuNFs試紙條均可以用于果凍、牛奶和牛肉中大腸桿菌O157∶H7的快速檢測,且不受食品復(fù)雜機制的影響。

a-AuNPs;b-AuNFs圖7 AuNPs與AuNFs試紙條模擬帶菌試驗Fig.7 AuNPs and AuNFs test strips simulated bacterial carrier test注:a、b中從左到右依次表示果凍、牛奶以及牛肉樣品。

表2 ELISA試劑盒和AuNPs與AuNFs試紙條檢測結(jié)果對比Table 2 Comparison of ELISA kit, AuNPs and AuNFs test strips

2.7 AuNPs與AuNFs試紙條重復(fù)性結(jié)果

由表3可知,3個不同批次的AuNPs試紙條檢測結(jié)果均在108～105CFU/mL出現(xiàn)陽性結(jié)果,AuNPs試紙條檢測結(jié)果均在108～104CFU/mL出現(xiàn)陽性,并且陰性對照未出現(xiàn)陽性結(jié)果,表明方法重復(fù)性較好。

表3 重復(fù)性測試結(jié)果Table 3 Result of repeatability

3 結(jié)論

大腸桿菌O157∶H7的主要傳播途徑是家禽、牲畜及其肉制品與奶制品[23],大多數(shù)大腸桿菌O157∶H7感染都與食用未煮熟的碎牛肉或飲用生奶(較少發(fā)生)相關(guān)。本文成功建立了2種免疫層析試紙條快速檢測食品中大腸桿菌O157∶H7,并對2種試紙條進行了靈敏度測定,特異性交叉測定、重復(fù)性測定以及選取常見大腸桿菌O157∶H7宿主性食品牛肉(固體)、果凍(半固體)、牛奶(液體)進行模擬帶菌實驗。

在靈敏度方面,AuNPs試紙條檢測限為3.2×105CUF/mL,AuNFs試紙條檢測限為3.2×104CUF/mL,比AuNPs檢測限高出10倍,并且2種試紙條均與常見的食源性致病菌無交叉反應(yīng)。盡管2種試紙條的靈敏度均略低于PCR與LAMP等分子生物學(xué)檢測方法,但是該類方法均需要專業(yè)儀器或熟練操作的技術(shù)人員,并且檢測體系容易被污染導(dǎo)致假陽性結(jié)果。與傳統(tǒng)的分離培養(yǎng)法與ELASA相比,試紙條具有快速、方便的特性,能夠?qū)崿F(xiàn)基層、現(xiàn)場以及大量產(chǎn)品的快速初篩檢測。在真實樣品模擬帶菌檢測中,AuNPs試紙條對果凍、牛奶和牛肉樣品分別在前增菌5、6、5 h時檢出,AuNFs試紙條對果凍、牛奶和牛肉樣品分別在前增菌5、5、4 h時檢出,對于3種樣品增菌檢出時間不同,可能是由于不同樣品所含的不同基質(zhì)對大腸桿菌O157∶H7生長繁殖所造成的影響不同導(dǎo)致的,但所建立的檢測方法并未受食品基質(zhì)影響出現(xiàn)假陽性或假陰性結(jié)果。并且將檢測結(jié)果與ELISA試劑盒檢測結(jié)果相比,AuNPs與AuNFs試紙條檢測食品模擬帶菌陽性結(jié)果檢出的前增菌時間比ELISA試劑盒縮短了2～4 h,表明2種試紙條均可以應(yīng)用于常見食品(肉制品、奶制品以及蔬菜等)中大腸桿菌O157∶H7的檢測。經(jīng)過比較測試,AuNFs是比AuNPs更為靈敏的抗體標記材料,為食源性致病菌快速檢測提供了一種高靈敏、高特異性的可視化檢測工具,為國家大腸桿菌O157∶H7免疫層析試紙條規(guī)?；a(chǎn)提供參考依據(jù)。