譚炯銳，查同剛，張澤宇，張曉霞，滕紅梅，李成奇，王玲麗，趙莉麗，王 奧，姚紫懿

（1.運(yùn)城學(xué)院生命科學(xué)系, 山西 運(yùn)城 044000；2.北京林業(yè)大學(xué)水土保持學(xué)院, 北京 100083；3.中建一局集團(tuán)第三建筑有限公司, 北京 100161；4.北京八達(dá)嶺林場, 北京 102102）

干旱和半干旱荒漠區(qū)降水極少、地表溫度高、溫差大、土壤貧瘠且鹽堿化程度高、風(fēng)蝕水蝕強(qiáng)烈，水土流失嚴(yán)重。生長在干旱半干旱荒漠區(qū)的植物，在長期的自然進(jìn)化中形成了多樣性較高的干旱脅迫適應(yīng)策略，因此荒漠植物對干旱脅迫的適應(yīng)和響應(yīng)研究一直是荒漠生態(tài)研究的熱點(diǎn)。

植物對干旱脅迫的響應(yīng)過程包括脅迫感知、信號轉(zhuǎn)導(dǎo)和抗旱相關(guān)基因表達(dá)。脫落酸(abscisic acid,ABA)信號通路是植物應(yīng)對干旱脅迫的核心信號通路，ABA 通過抑制PP2Cs的表達(dá)來激活SnRK2s，被激活的SnRK2s可磷酸化下游干旱脅迫響應(yīng)基因[1]。此外生長素(auxin, IAA)、乙烯(ethylene)和茉莉酸(jasmonic acid, JA)等激素信號通路也參與干旱脅迫響應(yīng)調(diào)節(jié)。鈣離子(Ca2+)是第二信使，干旱脅迫時(shí)Ca2+通道感知細(xì)胞膨壓降低，使膜內(nèi)產(chǎn)生Ca2+峰值[2]。Ca2+信號可激活CPKs和CBLs-CIPKs參與信號的檢測和傳遞[1]。絲裂原活化蛋白激酶(MAPK)家族成員也參與非生物脅迫信號的傳遞[3]?；钚匝?reactive oxygen species, ROS)也作為信號分子參與干旱脅迫響應(yīng)[4]。轉(zhuǎn)錄因子在從信號接收到干旱脅迫相關(guān)基因表達(dá)的中間過程發(fā)揮著重要的信號級聯(lián)作用[5]。

脅迫信號的成功轉(zhuǎn)導(dǎo)啟動后續(xù)生理和形態(tài)層面的干旱恢復(fù)機(jī)制。形態(tài)方面如較厚的表皮、柵欄組織，較發(fā)達(dá)的維管束鞘，葉片面積縮小而厚度增加等；生理方面如滲透調(diào)節(jié)、光合響應(yīng)、呼吸作用等。植物積累脯氨酸、可溶性蛋白、糖、生物堿等代謝物質(zhì)維持滲透平衡[6-7]。對于過量的ROS，植物可以通過酶促防御系統(tǒng)(SODs、PODs、CATs 和硫氧還蛋白等)和非酶自由基清除劑(脯氨酸、谷胱甘肽、抗壞血酸和黃酮類等)抵御氧自由基破壞、保護(hù)細(xì)胞膜系統(tǒng)的完整性[5]。

