李家興，舒明濤，沐賢志，溫輝林，劉升銳，李葉云，韋朝領(lǐng)*，朱俊彥*

（1. 安徽農(nóng)業(yè)大學(xué)茶樹生物學(xué)與資源利用國家重點實驗室/農(nóng)業(yè)農(nóng)村部茶樹生物學(xué)與茶葉加工重點實驗室，安徽 合肥，230036； 2. 巢湖市年晟農(nóng)業(yè)生態(tài)有限公司，安徽 合肥，230036）

0 引言

【研究意義】茶是世界三大無酒精飲料之一，因其獨特的風(fēng)味和天然的保健功能而深受人們喜愛。在我國，茶產(chǎn)業(yè)已成為山區(qū)脫貧攻堅的重要經(jīng)濟作物，茶園良種化是茶產(chǎn)業(yè)高質(zhì)量發(fā)展的基礎(chǔ)，其發(fā)展伴隨著良種茶苗的需求也在不斷增加[1]。目前，茶樹的繁育與推廣多以無性繁殖為主，其中短穗扦插因其能夠保持品種的優(yōu)良特性、育成茶苗純度高、繁殖系數(shù)大、取材方便和發(fā)根成苗快等優(yōu)勢，已成為國內(nèi)茶區(qū)育苗的主要方式[2]。因此，進一步探究并開發(fā)高效、穩(wěn)定的茶樹短穗扦插技術(shù)是促進茶產(chǎn)業(yè)高質(zhì)量發(fā)展的重要力量。【前人研究進展】茶樹扦插發(fā)根慢，在適宜環(huán)境下需要30 d 左右才會發(fā)根，而完成第一輪根系生長需要60 d 左右[1]。王耕斌等[3]發(fā)現(xiàn)，夏季扦插后25 d 茶苗開始生根，而秋季扦插后40 d 才開始生根。同時，秋季茶樹扦插后，插穗能否順利越冬是一個重要限制因素，冬季寒冷的氣候會對茶苗造成傷害，將直接影響插穗的生根和成活率[4]；同時，由于扦插時間選在秋季，較長的育苗周期等因素也會直接影響茶苗的市場競爭力。大量研究表明，外源激素處理具有促進插穗生根的作用，并且經(jīng)外源激素處理后，其成活率也顯著提高[5,6]，同時插穗中的內(nèi)源激素含量在生根發(fā)育過程中也發(fā)生了復(fù)雜的動態(tài)變化[7]。Gardner 等[8]研究發(fā)現(xiàn)，內(nèi)源生長素的水平不足可能是造成根系愈傷組織難形成的重要因素，暗示對插穗外源增施生長素是扦插過程中必要步驟。陳通贏等[9]發(fā)現(xiàn)，在剪穗前15 d 對養(yǎng)穗母樹噴施2,4-D 溶液能明顯促進插穗生根，且能夠提升插穗的著葉數(shù)和成活率?！颈狙芯壳腥朦c】目前，相關(guān)研究多以秋季扦插為研究重點，探究不同生長調(diào)節(jié)劑組合對插穗生根與成活率的影響，然而針對夏季的配套茶樹扦插育苗技術(shù)尚不成熟。【擬解決的關(guān)鍵問題】本研究開發(fā)一種適用于夏季短穗扦插的快速成苗技術(shù)，不僅能夠消除插穗越冬對其生根和成活率的影響，同時可縮短育苗周期，大大降低了育苗造成的用地與管理成本，將為茶產(chǎn)業(yè)高質(zhì)量發(fā)展提供理論基礎(chǔ)與技術(shù)支撐。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

