鐘慧雅,蔡東紅,陳桐楷,宋雅芳,李嵐其,柯鈴鈴

(廣州中醫(yī)藥大學(xué),廣東 廣州 510405)

重癥肌無力主要是神經(jīng)肌肉接頭處傳遞功能障礙引起的自身免疫性疾病。該病臨床表現(xiàn)是部分或全身骨骼肌無力和易疲勞,程度從輕度眼部癥狀到呼吸功能不全,重癥肌無力相關(guān)合并癥發(fā)生率及重癥肌無力危象病死率較高,病情容易反復(fù),遷延不愈。目前西醫(yī)對重癥肌無力的治療主要包括膽堿酯酶抑制劑、免疫抑制劑、胸腺切除術(shù)和單抗藥物如依庫珠單抗、利妥昔單抗[1]。中國重癥肌無力發(fā)病率估計為(1.55～3.66)/10萬,而我國南方的重癥肌無力發(fā)病率為(2.19～11.07)/10萬,女性患病率高于男性,平均每次住院費用為2 526～2 673美元[2]。重癥肌無力病程長、病情反復(fù),對患者生活造成極大影響并給家庭帶來沉重經(jīng)濟負擔(dān)。

中醫(yī)學(xué)雖無重癥肌無力病名,但重癥肌無力的不同臨床表現(xiàn)可對應(yīng)中醫(yī)的不同證型,如單純眼肌型中眼外肌麻痹出現(xiàn)眼瞼無力、下垂為“瞼廢”,出現(xiàn)復(fù)視為“視岐”;咽喉肌受累出現(xiàn)飲水嗆咳、吞咽困難屬“喑痱”;四肢肌無力為“痿證”;發(fā)生重癥肌無力危象出現(xiàn)呼吸困難為“大氣下陷”等[3]。《素問·痿論》 曰“脾主身之肌肉”,《靈樞·本神》有“脾氣虛則四肢不用”的記載。脾為后天之本主運化,是維持機體功能活動的基礎(chǔ)。營衛(wèi)二氣皆賴脾胃運化的水谷精微化生而成,可營養(yǎng)全身五臟六腑、四肢百骸?！蹲C治準繩》亦云:“痿者,氣之軟弱也,肢體沉重而瘦弱難行也。”線粒體是肌肉能量的來源,通常被稱為細胞的“發(fā)電站”,骨骼肌運動的正常功能依賴于線粒體的結(jié)構(gòu)與功能的正常與否。維持最佳線粒體含量和功能對骨骼肌健康至關(guān)重要,線粒體功能的維持依賴于線粒體生物發(fā)生過程和線粒體質(zhì)量控制過程的平衡,線粒體自噬在線粒體質(zhì)量控制中起著重要的作用[4]。通過線粒體自噬去除功能障礙的線粒體以達到維持骨骼肌良好的運動功能[5]。線粒體自噬及其調(diào)控分子機制的相關(guān)研究已成為學(xué)者們的關(guān)注熱點,但是有關(guān)脾虛證、重癥肌無力及線粒體自噬調(diào)控的分子機制三者之間相關(guān)性的研究仍較少。因此,本文將基于“脾藏肌肉之氣”理論探討線粒體自噬與重癥肌無力的相關(guān)性,以期進一步闡明健脾益氣法治療重癥肌無力的作用機制。

1 “脾藏肌肉之氣”理論

1.1脾主肌肉 “脾藏肌肉之氣”理論源于《素問·平人氣象論篇》:“臟真濡于脾,脾藏肌肉之氣也。”脾主后天之本,為氣血化生之源,濡潤周身臟腑、四肢百骸?！端貑枴ゐ粽撈分杏涊d“脾主身之肌肉”,《素問·五臟生成篇》云“脾之合肉也”。脾主肌肉是指脾通過將水谷化為精微,化生氣血,并運送布散到肌肉之中,以營養(yǎng)肌肉,提供肌肉活動所需的能量,使肌肉豐滿發(fā)達,壯實有力,以維持肌肉的正常功能?！端貑枴づK氣法時論》曰:“脾病者,身重,善饑肉痿,足不收,行善瘈 ,腳下痛。”《素問·氣交變大論》曰:“其眚四維,其臟脾,其病內(nèi)舍心腹,外在肌肉四肢?！比羝馓撍?主運化功能失職,水谷精微生成或轉(zhuǎn)運障礙,四肢、肌肉失去滋養(yǎng),則肌肉消瘦、痿軟,四肢無力,甚則痿廢不用。肌肉的壯實和運動功能與脾密切相關(guān)。