植物生理和形態(tài)層面的干旱脅迫響應(yīng)過程均受到基因表達(dá)的調(diào)控，為了探究與干旱相關(guān)的基因表達(dá)網(wǎng)絡(luò)及其調(diào)控機(jī)制，已經(jīng)有大量關(guān)于模式植物和作物的抗旱轉(zhuǎn)錄組測序研究。而對荒漠區(qū)植物抗旱機(jī)制的轉(zhuǎn)錄組測序研究相對較少，近年來可見到梭梭(Haloxylon ammodendron)[8]、檸條(Caragana korshinskii)[9]、白 刺(Nitraria tangutorum)[10]、苜 蓿(Medicago falcata)[11]、 沙 冬 青 (Ammopiptanthus mongolicus)[12]和胡楊(Populus euphratica)[13]等植物的報(bào)道。一年生草本植物霧冰藜(Bassia dasyphylla)為藜科樟味藜族霧冰藜屬，常分布于荒漠、半荒漠區(qū)和鹽堿地[14]。霧冰藜耐旱抗風(fēng)沙，是干旱區(qū)退化土地植被恢復(fù)初期的優(yōu)勢物種[15]，具有優(yōu)異的抗旱基因資源。目前對霧冰藜抗旱性的研究多為形態(tài)結(jié)構(gòu)和生理層面等的研究[16-17]，對霧冰藜抗旱分子機(jī)制的研究鮮見報(bào)道。因此本研究以內(nèi)蒙古烏拉山礦山廢棄地周邊優(yōu)勢物種霧冰藜為研究對象，對播種盆栽苗進(jìn)行干旱脅迫梯度處理，研究其在不同程度干旱脅迫下葉片解剖結(jié)構(gòu)、生理指標(biāo)和基因表達(dá)的響應(yīng)變化。研究結(jié)果為霧冰藜抗旱分子機(jī)制解析提供理論支撐，也為荒漠植物抗旱基因資源的挖掘利用提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料栽培與處理

霧冰藜種子采自內(nèi)蒙古烏拉山礦山廢棄地周邊。選用高15.2 cm、內(nèi)徑18.5 cm 的塑料盆進(jìn)行溫室盆栽，泥炭土和珍珠巖(3 ∶ 1)混合基質(zhì)，每盆播種30 粒。溫室光照12 h，光強(qiáng)520 μmol·(m2·s)-1，溫度25 ℃，濕度50%。對長勢一致的霧冰藜設(shè)5 個干旱脅迫梯度處理，每處理10 盆。播種后30 d 開始控水處理，并根據(jù)土壤相對含水量劃分脅迫等級[18]：(1)脅迫0 d，田間持水量的80%；(2)脅迫7 d，田間持水量的61%，輕度水分脅迫；(3)脅迫14 d，田間持水量的49%，中度水分脅迫；(4)脅迫21 d，田間持水量的42%，中度水分脅迫；(5)脅迫28 d，田間持水量的36%，重度水分脅迫。采集各處理枝條中部大小一致的成熟葉片用于后續(xù)測定。各處理均勻混合樣采后一部分立即投于液氮，存于-80 ℃冰箱用于提取RNA 和生理指標(biāo)測定；另一部分投入福爾馬林-乙酸-乙醇(FAA)固定液(18 ∶ 1 ∶ 1)，用于石蠟切片。

1.2 石蠟切片及分析

用FAA 固定的葉片經(jīng)酒精梯度脫水，無水乙醇、二甲苯透明，用二苯甲苯和石蠟溶液進(jìn)行浸蠟處理，然后包埋。切片番紅固綠染色、透明、干燥，中性樹膠封片。Nikon Eclipse Ci-S 顯微鏡觀察并拍照，用CaseViewer 2.3 軟件測量表皮厚度、葉片厚度、貯水組織厚度和主維管束面積，每個處理10 個重復(fù)。

1.3 生理指標(biāo)測定及分析

酸性茚三酮法測定脯氨酸含量，考馬斯亮藍(lán) G-250 染色法測定可溶性蛋白含量，四氯化鈦比色法測定過氧化氫含量，硫代巴比妥酸比色法(TBA)測定丙二醛(malondialdehyde, MDA)含量，愈創(chuàng)木酚顯色法測定過氧化物酶(peroxidase activity, POD)活性，氮藍(lán)四唑(NBT)染色法測定超氧化物歧化酶(superoxide dismutase, SOD)活性，紫外吸收法測定過氧化氫酶(catalase, CAT)活性[19]，每個處理6 次重復(fù)。

