黃帥　孫浩翔　王廷超　舒坤良　王青藍(lán)　蓋嘉慧

摘要：為快速、精準(zhǔn)的診斷辣椒葉綠素含量，采用測量方法簡單、干擾因素較少的透過光譜進行定量分析。研究對葉綠素含量極其敏感的紅邊波段變化規(guī)律，利用一階導(dǎo)數(shù)法計算代表紅邊波段特征的紅邊位置、紅邊幅值和紅邊面積三種紅邊參數(shù)，分析參數(shù)變量間的相關(guān)性和共線性，并基于特征參數(shù)分別建立最小二乘回歸模型和嶺回歸模型。結(jié)果表明，最小二乘回歸模型的驗證結(jié)果相對誤差為7.94%，嶺回歸模型的驗證結(jié)果相對誤差為7.75%，嶺回歸模型不僅解決參數(shù)間的共線性問題，并且提高模型驗證結(jié)果的精確度，該模型可以作為辣椒生長狀態(tài)快速診斷的技術(shù)基礎(chǔ)。

關(guān)鍵詞：辣椒葉片；葉綠素含量；透過強度光譜；紅邊參數(shù)；嶺回歸

中圖分類號：S641.3文獻標(biāo)識碼：A文章編號：20955553 （2023） 11010906

Research on the diagnostic model of chlorophyll content in pepper leaves based on the

red-edge characteristics of transmission intensity spectra

Huang Shuai， Sun Haoxiang， Wang Tingchao， Shu Kunliang， Wang Qinglan， Gai Jianghui

（Jilin Academy of Agricultural Sciences， Changchun， 130033， China）

Abstract：In order to quickly and accurately diagnose the chlorophyll content of peppers， quantitative analysis was carried out through the transmission spectrum with simple measurement method and less interference factors.The variation law of the red-edge band， which was extremely sensitive to chlorophyll content， was studied. Three red-edge parameters （λred）， red-edge amplitude （dλred） and red-edge area （Sred） representing the characteristics of the red-edge band were calculated by the first derivative method. The correlation and collinearity among the parametric variables were analyzed. And the least squares regression model and the ridge regression model were established respectively based on the characteristic parameters. The results showed that the relative error of the verification results of the least squares regression model was 7.94%， and the relative error of the verification results of the ridge regression model was 7.75%. The ridge regression model not only solved the problem of collinearity between parameters， but also improved the accuracy of the model verification results. Therefore， the above model can be used as a technical basis for rapid diagnosis of pepper growth status.

Keywords：pepper leaf; chlorophyll content; transmission intensity spectrum; red-edge parameters; ridge regression

0引言

葉綠素是綠色植物光合作用中最重要的有機分子，是大部分植物生命特征指標(biāo)之一［12］，其含量不僅能夠直接反映植物營養(yǎng)及生理狀態(tài)，還為農(nóng)業(yè)生產(chǎn)管理提供可靠依據(jù)［34］。如何快速準(zhǔn)確地獲取葉片葉綠素含量，成為監(jiān)測作物長勢、指導(dǎo)農(nóng)事生產(chǎn)的重要研究方向。

傳統(tǒng)的化學(xué)分析法雖然可以準(zhǔn)確檢測葉片葉綠素含量，但檢測過程不僅具有一定的破壞性，而且費時費力、操作繁瑣、成本過高。大量研究表明，基于光譜信息的定量監(jiān)測技術(shù)是診斷葉片葉綠素含量的有效方法［58］。

在基于光譜技術(shù)診斷植物葉片葉綠素含量方面的研究中，毛智慧等［911］利用低空無人機遙感技術(shù)，搭載光學(xué)傳感器獲取作物冠層葉片反射光譜，對玉米、花生、馬鈴薯等作物進行葉綠素定量分析，建立多種作物生長情況監(jiān)測模型；Cai等［1213］在高濃度二氧化碳條件環(huán)境下利用高光譜影像數(shù)據(jù)建立多種小麥葉片葉綠素含量估算模型。上述研究均取得了很好的成果，但是在利用無人機遙感技術(shù)獲取作物反射光譜數(shù)據(jù)時，不僅存在較遠(yuǎn)的測量光程，還受制于環(huán)境因素，對拍攝時的光照條件要求較為苛刻。Wang等［1415］利用560nm、650nm和940nm處的透過率光譜進行計算作為特征參數(shù)，對水稻、黃瓜和番茄等作物葉片進行葉綠素含量檢測；丁永軍等［16］分別利用去包絡(luò)線、吸光度、原始光譜和一階微分?jǐn)?shù)據(jù)提取多個番茄葉片葉綠素含量敏感光譜波段，并建立多種預(yù)測能力較好的估測模型。上述幾位研究人員使用的光譜范圍較大，橫跨可見光和近紅外光譜范圍，光譜檢測設(shè)備開發(fā)難度較大、成本較高。本研究改良透過光譜測量方法，搭建構(gòu)造簡單、檢測精準(zhǔn)的透過光譜數(shù)據(jù)采集系統(tǒng)，構(gòu)建利用較窄波段的高精度估測模型，為葉片葉綠素含量檢測儀器的精簡化開發(fā)提供技術(shù)支持。