1.2脾主營衛(wèi)之氣與痿證密切相關(guān) 《靈樞·營衛(wèi)生會》云:“人受氣于谷,谷入于胃,以傳與肺,五臟六腑,皆以受氣,其清者為營,濁者為衛(wèi),營在脈中,衛(wèi)在脈外,營周不休,五十而復(fù)大會,陰陽相貫,如環(huán)無端?！睜I衛(wèi)二氣因陰陽性質(zhì)的不同一分為二。性質(zhì)清者為營,性質(zhì)屬陰,行于脈中;性質(zhì)濁者為衛(wèi),性質(zhì)屬陽,行于脈外。二者共同環(huán)繞人體周身,分布于五臟六腑、四肢百骸,是人體生命活動重要的物質(zhì)與功能基礎(chǔ)?！端貑枴け哉撈份d:“榮者,水谷之精氣也,和調(diào)于五臟,灑陳于六腑,乃能入于脈也,故循脈上下,貫五臟絡(luò)六腑也。衛(wèi)者,水谷之悍氣也,其氣剽疾滑利,不能入于脈也,故循皮膚之中,分肉之間,熏于肓膜,散于胸腹?！睜I衛(wèi)二氣皆是中焦脾胃運化生成的水谷精微之氣,是人體生命所不可缺少的。營氣為水谷精微之精華部分,行于脈中,貫通于五臟,營養(yǎng)于六腑,又聯(lián)絡(luò)于六腑,具有柔和地滋養(yǎng)、濡潤人體五臟六腑、全身百骸的作用。衛(wèi)氣為水谷精微之剽悍部分,其性剽悍滑疾,循行脈外,具有充養(yǎng)、防御、溫煦周身的作用。脾藏肌肉之氣,可見脾不僅可以直接濡養(yǎng)肌肉,亦可通過調(diào)節(jié)布散于肌肉的營衛(wèi)之氣,以達到充養(yǎng)肌肉、維持其運動功能的目的。見圖1。

圖1 脾-營衛(wèi)二氣-肌肉之間關(guān)系

營衛(wèi)之氣與痿證發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)。邪從皮毛而入,溫?zé)釢裥岸厩忠u,可致肺熱葉焦,經(jīng)脈阻滯,肌肉不仁,而發(fā)痿證?！端貑枴ち?jié)藏象論篇》記載:“肺者……其華在毛,其充在皮?！逼つw毛孔之開闔為衛(wèi)氣所管,衛(wèi)氣和則開適度、內(nèi)外調(diào)達、邪不能害、分肉解利、腠理致密。”衛(wèi)氣是機體正氣的重要組成部分,有防御作用,行于外可溫養(yǎng)、護衛(wèi)肌表,防邪氣入侵;行于內(nèi)可溫養(yǎng)、保護臟腑、四末,保障正常生理功能[6]。衛(wèi)氣和則腠理致密,可壯實肌肉以抵御外邪。久病生瘀,瘀血阻滯經(jīng)脈,經(jīng)脈失于濡養(yǎng),四肢不得滋養(yǎng)發(fā)為痿。營在脈中,氣行則血行,營氣和則瘀血通。營氣循經(jīng)而行,隨血流運行至全身各處,內(nèi)榮于五臟六腑而外榮養(yǎng)于四末,流注于四肢肌肉,起到滋潤、濡養(yǎng)的作用,為肌肉維持生理功能提供營養(yǎng)物質(zhì)。有學(xué)者提出“營衛(wèi)痿證模型”,認為痿證發(fā)生本在營衛(wèi)[7]。另有學(xué)者認為“治痿獨取陽明”是通過針刺陽明經(jīng)腧穴、施以補瀉手法以調(diào)營衛(wèi)之氣,從而起到治療痿證的作用[8]。