1.4 轉(zhuǎn)錄組測序及分析

葉片總RNA 用植物總RNA 提取試劑盒(天根生化科技北京有限公司)提取，按說明書操作具體步驟，每個處理3 次重復(fù)。對RNA 進(jìn)行質(zhì)量檢測，合格后進(jìn)行建庫測序。對raw data 進(jìn)行過濾后得到高質(zhì)量clean data。利用Trinity (http://trinityrnaseq.git hub.io/)軟件進(jìn)行拼接。對拼接后得到的基因進(jìn)行基因功能注釋(5 大數(shù)據(jù)庫Nr，Pfam，Swiss-prot，KEGG，GO)。利用FeatureCounts 軟件將每個基因在不同樣本中表達(dá)量進(jìn)行FPKM 值的計(jì)算。樣品間基因表達(dá)差異，用 DESeq2 進(jìn)行差異表達(dá)分析，將padj ＜0.05，|log2fold change| ≥ 1 作為差異顯著性的篩選標(biāo)準(zhǔn)。差異表達(dá)基因(differentially expressed genes, DEG)的GO (Gene Ontology)富集分析使用GOseq，用KOBAS 2.0進(jìn)行KEGG (Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes)富集分析，P＜ 0.05。脅迫相關(guān)通路和差異表達(dá)基因用mapman 軟件進(jìn)行分析和作圖。

1.5 實(shí)時(shí)熒光定量 PCR

在比較組7 d 與0 d、14 d 與0 d、21 與0 d 和28 d 與0 d 的差異表達(dá)基因中隨機(jī)選6 個基因，進(jìn)行qRT-PCR 分析，內(nèi)參基因?yàn)镋F1A(表1)。使用反轉(zhuǎn)錄試劑盒Prime ScriptTMRT (Takara)對RNA 進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄得到cDNA。實(shí)時(shí)熒光定量PCR 采用SYBR Green I dye (Takara)進(jìn)行，擴(kuò)增體系為95 ℃ 3 min；95 ℃ 30 s，56 ℃ 30 s，72 ℃ 40 s，共35 個循環(huán)；72 ℃10 min[20]。每個處理3 次生物學(xué)重復(fù)，每次生物學(xué)設(shè)3 次技術(shù)重復(fù)。

表1 差異表達(dá)基因引物序列Table 1 Primers of differentially expressed genes

1.6 數(shù)據(jù)分析

葉片解剖結(jié)構(gòu)和生理指標(biāo)數(shù)據(jù)用SPSS 17.0 軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，結(jié)果數(shù)據(jù)表示為平均值 ± 標(biāo)準(zhǔn)誤。對不同處理數(shù)據(jù)的差異顯著性分析用單因素方差分析法，多重比較用LSD 法進(jìn)行。

2 結(jié)果

2.1 干旱脅迫下霧冰藜葉片解剖結(jié)構(gòu)變化

霧冰藜的表皮細(xì)胞排列較整齊，向內(nèi)較長的圓柱形細(xì)胞為葉肉細(xì)胞，可見含晶細(xì)胞。維管束和葉肉細(xì)胞之間有薄壁細(xì)胞構(gòu)成的維管束鞘。葉肉細(xì)胞、維管束鞘細(xì)胞和維管束共同構(gòu)成弧形結(jié)構(gòu)，而非閉合的環(huán)形結(jié)構(gòu)?；⌒谓Y(jié)構(gòu)內(nèi)是薄壁細(xì)胞構(gòu)成的發(fā)達(dá)的貯水組織，貯水組織中間的維管束較大。脅迫0 d時(shí)，葉肉細(xì)胞較整齊地排列在弧形外側(cè)，偶有含晶細(xì)胞，貯水組織細(xì)胞充盈；7 d 時(shí)，部分貯水組織細(xì)胞縮小，含晶細(xì)胞增多；14 d 時(shí)弧形結(jié)構(gòu)的連續(xù)性變差，貯水組織薄壁細(xì)胞的細(xì)胞壁向外凸起；21 d 時(shí)貯水組織薄壁細(xì)胞縮小變??；28 d 時(shí)表皮向內(nèi)皺縮，貯水組織極度收縮，含晶細(xì)胞在維管束之外(圖1)。

圖1 不同程度干旱脅迫下霧冰藜葉片解剖結(jié)構(gòu)Figure 1 Anatomical structures of the leaves of Bassia dasyphylla under different degrees of drought stress