通過對植物葉片光譜特性的研究發(fā)現(xiàn)，由于葉片對紅光波段的吸收和對近紅外光波段的不吸收，在680～760nm的區(qū)域出現(xiàn)了光譜曲線陡然上升的情況［17］。許多研究結(jié)果表明，紅邊區(qū)域特征參數(shù)與葉綠素含量有強烈的相關(guān)性［1819］，Li等［2022］在處理高光譜遙感數(shù)據(jù)時，利用反射率光譜紅邊區(qū)域的特征參數(shù)，建立馬鈴薯、冬季油菜和玉米冠層葉片的葉綠素和氮素含量估算模型。然而，大部分紅邊區(qū)域的研究都用在反射率光譜數(shù)據(jù)的定量分析中。

本文以溫室辣椒為研究對象，采用透過光譜對辣椒葉片葉綠素含量進行定量分析，降低外界環(huán)境對原始數(shù)據(jù)潛在的影響，提升數(shù)據(jù)檢測的穩(wěn)定性和準(zhǔn)確性，探究葉片透過光譜紅邊區(qū)域與葉綠素含量間的變化規(guī)律，基于紅邊特征參數(shù)建立的兩種不同算法的多元線性回歸模型，并對模型的估測精度進行對比分析。

1材料與方法

1.1植物樣本的培育

試驗在吉林省蔬菜花卉科學(xué)研究院可控溫室（東經(jīng)125°23′37.1″，北緯43°49′51.9″）進行，辣椒栽培設(shè)計了5個不同氮元素營養(yǎng)水平試驗區(qū)（N1～N5，營養(yǎng)濃度見表1），其中N3為標(biāo)準(zhǔn)營養(yǎng)水平?；|(zhì)中椰糠和珍珠巖配比為3∶1，5個實驗區(qū)的栽培槽規(guī)格相同（長600cm、寬40cm、高30cm），每個試驗區(qū)種植16株，共80株辣椒苗。溫室內(nèi)的溫度和光照用物聯(lián)網(wǎng)設(shè)備進行實時監(jiān)控并通過放風(fēng)和遮陽幕進行自動的適度環(huán)境調(diào)控，溫室內(nèi)的溫度控制在白天（26±2）℃和晚上（16±2）℃，相對濕度50%～70%，光強度不超過1000光量子通量密度，利用定時器和潛水泵自動定時每日早晚各灌溉5min營養(yǎng)液，每天為每株辣椒提供800mL的營養(yǎng)液，并將pH值調(diào)整在6.5～7.5之間。經(jīng)不同施氮處理30天后，選擇已發(fā)育較好的葉片進行光譜數(shù)據(jù)采集和葉綠素含量測定，每個試驗區(qū)采集葉片樣本30個，共采集150個樣本。

1.2光譜數(shù)據(jù)采集

使用AvaSpec-ULS2048XL-EVO光譜儀（Avantes，荷蘭）進行光譜數(shù)據(jù)采集，測量波段范圍為350～1100nm，測量步長為0.6nm。整個數(shù)據(jù)采集過程在封閉的暗室內(nèi)進行，將余弦校正器固定在水平操作臺上，將測量光源垂直于操作臺，葉片樣本避開葉脈平鋪在余弦校正器上并用葉片夾固定。測量時保持光源與操作臺距離不變，并封閉暗室操作窗口，保證測量不受外界光源影響，將人為出現(xiàn)的誤差的幾率降到最低。測量樣本之前，在扣除機器噪音后測量光源的原始光譜，將光照強度保持為1200μmol/（m2·s）并保存為參考光譜后，進行葉片樣本透過光譜數(shù)據(jù)采集，每個葉片樣本進行4次數(shù)據(jù)采集并保存，測量5個樣本后校正一次光源距離和光照強度。

1.3葉綠素含量測定

本文使用紫外分光光度計METTLER TOLEDO UV5（Mettler-Toledo，瑞士）進行葉綠素含量的測定，按丙酮和水體積比4∶1配置萃取液，稱取剔除葉脈的辣椒葉片0.2g放到10mL的丙酮溶液中，在4℃冰箱中暗黑條件下浸泡24h，取上清液測定663nm和645nm波段的光密度OD（Optical Density），測定后按Arnon法修正公式計算出溶液的葉綠素含量［23］