2 線粒體自噬的內(nèi)涵

2.1自噬與線粒體自噬概述 自噬是真核生物細胞通過溶酶體,處理過剩、衰老、受損蛋白質(zhì)、蛋白質(zhì)復(fù)合物、細胞器,進行分解和回收的過程,是使細胞能更好地適應(yīng)環(huán)境變化如缺氧、氧化應(yīng)激、炎癥刺激等和維持穩(wěn)態(tài)的一種細胞保護性程序。自噬可分為巨自噬、微自噬和分子伴侶介導(dǎo)的自噬。線粒體是細胞生命活動的“動力站”,是細胞進行有氧呼吸的主要場所,通過三羧酸循環(huán)等方式進行三大營養(yǎng)物質(zhì)糖、脂肪、蛋白質(zhì)的能量代謝,產(chǎn)生機體可直接利用的能量載體 ATP,為細胞生命活動提供能量物質(zhì)。Lemasters[9]在 2005 年首次提出“線粒體自噬”的概念。線粒體自噬屬于巨自噬的一種,通過自噬能選擇性地清除功能障礙或不需要的線粒體,從而維持細胞內(nèi)線粒體的質(zhì)量和數(shù)量的平衡,對維持細胞的穩(wěn)態(tài)具有重要意義。線粒體是動態(tài)的細胞器,存在于不斷融合和分裂高度互連的網(wǎng)絡(luò)中[10]。線粒體的融合和分裂受到嚴格的調(diào)控,通過消除和防止受損線粒體的積累來維持健康的線粒體群體是必要的。維持功能良好的線粒體群體需要線粒體自噬來調(diào)控。

2.2基于PINK1/Parkin的線粒體自噬經(jīng)典調(diào)控機制 近年來,線粒體自噬的分子機制以及相應(yīng)調(diào)控機制的研究引起廣大學(xué)者的關(guān)注。目前在哺乳動物體內(nèi)已發(fā)現(xiàn)多種線粒體自噬途徑,其中PINK1-Parkin介導(dǎo)的線粒體自噬信號通路研究較為成熟,也發(fā)現(xiàn)了通過B淋巴細胞瘤-2/腺病毒E1B相互作用蛋白3(BNIP3)、Nip樣蛋白(NIX/BNIP3L)和FUN14結(jié)構(gòu)域蛋白1(FUNDC1)等有自噬微管相關(guān)蛋白輕鏈3 (LC3)結(jié)合結(jié)構(gòu)域(LIR)的線粒體外膜蛋白直接與 LC3 相結(jié)合發(fā)揮作用介導(dǎo)的線粒體自噬信號通路。

Parkin是胞質(zhì)的E3泛素-蛋白連接酶,可以啟動受損的線粒體進行自噬程序。PINK1是絲氨酸/蘇氨酸激酶,能磷酸化Parkin和泛素(Ub)。PINK1位于Parkin的上游,可促進Parkin由細胞質(zhì)到線粒體的轉(zhuǎn)位和線粒體自噬。在線粒體健康的細胞中,PINK1水平較低,因PINK1移位后,PINK1的跨膜片段被釋放到胞質(zhì)溶膠中,并很快被一個N端規(guī)則泛素連接酶快速泛素化并通過蛋白酶體降解[11]。當(dāng)線粒體受損或線粒體膜電勢丟失時,PINK1切割降解被阻斷,導(dǎo)致積累的PINK1的定位在線粒體外膜上。PINK1募集胞質(zhì)中的Parkin轉(zhuǎn)位到受損的線粒體外膜表面,并可通過磷酸化Parkin泛素樣(UBL)結(jié)構(gòu)域直接激活,活化的PINK1磷酸化并激活Parkin的E3泛素-蛋白連接酶活性[12]。因Parkin 的E3泛素-蛋白連接酶活性,同時將泛素連接到位于線粒體的底物上,引起膜上蛋白泛素化。其中Parkin介導(dǎo)的泛素化有助于自噬相關(guān)蛋白TAX1BP1、NDP52、OPTN、NBR1和p62/SQSTM1等具有泛素結(jié)合結(jié)構(gòu)域(UBD)的蛋白[13-14]識別并結(jié)合線粒體上的泛素化蛋白,并利用泛素化蛋白的LIR與LC3相互作用,與自噬體膜結(jié)合,受損線粒體被自噬體吞噬, 最終在溶酶體中降解,完成受損線粒體的自噬(見圖2)。LC3分為Ⅰ型和Ⅱ型,通常LC3在細胞質(zhì)中以LC3-Ⅰ的形式存在,自噬發(fā)生時LC3-Ⅰ的一部分轉(zhuǎn)化為膜結(jié)合的LC3-Ⅱ,LC3-Ⅱ的量與自噬體形成程度成正比[15],可通過檢測LC3-Ⅱ或LC3-Ⅱ與LC3-Ⅰ的比值了解自噬程度。