貯水組織厚度隨干旱脅迫時(shí)間延長逐漸降低，28 d 時(shí)降到最低(106.93 μm)。主維管束面積在干旱脅迫下先減小后增大，14 d 時(shí)最小(3 386.23 μm2)。葉片厚度隨干旱脅迫呈先增后減的變化，脅迫7 和14 d 時(shí)顯著增加(P＜ 0.05)。表皮厚度隨干旱脅迫呈先增后減的變化，脅迫7 d 時(shí)最厚(42.73 μm) (表2)。

表2 霧冰藜葉片解剖結(jié)構(gòu)各參數(shù)隨干旱脅迫的變化Table 2 Changes of anatomical parameters of leaves of Bassia dasyphylla with drought stress

2.2 干旱脅迫下霧冰藜葉片生理指標(biāo)變化

干旱脅迫下霧冰藜葉片可溶性蛋白含量無顯著變化。脯氨酸含量在干旱脅迫21 d 時(shí)最高(P＜0.05)，為49.68 μg·g-1。SOD 在干旱脅迫28 d 時(shí)活性最高，但與脅迫21 d 相比差異不顯著(P＞ 0.05)，干旱脅迫7 d 時(shí)活性顯著低于除脅迫14 d 外的其他處理。POD 活性隨干旱脅迫先升高后降低，14 d 時(shí)活性最高(P＜ 0.05)，為38.08 U·g-1。干旱導(dǎo)致CAT活性降低(P＜ 0.05)。過氧化氫含量隨干旱脅迫先升高后降低，14 和21 d 時(shí)顯著高于其他處理。21 d時(shí)丙二醛含量最低(P＜ 0.05)，為17.39 nmol·g-1(表3)。

表3 霧冰藜葉片生理指標(biāo)隨干旱脅迫的變化Table 3 Changes of physiological indexes of leaves of Bassia dasyphylla with drought stress

2.3 干旱脅迫下霧冰藜轉(zhuǎn)錄組分析

霧冰藜轉(zhuǎn)錄組測序各樣本測序數(shù)據(jù)量均高于6 G。每個文庫的clean reads 大于4 900 萬條，共15 個文庫超過7 億條。每個樣品文庫的Q30 高于95%，Q20 高于98%，GC 堿基比例均大于46%，測序質(zhì)量滿足高通量測序的要求。干旱脅迫7 d 與0 d 比較組鑒定出1 860 個DEGs，17 個下調(diào)基因，1 843 個上調(diào)基因；干旱脅迫14 d 與0 d 比較組鑒定出2 781 個DEGs，210 個下調(diào)基因，2 571 個上調(diào)基因；干旱脅迫21 d 與0 d 比較組鑒定出1 550 個DEGs，101 個下調(diào)基因，1 449 個上調(diào)基因；在干旱脅迫28 d 與0 d 比較組鑒定出819 個DEGs，443 個下調(diào)基因，376 個上調(diào)(圖2)。實(shí)時(shí)熒光定量PCR 結(jié)果與轉(zhuǎn)錄組測序結(jié)果的相關(guān)性高于0.87 (圖3)，說明轉(zhuǎn)錄組測序準(zhǔn)確可靠。

圖2 不同程度干旱脅迫差異表達(dá)基因火山圖Figure 2 Volcano plots of differentially expressed genes under different degrees of drought stress

圖3 實(shí)時(shí)熒光定量PCR 驗(yàn)證RNA-seq 數(shù)據(jù)Figure 3 Real-time fluorescence quantitative PCR validation RNA-seq data

2.4 差異表達(dá)基因GO 功能顯著性富集分析

GO 富集分析結(jié)果表明，在7 d 時(shí)差異表達(dá)基因主要富集在有機(jī)氮復(fù)合代謝過程、有機(jī)氮化合物的生物合成過程、蛋白結(jié)合、分子功能、細(xì)胞外外泌體、細(xì)胞外細(xì)胞器等條目。干旱脅迫14 d 時(shí)，主要富集在氧化磷酸化、有機(jī)氮復(fù)合代謝過程、蛋白結(jié)合、結(jié)合、細(xì)胞外外泌體、細(xì)胞外細(xì)胞器等條目。干旱脅迫21 d 時(shí)，防御反應(yīng)、細(xì)胞對細(xì)胞因子刺激的反應(yīng)、分子功能、雜環(huán)化合物結(jié)合、細(xì)胞外外泌體、細(xì)胞外細(xì)胞器等條目。干旱脅迫28 d 時(shí)，主要富集在嘌呤核糖核苷酸的代謝過程、ATP 代謝過程、電子轉(zhuǎn)移活性、陽離子轉(zhuǎn)運(yùn)ATP 酶活性、細(xì)胞質(zhì)部分和線粒體包膜等條目中(表4)。