試驗試劑為甲基硫菌靈（江蘇藍豐生物化工股份有限公司）；乙草胺（山東勝邦綠野化學(xué)有限公司）；5%高效氯氟氰菊酯（德國Dr. Ehrenstorfer GmbH 公司）；0.16%多菌靈消毒液（四川潤爾科技有限公司）；0.3%吲丁·萘乙酸（四川省蘭月科技有限公司）；ABT1 生根粉（北京艾比蒂生物科技有限公司）；碧護（0.136%赤·吲乙·蕓苔可濕性粉劑，德國阿格福萊農(nóng)林環(huán)境生物技術(shù)股份有限公司生產(chǎn)）；15%噁霉靈（青島鑫潤生物科技有限公司）；腐殖酸葉面肥（南京富典生物科技有限公司）；34%螺螨酯（德國Dr. Ehrenstorfer GmbH 公司）；醚菌酯（溫州綠佳進出口貿(mào)易有限公司）；唑醚·丙森鋅（青島奧迪斯生物科技有限公司）；烯啶·吡蚜酮（北京燕化永樂農(nóng)藥有限公司生產(chǎn)）。

試驗材料為無性系茶樹良種‘中茶108’，插條取自巢湖市年晟農(nóng)業(yè)生態(tài)有限公司母穗園，選用當(dāng)年生、腋芽飽滿健壯、無病蟲害的木質(zhì)化或半木質(zhì)化的茶樹枝條。

1.2 試驗方法

1.2.1 大田苗圃建設(shè)與消毒

（1）大田苗圃建設(shè) 于3 月份，施90～100 kg·667 m-2無害化處理的菜籽餅肥。于5 月份將土地翻耕后，制成畦高20～22 cm、畦寬120 cm、畦距25～30 cm，畦長控制在50 m 以內(nèi)的苗床。隨后在苗床上鋪設(shè)黃心土，厚度為4～5 cm 左右，保持畦面平整，并夯實四周。

（2）苗床處理 扦插前10～14 d 內(nèi)，用水澆透苗床，再分別向畦面噴施多菌靈（80～100g·667 m-2）和甲基硫菌靈（50～70 g·667 m-2）、乙草胺（150～160 g·667 m-2）和5% 高效氯氟氰菊酯（40～60 g·667 m-2）后，畦面覆蓋白色塑料薄膜，直至扦插當(dāng)天揭開。

1.2.2 插穗的剪取與扦插

（1）插穗的剪取 選用當(dāng)年春季萌發(fā)、腋芽飽滿、健壯、無病蟲害的茶樹新梢，剪取2.0～2.5 cm 插穗，每個穗條具有完整的芽和葉。當(dāng)天剪穂、當(dāng)天扦插，若穂量較多導(dǎo)致當(dāng)天不能及時扦插的插穗，應(yīng)妥善保管，以免脫水劣變。扦插前，將插穗于0.16%多菌靈消毒液中浸泡2 min，再置于0.3% 吲丁·萘乙酸溶液浸泡2 min，最后分別在清水、0.05%生根粉、0.05% 生根粉與0.1% 碧護（赤·吲乙·蕓苔）混合溶液中浸泡2～3 min，撈起瀝干水后逐一扦插。

（2）扦插 于當(dāng)年夏季（5 月中旬～6 月中旬）進行扦插，將插穗斜插于劃痕線上，扦插密度為行距8～9 cm，株距2.0～2.5 cm，以插穗母葉重疊面積不超過三分之一為宜，插穗下部插入土中，葉柄離地面約0.5 cm，用土將插穗四周壓緊壓實。

1.2.3 大田苗圃管理

（1）光照管理 順畦搭建高度為40～50cm 弓形棚，弓距80～90 cm，再使用遮光率60%～65%的黑色扁絲遮陽網(wǎng)覆蓋。

（2）水分管理 扦插后立即澆水至澆透為止。在扦插后90 d 內(nèi)的晴天無雨日，需要每日澆水3～4 次，并在下午17：00 前進行，土壤濕度控制在65%～75%。