1.4光譜預(yù)處理和特征參數(shù)計算方法

將每個樣本測量的4次光譜數(shù)據(jù)進行平均，得到該樣本的最終透過強度光譜曲線數(shù)據(jù)。利用Savitzky-Golay方法對透過強度光譜曲線進行平滑處理，窗口點數(shù)為20，在保證光譜特征的前提下，消除光譜中存在誤差的個別數(shù)據(jù)。對光譜數(shù)據(jù)進行預(yù)處理后，需要提取光譜數(shù)據(jù)中反映樣本葉綠素含量的有效信息來進行診斷模型的建立。在對紅邊區(qū)域的分析中，最大一階導(dǎo)數(shù)法計算的紅邊位置連續(xù)性較高［24］，并且可以得到與葉綠素含量相關(guān)的紅邊幅值（紅邊位置所對應(yīng)的值）和紅邊面積（紅邊區(qū)域一階導(dǎo)數(shù)曲線所圍成的面積）兩種參數(shù)，所以本研究選用一階導(dǎo)數(shù)法計算透過強度光譜的紅邊參數(shù)。

1.5模型建立及評價方法

本文擬用最小二乘回歸和嶺回歸兩種建模方法建立包含多種自變量的多元線性回歸模型。嶺回歸［25］方法是一種對自變量具有多重共線性數(shù)據(jù)分析的有偏估計回歸方法。Hoerl等［26］在研究中推導(dǎo)出了嶺回歸分析的具體證明。Mcdonald等［27］對嶺回歸方法進行了簡要概述，證明了嶺回歸分析的性質(zhì)是對不適定問題進行回歸時最經(jīng)常使用的正規(guī)化方法。嶺回歸實質(zhì)上是一種經(jīng)過改良的普通最小二乘估計，通過放棄最小二乘估計的無偏性，以損失部分信息、降低模型精度為代價，從而使回歸方法獲得更符合實際、更可靠的回歸系數(shù)。

本研究利用上述兩種方法建立模型后得到的絕對系數(shù)，并通過計算模型估測結(jié)果與實際測量結(jié)果的相對誤差來驗證模型的準(zhǔn)確性。

2結(jié)果與分析

2.1葉綠素測量結(jié)果

2.2光譜特征

2.3紅邊參數(shù)計算

利用5個試驗區(qū)30個葉片樣本透過強度光譜數(shù)據(jù)的平均光譜曲線，使用最大一階導(dǎo)數(shù)法對平均光譜曲線的紅邊區(qū)域（680～760nm）范圍進行特征提取，得到平均光譜紅邊區(qū)域的一階導(dǎo)數(shù)曲線如圖3所示。各試驗區(qū)紅邊區(qū)域的一階導(dǎo)數(shù)曲線有著明顯差異，隨著葉綠素含量的增加，波峰右側(cè)曲線的斜率減小，逐漸呈現(xiàn)出雙峰現(xiàn)象。隨著葉綠素含量的增加，透過強度紅邊區(qū)域一階導(dǎo)數(shù)曲線差異越小，N2～N5試驗區(qū)的波峰峰值逐漸降低，波峰位置向紅外區(qū)域移動。N1～N5試驗區(qū)平均透過強度光譜曲線的紅邊位置分別為：686.91nm、689.21nm、694.41nm、697.87nm、698.44nm；紅邊幅值分別為：0.0605、0.0698、0.0567、0.0484、0.0434；紅邊面積分別為：14.4214、17.8995、29.4888、43.2703、46.7996。

截取150個樣本的透過強度紅邊區(qū)域（680～760nm）范圍內(nèi)的光譜曲線。對一階導(dǎo)數(shù)曲線進行分析，得到能代表紅邊區(qū)域特征的紅邊參數(shù)，包括紅邊位置λred（一階導(dǎo)數(shù)曲線峰值的對應(yīng)波段）、紅邊幅值dλred（一階導(dǎo)數(shù)曲線峰值）、紅邊面積Sred（一階導(dǎo)數(shù)曲線所圍成的面積）。表2為全部樣本紅邊參數(shù)統(tǒng)計結(jié)果。

三種特征參數(shù)都表現(xiàn)出了與葉片葉綠素含量較高的相關(guān)性，其中λred與葉綠素含量相關(guān)性最高，達到0.8991，dλred與葉綠素含量呈負(fù)相關(guān)，Sred與葉綠素含量的相關(guān)性為0.7707；Sred和dλred的極差相對較大且變異系數(shù)大于15%，說明兩種紅邊參數(shù)受葉綠素含量的影響波動較大。