表4 差異表達(dá)基因GO 富集前5 名條目Table 4 Top 5 terms of GO enrichment analysis of the differentially expressed genes

2.5 差異表達(dá)基因 KEGG 富集分析

KEGG 富集分析結(jié)果(表5)表明，在干旱脅迫7 d時(shí)，差異表達(dá)基因主要富集在核糖體、氧化磷酸化、蛋白酶體、剪接體、細(xì)胞衰老等通路中；干旱脅迫14 d時(shí)，主要富集在核糖體、氧化磷酸化、壞死性凋亡、蛋白酶體、光合作用等通路中；干旱脅迫21 d 時(shí)，主要富集在核糖體、氧化磷酸化、壞死性凋亡、碳代謝、蛋白酶體等通路中；干旱脅迫28 d 時(shí)，主要富集在氧化磷酸化、代謝途徑、戊糖和葡糖醛酸鹽的相互轉(zhuǎn)化、雙組分系和檸檬酸循環(huán)(TCA 循環(huán))等通路中。

表5 差異表達(dá)基因KEGG 富集分析Table 5 KEGG enrichment analysis of differentially expressed genes

2.6 氧化磷酸化通路差異表達(dá)基因分析

氧化磷酸化途徑差異表達(dá)基因隨干旱脅迫的變化趨勢總體聚為兩簇，靠下的一簇基因數(shù)量更多，受到干旱脅迫后先上調(diào)表達(dá)，隨后下調(diào)表達(dá)，干旱脅迫28 d 時(shí)表達(dá)量最低；靠上的一簇基因在受到干旱脅迫后持續(xù)上調(diào)表達(dá)(圖4)。持續(xù)上調(diào)表達(dá)的基因包括復(fù)合物Ⅰ (NADH 脫氫酶)的成員ND5、NDUFS2和NDUFV1，復(fù)合物Ⅲ (細(xì)胞色素bc1 復(fù)合體)的成員UQCRFS1等，復(fù)合物Ⅳ (細(xì)胞色素c 氧化酶)成員COX1和COX3等和復(fù)合物(ATP 合成酶)的成員ATPeF1D和ATPeF0C等(圖4)。

圖4 氧化磷酸化途徑差異表達(dá)基因Figure 4 Differentially expressed genes of oxidative phosphorylation pathway

2.7 脅迫相關(guān)差異表達(dá)基因分析

脅迫相關(guān)基因在干旱脅迫7、14 和21 d 時(shí)多數(shù)上調(diào)表達(dá)，28 d 時(shí)下調(diào)表達(dá)基因變多(圖5)。差異表達(dá)基因主要分布于氧化還原系統(tǒng)、信號、轉(zhuǎn)錄因子、熱激蛋白、次級代謝物、激素信號、細(xì)胞壁、葡聚糖和蛋白質(zhì)水解等通路上。干旱脅迫7、14 和21 d 時(shí)，信號中的Ca2+依賴蛋白激酶CDPK9和CDPK7基因上調(diào)；激素信號途徑中的生長素(auxin,IAA)、油菜素類固醇(brassinosteroids，BR)、茉莉酸(jasmonic acid，JA)途徑差異表達(dá)基因上調(diào)，ABA 信號通路蛋白磷酸酶2Cs (PP2Cs)分支A 的成員HAI1基因均上調(diào)表達(dá)；轉(zhuǎn)錄因子中ERF、bZIP和MYB家族全部差異表達(dá)基因均上調(diào)表達(dá)；氧化還原系統(tǒng)的氧化還原狀態(tài)通路中硫氧還蛋白FTR-C、抗壞血酸(ascorbate)和谷胱甘肽(glutathione)CYB-1、谷胱甘肽還原蛋白、歧化酶和過氧化氫酶CAT1、CCS顯著上調(diào)，POD基因在14 d 時(shí)有兩個上調(diào)；次級代謝物通路中黃酮類合成通路、異戊間二烯化合物合成通路、類苯基丙烷合成通路和蠟質(zhì)合成通路基因上調(diào)(圖5)。干旱脅迫28 d 時(shí)，Ca2+信號通路少數(shù)上調(diào)；ABA 信號通路HAI1基因下調(diào)；氧化還原狀態(tài)相關(guān)基因只有谷胱甘肽還原蛋白基因上調(diào)；轉(zhuǎn)錄因子多數(shù)下調(diào)；次級代謝通路中異戊間二烯化合物合成通路和黃酮類合成通路基因上調(diào)(圖5)。