（3）扦插初期管理 扦插后6～8 d 內(nèi)，選擇在下午17：00 前，分別向苗床中噴施甲基硫菌靈（50～70 g·667 m-2）、15% 噁霉靈（200～350 g·667 m-2）、腐殖酸葉面肥（200～350 g·667 m-2）和34%螺螨酯（50～70 g·667 m-2）。扦插后18 d～20 d 內(nèi)，選擇在下午17：00 前，分別向苗床中噴施醚菌酯（200～350 g·667 m-2）、15% 噁霉靈（200～350 g·667 m-2）、腐殖酸葉面肥（200～350 g·667 m-2）、唑醚·丙森鋅（50～80 g·667 m-2）和烯啶·吡蚜酮（15～20 g·667 m-2）。

（4）追肥 插穗開始生根時，開始第一次追施水溶復(fù)合肥（氮∶磷∶鉀比例為15∶15∶15），以后每隔10 d 追肥一次，一般連續(xù)4 次。每次追肥量：第1 次7～9 kg·667 m-2，第2 次10～12 kg·667 m-2，第3 次13 ～15 kg·667 m-2，第4 次18～20 kg·667 m-2。當(dāng)苗高至10～12 cm 時，按照25～27 kg·667 m-2追肥。追肥時間選擇在下午17：00 后進行。

（5）煉苗 當(dāng)種苗苗高至25～30 cm 后，避免強光，揭開遮陽網(wǎng)煉苗。選擇在陰雨天氣揭開遮陽網(wǎng)進行煉苗，若持續(xù)高溫晴朗的天氣，則選擇在傍晚揭開遮陽網(wǎng)，次日上午10 時蓋上遮陽網(wǎng)進行煉苗，持續(xù)一周后可完全揭開。

1.3 扦插苗長勢調(diào)查

于2021 年8 月16 日開始，每隔15 d 隨機取苗，連續(xù)取樣五次，觀察統(tǒng)計其新梢長、著葉數(shù)、生根數(shù)、最長根長、根干重、地上部干重和第二葉葉面積，每個處理組取苗30 株，3 個生物學(xué)重復(fù)，共取苗90 株。于2021 年10 月28 日按照茶樹種苗標(biāo)準(zhǔn)（GB 11767—2003），隨機量取出圃苗的莖粗、苗高和側(cè)根數(shù)（根徑在1.5 mm 以上的根數(shù)），按照達到出圃標(biāo)準(zhǔn)的苗數(shù)量：扦插苗總量進行出圃率計算。新梢長度：用直尺測出新梢長的高度，再求每個田間試驗組茶苗平均新梢長，精確至0.1 cm。葉片數(shù)：對每組內(nèi)扦插苗的新生葉片數(shù)進行測定，統(tǒng)計每組平均著葉數(shù)。生根數(shù)：對每組內(nèi)扦插苗的生根數(shù)進行測定，統(tǒng)計每組平均根數(shù)。最長根長：對每組內(nèi)扦插苗的生根數(shù)進行測定，統(tǒng)計每組平均根數(shù)。成熟葉葉面積：取第二葉葉片拍照，用Image J 軟件分析。地上部干重：每組扦插苗拔出后，洗凈，用紙擦干；于80℃電熱鼓風(fēng)干燥箱中烘干至恒重，用天平稱量地上部重量，精確至0.01 g。地下部干重：每組扦插苗拔出后，洗凈，用紙擦干；于80℃電熱鼓風(fēng)干燥箱中烘干至恒重，用天平稱量地下部重量，精確至0.01 g。莖粗：用游標(biāo)卡尺測定距根頸10 cm 處的苗干直徑，精確至0.01 cm。苗高：根頸至茶苗頂芽基部的長度，精確至0.1 cm。

1.4 內(nèi)源激素含量測定

于2021 年8 月16 日開始，隨機選取3 個處理的插穗各30 條，取第二葉位成熟葉片用于測定激素含量，每個處理包含3 個生物學(xué)重復(fù)，每隔15 d 取樣一次，共取5 次，取樣后立即放入液氮速凍，并于-80℃冰箱備用。