2.3線粒體自噬與重癥肌無力等神經(jīng)肌肉病的關(guān)系 線粒體是維持骨骼肌功能正常的關(guān)鍵細胞器,線粒體在重癥肌無力的發(fā)病機制中起著重要作用[16]。線粒體的生物發(fā)生和通過線粒體自噬的選擇性降解及整合對保持肌肉健康至關(guān)重要,這些平衡的破壞可能導(dǎo)致肌肉生物能學(xué)的改變和肌肉質(zhì)量和功能的損失[17]。Parkin是參與線粒體質(zhì)量控制的關(guān)鍵因素,不僅通過促進受損線粒體的分裂,也通過促進線粒體融合蛋白的降解來抑制受損線粒體的融合來維持線粒體網(wǎng)的質(zhì)量,Parkin的缺失可致骨骼肌線粒體功能障礙、骨骼肌萎縮[18]。研究表明[19],Parkin基因的敲除導(dǎo)致骨骼肌肌纖維收縮損傷和線粒體功能的嚴重受損,Parkin對于維持骨骼肌中正常的線粒體功能是必不可少的。PINK1基因敲除的大鼠存在調(diào)節(jié)運動的黑質(zhì)神經(jīng)元進行性變性,多巴胺能神經(jīng)元減少,伴有握力下降及運動功能協(xié)調(diào)障礙[20]。在肌萎縮側(cè)索硬化癥(ALS)中,發(fā)現(xiàn)運動神經(jīng)元及其調(diào)控的神經(jīng)肌肉接頭(neuromuscular junction,NMJ)發(fā)生病理改變,而線粒體自噬對于維持神經(jīng)肌肉接頭功能有重要作用[21-22]。線粒體功能障礙在杜氏肌營養(yǎng)不良(DMD)肌肉受損前發(fā)生,提示其可能為杜氏肌營養(yǎng)不良的病理因素[23]。在DMD動物模型及DMD患者的骨骼肌中,參與線粒體自噬的相關(guān)基因PINK1、PARK2、BNIP3表達顯著降低,線粒體自噬功能受損,導(dǎo)致線粒體功能障礙[24]。Wang等[25]研究發(fā)現(xiàn),MG患者的調(diào)節(jié)性T細胞(CD4+CD25+T,Tregs)可能存在線粒體自噬小體成熟障礙,線粒體自噬減少,自噬相關(guān)蛋白LC3Ⅱ的表達降低。陽玉潔等[26]發(fā)現(xiàn)重癥肌無力患者外周血調(diào)節(jié)性T細胞(Tregs)線粒體受損細胞比例較正常對照組明顯增高。與MG組比較,加入線粒體自噬激活劑羰基氰化物間氯苯腙(CCCP)的MG組受損線粒體減少,而使用線粒體自噬抑制劑環(huán)孢素(CsA)培養(yǎng)的MG組則顯示Tregs能量代謝紊亂加劇,受損線粒體增加。