3 討論與結(jié)論

藜科C4植物多分布于荒漠地區(qū)，其葉片結(jié)構(gòu)可分為Atriplicolid、Kochioid、Kranz-Suaedoid 和Salsoloid 4 種類型，分別存在于濱藜族、樟味藜族、堿蓬族和豬毛菜族[21]。本研究對象霧冰藜屬于藜科的樟味藜族霧冰藜屬，葉片不具有皮下組織，葉肉細(xì)胞和維管束鞘細(xì)胞組成弧形結(jié)構(gòu)，而非閉合的環(huán)形結(jié)構(gòu)，符合樟味藜族Kochioid-Ⅲ型C4植物結(jié)構(gòu)特點(diǎn)[21]。Kochioid-Ⅲ型鉤刺霧冰藜(B.hyssopifolia)的維管束沒有明顯的主維管束[14]，而本研究中霧冰藜葉片存在一個較大主維管束，原因可能是物種之間的結(jié)構(gòu)差異和多樣性[14]。本研究中霧冰藜在干旱脅迫7 和14 d 葉片顯著變厚，7 d 表皮顯著增厚，推測在輕度干旱脅迫時(shí)霧冰藜通過葉片和表皮的增厚抵御干旱脅迫[2]。本研中霧冰藜干旱脅迫14 d 時(shí)主維管束面積顯著減小，21 和28 d 恢復(fù)變大，輕度干旱會導(dǎo)致霧冰藜主維管束面積減小這一結(jié)果與草地早熟禾在干旱脅迫下維管束面積減小的結(jié)果相似[22]，推測重度干旱時(shí)霧冰藜通過恢復(fù)增大主維管束面積保障水分和養(yǎng)分的運(yùn)輸能力，抵御重度干旱脅迫[7]。霧冰藜葉片貯水組織厚度在干旱脅迫21 和28 d 連續(xù)顯著減小，推測隨著干旱脅迫持續(xù)時(shí)間的延長，霧冰藜通過消耗貯水組織中貯存的水分來維持細(xì)胞水分平衡[23]。

Ca2+被認(rèn)為是幫助植物應(yīng)對環(huán)境脅迫的關(guān)鍵第二信使。Ca2+依賴蛋白激酶(CDPKs)是植物中最具特征的Ca2+傳感器[24]，也是植物應(yīng)對非生物脅迫的重要調(diào)節(jié)因子[25]。擬南芥(Arabidopsis thaliana)AtCPK6過表達(dá)系的耐旱性更強(qiáng)[26]。AtCPK10參與擬南芥的耐旱性，并在ABA 和Ca2+觸發(fā)的氣孔運(yùn)動中發(fā)揮重要作用[27]。霧冰藜Ca2+信號通路CDPK9和CDPK7基因在干旱脅迫7～21 d 時(shí)顯著上調(diào)。這兩個基因均屬于CDPKs成員，推測霧冰藜在輕度到重度干旱脅迫下可通過上調(diào)Ca2+傳感器蛋白激酶基因CDPK9和CPK7增強(qiáng)對干旱脅迫的耐受性。