利用同位素內(nèi)標(biāo)法進行IAA、ABA、SA、JA和JA-Ile 激素含量測定。使用液氮充分研磨葉片樣品，稱取0.08 g 研磨后的樣品，置于2 mL 離心管中，向管中加入1 mL 提取液，震蕩混勻15 min?；靹蚝髽悠芬?2 000 rpm 離心10 min 后，吸取上清置于新的2 mL 管子里，并使用旋蒸儀旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)45 min，向干燥后樣品加入170 μL 50%甲醇，震蕩混勻15 min?；靹蚝髽悠芬?3 000 rpm 離心15 min，吸取上清過0.22 μm 有機相膜后，置于液相進樣瓶中。

LC-MS 分析采用LC-MS-8040（日本島津）并配備Shim-pack XR-ODS 柱（2.0×75 mm，2.2 μm），流速設(shè)置為0.27 mL·min-1，柱溫設(shè)置為40℃，流動相為A 相0.05%（v/v）甲酸水溶液與B 相0.05%（v/v）甲酸/甲醇溶液，上樣體積為10 μL。運用AgtQual 軟件對數(shù)據(jù)進行分析。

1.5 數(shù)據(jù)分析

調(diào)查及試驗數(shù)據(jù)利用Excel 2010 處理，利用IBM SPSS Statistics 26 軟件對統(tǒng)計指標(biāo)進行方差分析和Duncan’s 多重比較。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同處理對扦插苗生長指標(biāo)的影響

2.1.1 不同處理對扦插苗地上部分生長勢的影響

對不同生長階段扦插苗的新梢長度結(jié)果分析發(fā)現(xiàn)，新梢長度隨著扦插苗生長呈現(xiàn)逐漸升高的趨勢，在10 月15 日達到最高，碧護和生根粉共同處理組新梢長度最長，為14.4 cm，分別高出對照組（12.6 cm）和生根粉處理組（11.5 cm）14%和25%（圖1A）。對上述材料葉片數(shù)觀察發(fā)現(xiàn)，碧護和生根粉共同處理組平均葉片數(shù)在10 月15日最高，達到9 片（圖1B）。

圖1 3 種處理下扦插苗生長階段地上部分生長勢變化情況Fig. 1 Growth indicators on aboveground seedling parts of pretreated cuttings in 5 growth stages

進一步分析發(fā)現(xiàn)，對照組、生根粉處理組、碧護和生根粉共同處理組的地上部干重分別從8月16 日的0.36、0.33 和0.37 g 增加到10 月15 日的0.67、0.59 和0.74 g，增重速率分別為86.1%、78.8%和100.0%（圖1C）。成熟葉葉面積統(tǒng)計結(jié)果表明，10 月15 日對照組、生根粉處理組、碧護和生根粉共同處理組的成熟葉葉面積分別為9.4、8.7 和9.8 cm2，碧護和生根粉共同處理組高于生根粉處理組13%（圖1D）。

綜上數(shù)據(jù)表明，碧護和生根粉共同處理組的新梢長、葉片數(shù)、地上部干重和成熟葉葉面積等地上部分生長指標(biāo)均高于對照與生根粉處理組，較對照組分別提高了14%、15%、10%和4%，表明碧護和生根粉共同處理插穗后，能夠顯著提高扦插苗地上部分生長勢。

2.1.2 不同處理對扦插苗地下部分生長勢的影響

對不同生長階段扦插苗最長根長結(jié)果分析發(fā)現(xiàn)，最長根長隨著扦插苗生長呈現(xiàn)逐漸升高的趨勢，在8 月16 日至10 月1 日的生長階段，碧護和生根粉共同處理組最長根長與生根粉處理組相當(dāng)，但高于對照組（圖2A）。對扦插苗生根數(shù)量統(tǒng)計發(fā)現(xiàn)，對照組、生根粉處理組、碧護和生根粉共同處理組的生根數(shù)分別為16、14 和17 根（圖2B）。

圖2 3 種處理下扦插苗生長階段地下部分生長勢變化情況Fig. 2 Growth indicators on underground seedling parts of pretreated cuttings in 5 growth stages