圖2 PINK1/Parkin通路介導(dǎo)線粒體自噬過程示意圖

3 基于線粒體自噬對中醫(yī)“脾-線粒體相關(guān)”的再認識

脾為后天之本、氣血生化之源,脾主運化,化氣生血,布散水谷精微、津液,以滋潤、濡養(yǎng)五臟六腑、四肢百骸,供給機體生命活動所需的物質(zhì)及能量。脾氣充足、脾陽旺盛,則運化功能正常,供能充足,各司其職。線粒體是細胞內(nèi)進行能量合成的細胞器,能量轉(zhuǎn)化、三羧酸循環(huán)和氧化磷酸化等在其內(nèi)進行。線粒體是單個細胞乃至整個生命體進行需氧、需能活動的樞紐和核心。脾氣充足,運化生成能量物質(zhì)與線粒體供能的功能不謀而合。

現(xiàn)代研究發(fā)現(xiàn),正常大鼠海馬神經(jīng)元中線粒體在電鏡下可觀察到明顯的自噬現(xiàn)象,而脾虛大鼠的線粒體存在嵴減少和空泡化,并且自噬現(xiàn)象較少,PINK1、Parkin和LC3-Ⅱ蛋白表達下降和LC3-Ⅱ/Ⅰ比值降低[27]。脾氣虛時大鼠的海馬神經(jīng)元線粒體的穩(wěn)態(tài)受到損害,自噬水平下降,可導(dǎo)致海馬對胃腸道的調(diào)控能力減弱[28],影響胃腸道的消化吸收功能。脾虛證的大鼠海馬神經(jīng)元中的線粒體的能量代謝障礙,海馬神經(jīng)元損傷可影響脾主運化的功能,使脾虛者更虛。此外,有研究發(fā)現(xiàn),脾氣虛時大鼠胃黏膜細胞線粒體的膜電位下降,且線粒體中的PINK1、Parkin、LC3-Ⅱ蛋白表達低于正常大鼠,而p62蛋白表達上升,可見脾氣虛證的大鼠胃黏膜細胞的線粒體自噬平衡受到破壞,自噬水平降低,其PINK1-Parkin自噬通路受到一定的抑制,導(dǎo)致線粒體內(nèi)嵴明顯減少和ATP合成減少,提示脾虛證伴隨著線粒體的失衡[29]。線粒體質(zhì)量控制與線粒體自噬密不可分,亦與脾主運化緊密相關(guān)。脾氣虛時,線粒體自噬穩(wěn)態(tài)被打破,線粒體自噬能力的下降,使線粒體能量代謝障礙,為機體供能不足,可致機體功能失調(diào)。

4 健脾益氣法是調(diào)控脾虛重癥肌無力線粒體自噬的有效治法

《素問·太陰陽明論篇》曰:“四肢皆稟氣于胃,而不得至經(jīng),必因于脾,乃得稟也?！彼闹枰玫綇奈甘芗{、腐熟水谷化生的水谷精微之氣的營養(yǎng),但是精微之氣不能直接達于四肢,依賴于脾氣的運化作用才能使四肢得到水谷精微之氣的滋養(yǎng)、氣血津液之氣的濡養(yǎng)、營衛(wèi)之氣的溫養(yǎng)。脾虛則運化不能,在線粒體可表現(xiàn)為線粒體生物合成功能失調(diào)、線粒體自噬水平低下,四肢乏源則失用。