ABA 信號通路是植物干旱脅迫反應(yīng)的核心。蛋白磷酸酶2Cs (PP2Cs)是ABA 信號途徑中的負(fù)調(diào)控因子，通過阻斷催化裂口和去磷酸化激活環(huán)使SnRk2 激酶不活躍[1]。HAI1和HAI2是擬南芥蛋白磷酸酶2Cs (PP2Cs)分支A 的成員，HAI1是干旱脅迫過程中脯氨酸和滲透調(diào)節(jié)溶質(zhì)積累的負(fù)調(diào)節(jié)因子[28]。本研究霧冰藜HAI1基因在干旱脅迫7～21 d時(shí)均上調(diào)表達(dá)，而28 d 時(shí)下調(diào)表達(dá)，推測在重度干旱脅迫下霧冰藜通過下調(diào)PP2Cs 成員HAI2基因促進(jìn)SnRk2 激酶的激活，從而磷酸化下游轉(zhuǎn)錄因子[1]。

植物中已報(bào)道多個轉(zhuǎn)錄因子家族可以通過結(jié)合目標(biāo)基因的順式作用元件幫助植物抵御干旱脅迫。番茄(Solanum lycopersicum) bZIP 家族成員SlAREB調(diào)控脅迫應(yīng)答基因，其過量表達(dá)可提高植物對水分脅迫的耐受性[29]。水稻(Oryza sativa)OsbZIP62過表達(dá)可提高水稻耐旱性，并與ABA 信號途徑蛋白激酶互作[30]。水稻中AP2/ERF (APETALA2/ethyleneresponsive element binding factors)家族的OsERF101過表達(dá)植株對干旱脅迫的抗性和耐受性更強(qiáng)[31]。對6 個OsMYB成員響應(yīng)干旱和鹽脅迫的表達(dá)分析結(jié)果表明其參與了個體和聯(lián)合的非生物脅迫響應(yīng)[32]。白刺(Oryza sativa)轉(zhuǎn)錄組測序結(jié)果表明MYB、AP2/ERF、WRKY等轉(zhuǎn)錄因子參與干旱脅迫響應(yīng)[10]。本研究霧冰藜在干旱脅迫7～21 d 時(shí)ERF、bZIP和MYB轉(zhuǎn)錄因子的全部成員均顯著上調(diào)表達(dá)，28 d時(shí)有一個ERF，一個bZIP，兩個MYB上調(diào)表達(dá)，推測霧冰藜通過上調(diào)這些轉(zhuǎn)錄因子抵御干旱脅迫。

活性氧(ROS)的產(chǎn)生是各種代謝反應(yīng)的副產(chǎn)物。非生物脅迫下ROS 的產(chǎn)生使植物表現(xiàn)出毒性癥狀，過量的ROS 對植物細(xì)胞碳水化合物、脂核酸和蛋白質(zhì)造成光氧化損傷[2]。本研究霧冰藜H2O2含量分別在干旱脅迫14 和21 d 顯著增加，說明干旱脅迫導(dǎo)致霧冰藜體內(nèi)活性氧含量的過量產(chǎn)生。SOD 可以將O2—轉(zhuǎn)化為H2O2，隨后由POD 和CAT等清除過量的H2O2產(chǎn)生水和二氧化碳[2,4]。干旱脅迫下甘草(Glycyrrhiza uralensis)葉片DEGs 涉及抗氧化酶活性生物過程且SOD 活性顯著增加[33]。本研究霧冰藜在干旱脅迫7～21 d 時(shí)CCS顯著上調(diào)，而POD基因在14 d 時(shí)有兩個上調(diào)；與之相符合的是霧冰藜SOD 活性在干旱脅迫21 和28 d 顯著增大，POD 活性在干旱脅迫14 d 顯著增大。推測在輕度和中度干旱脅迫下霧冰藜通過上調(diào)CCS和POD基因來提高SOD 和POD 的酶活性。霧冰藜在干旱脅迫28 d 時(shí)，谷胱甘肽家族蛋白基因上調(diào)，H2O2含量在干旱脅迫28 d 顯著減少，還原型谷胱甘肽和H2O2在酶的催化下生成氧化型谷胱甘肽和水，這一過程幫助清除過量的H2O2[5]，推測在重度干旱脅迫下霧冰藜通過上調(diào)谷胱甘肽家族蛋白基因增加非酶自由基清除劑谷胱甘肽含量，幫助清除H2O2。CAT 活性在干旱脅迫時(shí)顯著下調(diào)，推測CAT 不是霧冰藜清除ROS 的主要酶類。另外，霧冰藜黃酮類合成通路基因在干旱脅迫7 d 到28 d 均有顯著上調(diào)、脯氨酸含量在干旱脅迫21 d 時(shí)顯著增加。黃酮類和脯氨酸是非酶自由基清除劑，可幫助抵御干旱脅迫帶來的氧自由基破壞[5]。

