林烈員 高建亭 張艷 師鑫潮 劉海隆 何欣

（1. 海南省?？谑行阌^(qū)東山鎮(zhèn)農(nóng)業(yè)服務中心 海南?？?571100；2. 河北農(nóng)業(yè)大學動物醫(yī)學院河北保定 071000；3. 海南省農(nóng)業(yè)科學院畜牧獸醫(yī)研究所 海南?？?571100）

地膽草（Elephanltopus scaberL.）為菊科地膽草屬草本植物[1]，主要分布于我國廣東、浙江及福建等地，可全草入藥。具有清熱解毒、消腫利尿等功效，常用于感冒、急性扁桃體炎、結膜炎、水腫等疾病的治療[2]。炎癥是人和動物常見的綜合性病理過程，是具有血管系統(tǒng)的活體組織對致炎因子產(chǎn)生的以防御為主的病理反應，可分為急性炎癥和慢性炎癥。其中急性炎癥是指機體受到致炎因子刺激后短時間內(nèi)表現(xiàn)出的反應。胸膜炎是最常見的炎癥性疾病之一，許多危害生命的疾病，如結核病、肺炎等，都與胸膜炎有關[3]。角叉菜膠致大鼠胸膜炎模型是一種理想的急性炎癥模型，常用于檢測藥物的抗炎效果[4]。對于嚙齒動物而言，將角叉菜膠注入胸腔后可激活激酶，促進炎癥因子釋放，激活以中性粒細胞為主的炎性細胞，聚集在炎癥部位。因此，借助此模型，通過測定炎性因子水平、MDA 含量等，可以研究藥物的抗炎效果。

本研究采用乙醇回流法對地膽草活性物質(zhì)進行提取，考察不同濃度提取物對大鼠急性胸膜炎作用效果，初步探討其抗炎機制，為其研發(fā)和應用提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 試驗動植物 健康昆明種雄性大鼠，購于斯貝福（北京）生物技術有限公司，體重（250 ±20.0）g，生產(chǎn)許可證號SCXK（京）2019-0010。將購買的大鼠適應性飼養(yǎng)一周，期間保持通風，試驗開始前12 h 禁食不禁水。地膽草，2022 年3月采集于海南?？谑袞|山鎮(zhèn)。

1.1.2 藥品與儀器 （1）藥品 地塞米松磷酸鈉注射液（5 mg/mL），山西兆益有限公司; 角叉菜膠，上海麥克林生化科技有限公司；肝素鈉注射液，天津生物化學制藥有限公司；無水乙醇，天津市匯杭化工科技有限公司；0.9%生理鹽水注射液，石藥銀湖制藥有限公司；吐溫-80 及其他溶劑，福晨化學試劑有限公司；大鼠一氧化氮（NO）ELISA檢測試劑盒（上海一研生物科技有限公司）；大鼠丙二醛（MDA）、前列腺素E2（PGE2）、腫瘤壞死因子（TNF-α）和白細胞介素-1β(IL-1β) ELISA 檢測試劑盒（上海臻科生物科技有限公司）。

（2）儀器 提取濃縮罐，北京錦富仁豪科技發(fā)展有限公司；RE-5205 旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀，上海亞榮生化儀器廠；SHD-Ⅲ型循環(huán)水式多用真空泵，保定高新區(qū)陽光科教儀器廠；TGL-16B 離心機，上海安亭科學儀器廠。

1.2 方法

1.2.1 地膽草乙醇提取物的制備 使用乙醇回流提取法對地膽草中的有效成分進行提?。悍Q取地膽草2 600 g，加95%乙醇回流提取2 次，第一次加15 倍量乙醇提取2 h，第二次加10 倍量乙醇提取1 h；合并初提液，減壓濃縮，回收乙醇，濃縮瓶中有掛壁后取乙醇總提取物適量，其余藥液濃縮至浸膏，加入熱水500 mL，充分攪拌，備用。

1.2.2 動物模型建立及給藥 將試驗動物隨機分為5 組，對照組分為陰性對照組（灌服5%吐溫-80），陽性對照組（灌服0.5 mg/kg 地塞米松）；試驗組分別為低劑量組（按生藥量計為7.5 g/kg）、中劑量組（按生藥量計為15 g/kg）、高劑量組（按生藥量計為30 g/kg）。按照1 mL/hg 每日灌胃1次，連續(xù)7 d；末次給藥30 min 后，用10%水合氯醛按照0.4 mL/hg 劑量腹腔注射對大鼠進行麻醉[5]，仰臥位固定，右側(cè)胸腔部位剃毛，酒精擦拭消毒；按照0.2 mL/hg 劑量[6]在右上肢下第7、第8 肋骨間向右胸膜腔內(nèi)[7]，注入1%無菌角叉菜膠溶液致炎[8-9]，為避免肺臟受到損傷，該操作應在短時間內(nèi)完成[10]。

1.2.3 取樣及測定 致炎4 h 后麻醉大鼠，眶竇采血并處死；將全血于5 000 r/min 條件下離心5 min，取上清液按試劑盒說明書操作測定炎癥因子NO、MDA、PGE2、TNF-α和IL-1β的含量。

將大鼠仰臥位固定，酒精擦拭消毒后用手術剪剪開胸腹部皮膚，暴露肌肉層，往胸腔內(nèi)注入2 mL 生理鹽水胸腔洗液（含5 U/mL 肝素）[11-12]，輕輕搖晃，使胸腔內(nèi)液體混合均勻；取胸腔滲出液，于5 000 r/min 條件下離心5 min，取上清液，按試劑盒說明書測定MDA、PGE2、TNF-α和IL-1β的含量。