2.4參數(shù)共線性分析

多特征參數(shù)建立的多元線性回歸模型相較于單一變量模型的估測結(jié)果更加穩(wěn)定。但建立多元線性回歸模型時，需分析每個參數(shù)之間存在的多重共線性，如果自變量之間共線性較強，則會導(dǎo)致模型系數(shù)不穩(wěn)定。所以在建立模型之前，先對三種參數(shù)進行共線性診斷（表3），λred和Sred兩種自變量的方差膨脹因子（Variance Inflation Factor，VIF）均大于10，且特征根為0.0590和0.0129均趨近于0，Sred的條件指數(shù)大于10且小于30，說明λred和Sred兩種自變量存在多重共線性。對3種紅邊參數(shù)進行相關(guān)性分析（圖3），dλred與λred和Sred的相關(guān)系數(shù)分別為-0.6924和-0.3801，相關(guān)性較低，但λred與Sred之間的相關(guān)性高達0.8974。上述結(jié)果說明3種參數(shù)間存在多重共線性，所以在建立葉綠素含量診斷模型時需要解決自變量間存在共線性的問題。

2.5建模結(jié)果分析

為解決上述問題，本文將150個樣本隨機分為100個訓(xùn)練集樣本和50個驗證集樣本，利用最小二乘回歸和嶺回歸方法，基于100個訓(xùn)練集葉片樣本計算出的3種紅邊參數(shù)建立多元線性回歸模型。在利用嶺回歸方法建立模型時，為了有效降低參數(shù)之間的多重共線性和過擬合情況，通過對3種紅邊參數(shù)的嶺跡進行分析，發(fā)現(xiàn)當(dāng)k值為0.04時，各自變量的回歸系數(shù)趨近于穩(wěn)定，且R2值也處于較高的位置。將k帶入回歸模型中，得到一個有偏的多元線性回歸模型。將50個驗證集樣本帶入模型中，得到不同建模方法的驗證集樣本預(yù)測值（圖5），并計算預(yù)測值與實測值的相對誤差，利用計算結(jié)果對模型精度進行評價。

從表4可以看出，兩種回歸模型的R2、均方根誤差（Root Mean Square Error，RMSE）和自由度（Degree of Freedom，DF）均相同，嶺回歸模型的殘差平方和（Sum of the Squared Errors，SSE）要高于最小二乘回歸模型，但嶺回歸模型的驗證結(jié)果與實測值的相對誤差RE為7.75%，估測精度優(yōu)于最小二乘回歸模型。由此可見，在建立基于透過強度光譜紅邊區(qū)域特征參數(shù)的辣椒葉片葉綠素診斷時，嶺回歸方法相較于最小二乘回歸方法，估測結(jié)果精度更高。

3結(jié)論

1） 本文利用透過強度光譜進行辣椒葉片葉綠素含量的估測，在固定光源及光路的情況下，盡量減少光譜采集時對原始光譜的計算，降低原始數(shù)據(jù)產(chǎn)生誤差的可能性。僅采用680～760nm范圍80nm寬的光譜波段即可實現(xiàn)葉綠素準(zhǔn)確檢測，該方法不僅減少了檢測設(shè)備對光源和傳感器的要求，降低了檢測設(shè)備成本；并且測量光程差為0，不易受外界環(huán)境干擾，提升了原始數(shù)據(jù)的準(zhǔn)確性，為開發(fā)辣椒葉片葉綠素含量估測儀器提供科學(xué)依據(jù)。

2） 分析了5種施氮條件下辣椒葉片樣本的透過強度光譜紅邊區(qū)域變化規(guī)律，使用一階導(dǎo)數(shù)法計算了150個樣本的紅邊參數(shù)，探討了紅邊參數(shù)與葉片葉綠素含量的相關(guān)性。隨著葉綠素含量的增加，λred向近紅外方向偏移，透過強度也隨之降低，λred與葉綠素含量的相關(guān)系數(shù)達到0.899 1，dλred和Sred與葉綠素含量的相關(guān)系數(shù)絕對值均高于0.7，三種紅邊參數(shù)可以作為作物葉綠素含量診斷的參考特征參數(shù)。

3） 證明了透過強度光譜紅邊參數(shù)可以用于辣椒葉片的葉綠素含量快速無損檢測。建立了兩種基于3種透過強度光譜紅邊參數(shù)的多元線性回歸模型，綜合模型的R2、RMSE、SSE和RE指標(biāo)，兩種模型的決定系數(shù)R2均高達0.917，嶺回歸模型驗證結(jié)果的相對誤差為7.75%，可以有效診斷辣椒葉片葉綠素含量，能夠用于開發(fā)基于光譜透過率的葉綠素含量檢測儀器。

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