Wu等[30]發(fā)現(xiàn)四君子湯可能通過提高線粒體呼吸鏈酶活性和線粒體ATP含量對自身免疫性重癥肌無力大鼠腓腸肌線粒體和神經(jīng)肌肉接頭處超微結(jié)構(gòu)有修復(fù)作用,且實驗結(jié)果顯示四君子湯療效優(yōu)于強的松。課題組前期研究發(fā)現(xiàn),經(jīng)高劑量健脾益氣方藥強肌健力方干預(yù)后,實驗性自身免疫性重癥肌無力(EAMG)大鼠骨骼肌中線粒體融合分裂相關(guān)基因Mfn1、OPA1、Drp1、Fis1的mRNA及蛋白表達較模型組EAMG大鼠顯著升高,可在一定程度上修復(fù)EAMG大鼠骨骼肌肌原纖維和線粒體的結(jié)構(gòu),恢復(fù)線粒體呼吸鏈復(fù)合體Ⅰ～Ⅳ酶活性,并且可能通過激活A(yù)MPK/PGC-1α信號通路,促進線粒體生物合成發(fā)生,從而改善MG的癥狀[31-32]。亦有研究發(fā)現(xiàn),與正常大鼠相比,EAMG大鼠骨骼肌線粒體的ATP 酶活性明顯降低,骨骼肌損傷明顯,經(jīng)強的松及葛根及其配伍復(fù)方治療后均可在一定程度上修復(fù)骨骼肌,提高ATP酶活性及促進肌肉生成調(diào)控因子如成纖維細胞生長因子(FGF)、神經(jīng)生長因子(NGF)和胰島素樣生長因子(IGFs)的表達,以健脾益氣、祛濕活血的葛芪參妙組 (葛根、黃芪、丹參和四妙散)改善最為明顯[33-34]。

黃琳文等[35]運用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)挖掘了補中益氣湯通過多靶點、多通路治療MG,主要涉及調(diào)節(jié)活性氧代謝過程、DNA 結(jié)合轉(zhuǎn)錄因子活性調(diào)節(jié)、脂多糖反應(yīng)等生物過程。徐鵬等[36]運用文獻數(shù)據(jù)挖掘發(fā)現(xiàn)中醫(yī)藥治療MG多以補虛為主,兼以清熱、祛濕、解毒為法,組方核心為補中益氣湯。臨床研究發(fā)現(xiàn)嶺南地區(qū)的重癥肌無力患者皆以脾虛證為主,伴隨濕熱證、腎陰虛或腎陽虛,主要治法為健脾益氣補虛,用藥皆以補中益氣湯為基礎(chǔ)加減,重用健脾補氣藥[37]。針刺“足三里”穴位可治療胃腸病證、下肢痿痹、虛勞諸證等,董佳梓等[38]發(fā)現(xiàn)針刺強壯保健要穴“足三里”,可上調(diào)LC3-Ⅱ/Ⅰ,有效提高脾虛證大鼠骨骼肌線粒體自噬能力,起到健脾益氣、強肌健力的作用。

健脾益氣治法中方藥乃至穴位針灸可促進線粒體自噬清除“廢物”,線粒體在缺氧、氧化應(yīng)激、炎癥刺激等情況下,通過誘導(dǎo)線粒體自噬清除受損的線粒體,保障線粒體的結(jié)構(gòu)和功能的正常,以保障對肌肉的供能,維持四肢肌肉的正常運動功能。

5 展 望

線粒體自噬能選擇性地有效清除功能障礙或不需要的線粒體,對維持線粒體及細胞的穩(wěn)態(tài)具有重要意義。脾虛是重癥肌無力發(fā)生發(fā)展的重要病機,線粒體自噬穩(wěn)態(tài)失衡亦是重癥肌無力發(fā)生發(fā)展的重要表現(xiàn)。健脾益氣法通過調(diào)控線粒體自噬,保障線粒體功能,是治療重癥肌無力的有效治法。本文通過探討中醫(yī)理論“脾藏肌肉之氣”、線粒體自噬與疑難病重癥肌無力的關(guān)系,將傳統(tǒng)中醫(yī)理論與現(xiàn)代科學(xué)研究相結(jié)合,深入闡明健脾益氣法治療重癥肌無力的科學(xué)內(nèi)涵,為中醫(yī)藥治療神經(jīng)肌肉病提供了新方向。基于線粒體自噬探討健脾益氣法治療重癥肌無力具有重要的科學(xué)價值,其中介導(dǎo)線粒體自噬所涉及的相關(guān)信號通路及其調(diào)控機制仍是未來研究聚焦的重點和難點。

利益沖突:所有作者均聲明不存在利益沖突。