1.2.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計與分析 采用SPSS19.0 統(tǒng)計分析軟件處理，實驗數(shù)據(jù)用（平均值±標準差）表示，采用t檢驗及單因素方差分析。p＜0.05 表示差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果與分析

2.1 地膽草提取物含量

結果顯示，地膽草乙醇提取物提取率為30.58%，提取物1 g 相當于原生藥3.27 g。本研究選擇最高劑量為浸膏原液，將中、低劑量進行了相應稀釋。

2.2 血清中炎癥因子含量

血清中炎癥因子含量如表1 所示。與陰性對照組比較，陽性對照組明顯降低了血清中NO、MDA、PGE2、TNF-α和IL-1β的含量（p＜0.05 或p＜0.01）；地膽草乙醇提取物不同劑量組均可不同水平降低血清中炎癥因子的含量。與陰性對照組相比，高、中、低劑量組均可明顯降低血清中TNF-α含量（p＜0.05 或p＜0.01），高劑量組與陽性對照組無顯著差異；高、中劑量組明顯降低了（p＜0.05 或p＜0.01）血清中NO、MDA 和IL-1β含量，其中高劑量組對MDA、TNF-α和IL-1β的影響顯著優(yōu)于中劑量組；只有高劑量組顯著降低了血清中PGE2含量。

表1 大鼠血清中炎癥因子含量[（x ± s），n=6]

2.3 胸腔液中炎癥因子含量

胸腔液中炎癥因子含量結果如表2 所示。與陰性對照組比較，陽性對照組明顯降低了（p＜0.05或p＜0.01）胸腔液中MDA、PGE2、TNF-α和IL-1β含量；地膽草乙醇提取物的3 個劑量組均明顯降低了（p＜0.05）胸腔液中TNF-α的含量；中劑量組和高劑量組明顯降低了（p＜0.05 或p＜0.01）胸腔液中MDA、PGE2和IL-1β的含量，且高劑量組對PGE2的影響顯著高于中劑量組，效果和陽性對照組無顯著性差異。

表2 大鼠胸腔液中炎癥因子含量[（x ± s），n＝6]

3 討論與結論

3.1 討論

角叉菜膠誘導的大鼠急性胸膜炎被廣泛應用于抗炎藥物的篩選與評價，是一種理想的急性滲出性炎癥模型[13]。炎性刺激可引起大量炎性介質(zhì)的分泌，易于檢測出與炎癥反應相關的因子水平[14-16]，故大鼠胸膜炎炎癥介質(zhì)含量可作為衡量炎癥的重要指標。

NO 能調(diào)節(jié)炎癥反應，炎癥發(fā)生時，刺激物促進NO 的合成和釋放，進而促進炎癥反應進行；MDA 可反應機體自由基與脂類反應的情況；PGE2在炎癥反應中發(fā)揮重要作用，能夠促進其他因子作用，使白細胞聚集在炎性區(qū)域，從而引起組織水腫、充血等炎癥反應[17]；TNF-α是一種促炎性因子，可通過多種生物學途徑誘發(fā)或激活體內(nèi)產(chǎn)生多種炎癥介質(zhì)，炎癥介質(zhì)共同作用引起組織損傷和細胞凋亡[18-19]；IL-1β是參與炎癥反應最重要的細胞因子之一，可以增加PGE2的分泌，參與介導急性炎癥反應，促進白細胞聚集在局部炎癥部位。本試驗中，地膽草乙醇提取物能夠降低血清和胸腔液中NO、PGE2、TNF-α和IL-1β的含量，降低MDA 的含量，表明地膽草乙醇提取物抑制大鼠急性胸膜炎的作用機制可能與其抗氧化和抑制炎癥因子釋放有關。

Wan 等[20]研究發(fā)現(xiàn)，高濃度地膽草乙醇提取物能夠作為乙醇誘導的肝損傷保肝藥物，減輕肝臟的損傷情況，且大鼠口服地膽草提取物安全無毒副作用。為探究地膽草水提物的抗炎效果，溫先敏等[21]建立了角叉菜膠誘導的大鼠足趾腫脹模型，并比較各組大鼠給藥后不同時間右后足趾腫脹度及抑制率，結果發(fā)現(xiàn)，當給藥劑量為0.45 g/kg（約相當于生藥量38.67 g/kg）時對足趾腫脹有抑制作用。為測試地膽草不同溶劑提取物的半數(shù)致死量（LD50），有關學者對地膽草不同溶劑提取物進行了大鼠急性毒性試驗，結果表明，提取物在5 000 mg/kg（約相當于生藥量16.35 g/kg）的劑量下，大鼠未出現(xiàn)死亡情況[22]。按照0.4 g/kg劑量（約相當于生藥量8.25 g/kg）給炎癥模型大鼠灌服地膽草提取物，研究發(fā)現(xiàn)，與對照組相比，給藥組對角叉菜膠誘導的炎癥有明顯的抑制作用[23]。本試驗中使用的浸膏質(zhì)地粘稠，且高劑量組使用浸膏原液，為保證灌胃藥液的流動狀態(tài)，最終設置劑量分組為：低劑量組（按生藥量計為7.5 g/kg）、中劑量組（按生藥量計為15 g/kg）、高劑量組（按生藥量計為30 g/kg）。

3.2 結論

本研究結果表明，地膽草乙醇提取物能抑制角叉菜膠誘導的急性胸膜炎大鼠胸腔液和血清中NO、MDA、PGE2、TNF-α和IL-1β的含量，抗炎效果為高劑量＞中劑量＞低劑量，初步提示其抗炎機制可能與其抑制炎癥因子的釋放及抗氧化作用有關。