呼吸作用氧化磷酸化進(jìn)行的場所是線粒體，是指在細(xì)胞內(nèi)的有機(jī)物(糖、脂質(zhì)和氨基酸等)經(jīng)過氧化作用分解成CO2和H2O，并和磷酸化作用偶聯(lián)使ADP 和Pi 合成ATP 的過程，產(chǎn)生的ATP 是植物細(xì)胞生命活動的能量來源。氧化磷酸化電子傳遞鏈包括NADH 脫氫酶(復(fù)合體Ⅰ)、琥珀酸脫氫酶(復(fù)合體Ⅱ)、細(xì)胞色素bc1 復(fù)合體(復(fù)合體Ⅲ)和細(xì)胞色素c 氧化酶(復(fù)合體Ⅳ)，磷酸化過程發(fā)生在ATP 合酶(復(fù)合體Ⅴ)中[34]。干旱等脅迫會阻礙氧化途徑的電子傳遞過程，從而影響后續(xù)ATP 的合成[35]。植物在干旱脅迫下呼吸速率增加，光合作用固定的碳消耗增多，但是ATP 合成降低，且ROS 的產(chǎn)生過量[36]。本研究中霧冰藜干旱脅迫處理不同時(shí)長的差異表達(dá)基因KEGG 代謝途徑均富集于氧化磷酸化途徑，這與花生(Arachis hypogaea)干旱抗性和感性材料間差異表達(dá)基因KEGG 富集分析結(jié)果一致[37]。擬南芥(Oryza sativa)呼吸作用氧化磷酸化過程參與響應(yīng)生物脅迫，其電子傳遞鏈上的ppr40-1(復(fù)合體Ⅲ基因)突變體表現(xiàn)為應(yīng)激敏感性增強(qiáng)、ROS 積累增多、膜脂過氧化增強(qiáng)和SOD 酶活性提高[38]。本研究霧冰藜氧化磷酸化途徑基因在干旱脅迫7～21 d 均顯著上調(diào)表達(dá)，電子傳遞鏈的4 個復(fù)合體和ATP 合酶復(fù)合體Ⅴ均響應(yīng)干旱脅迫，呼吸作用增強(qiáng)，ATP合成增加；干旱脅迫28 d 時(shí)仍有部分基因上調(diào)。霧冰藜POD 活性在干旱脅迫14 d 時(shí)顯著增強(qiáng)，SOD活性在干旱脅迫21 d 時(shí)顯著增強(qiáng)，推測霧冰藜通過上調(diào)氧化磷酸化通路基因增強(qiáng)能量代謝，同時(shí)提高POD 和SOD 活性，抵御干旱脅迫。

綜上，輕度和中度干旱脅迫下霧冰藜葉片和表皮變厚，受體激酶、G 蛋白、MAP 激酶、光及Ca2+信號通路接收和傳導(dǎo)脅迫信號，呼吸作用氧化磷酸化途徑DEGs 全部上調(diào)，抗氧化酶系統(tǒng)CCS和POD等基因上調(diào)同時(shí)SOD 和POD 的酶活性增強(qiáng)，脯氨酸含量增多。重度干旱脅迫下葉片貯水組織厚度急劇減小，氧化磷酸化途徑部分基因上調(diào)，非酶自由基清除劑谷胱甘肽家族蛋白基因上調(diào)幫助清除過量H2O2，ABA 信號途徑的抗旱負(fù)調(diào)控因子PP2Cs成員基因下調(diào)。ERF、bZIP和MYB轉(zhuǎn)錄因子，及非酶自由基清除劑黃酮類物質(zhì)合成通路基因在不同程度干旱脅迫下均上調(diào)表達(dá)。研究結(jié)果為后期霧冰藜抗旱關(guān)鍵基因的挖掘和功能驗(yàn)證提供數(shù)據(jù)參考。