進一步分析發(fā)現(xiàn)，對照組、生根粉處理組、碧護和生根粉共同處理組的地下部干重分別從8月16 日的0.14、0.14 和0.16 g 增加到10 月15 日的0.23、0.23 和0.26 g，碧護和生根粉共同處理顯著提高了扦插苗地下部干重（圖2C）。根冠比大小能夠反映植物地下與地上部分相關(guān)性，植株根冠比越大說明植株根系機能活性越大，反之說明植株根系機能活性小[10]。在不同處理組生長過程中，扦插苗根冠比無顯著變化。10 月15 日，對照組、生根粉處理組、碧護和生根粉共同處理組根冠比分別為0.34、0.39 和0.35（圖2D）。

綜上數(shù)據(jù)表明，碧護和生根粉共同處理組的生根數(shù)和地下部干重等地下部分生長勢指標(biāo)均高于對照與生根粉處理組，較對照組分別提高了10%和13%，表明碧護和生根粉共同處理插穗后，能夠顯著提高扦插苗地下部分生長勢。

2.2 不同處理對扦插苗出圃率的影響

通過對扦插144 d（10 月28 日）后（圖3），扦插苗的苗高、莖粗、根數(shù)、存活率和出圃率統(tǒng)計分析發(fā)現(xiàn)，對照組、生根粉處理組、碧護和生根粉共同處理組的平均苗高分別為28.13、27.42、30.76 cm（表1），而莖粗指標(biāo)在不同處理間無顯著差異。存活率變化情況為碧護和生根粉共同處理組優(yōu)于對照和生根粉處理組，碧護和生根粉共同處理組存活率達到了96.7%，相對于對照和生根粉處理組分別提高了10.4%和9.2%。出圃率同樣為碧護和生根粉共同處理組最高，達到了87.8%，相對于對照和生根粉處理組出圃率分別提高了16.7%和20%。上述結(jié)果表明，碧護和生根粉共同處理插穗能夠顯著提高茶苗質(zhì)量和出圃率。

表1 扦插144 d 后插穗生長指標(biāo)Table 1 Growth indicators on seedlings 144 d after planting of cuttings

圖3 2021 年10 月28 日三種處理下扦插苗出圃情況Fig. 3 Conditions of seedlings propagated from pretreated cuttings or CK on October 28, 2021

2.3 不同處理對扦插苗內(nèi)源激素含量的影響

為進一步探究影響扦插苗生長發(fā)育的關(guān)鍵內(nèi)源激素，以上述處理組扦插苗成熟葉片為材料，測定其IAA、ABA、SA、JA 和JA-Ile 5 種內(nèi)源激素含量。對其IAA、ABA、JA-Ile 和SA 含量分析發(fā)現(xiàn)，在整個生長階段中IAA、JA-Ile 和SA 含量動態(tài)變化不顯著，而ABA 含量僅在9 月15 日對照組、碧護和生根粉共同處理組樣品中顯著上升（圖4A-D）。對JA 含量動態(tài)分析發(fā)現(xiàn)，8 月16 日至10 月1 日期間，碧護和生根粉共同處理組JA含量呈現(xiàn)逐漸升高的趨勢，最高達到14.27 ng·g-1，相較于8 月16 日提高了4 倍。進一步對比分析發(fā)現(xiàn)，在9 月1 日至10 月1 日期間，碧護和生根粉共同處理組JA 含量顯著高于對照和生根粉處理組，在10 月1 日，其含量分別為對照和生根粉處理組的2.6 倍和1.3 倍（圖4E）。

圖4 3 種處理下扦插苗內(nèi)源激素含量變化情況Fig. 4 Contents of endogenous phytohormones in seedlings propagated from pretreated cuttings or CK in 5 growth stages

3 討論與結(jié)論

短穗扦插是目前茶樹無性系良種繁育的主要方法，該技術(shù)具有保持母株優(yōu)良特性、發(fā)根成苗快、繁殖系數(shù)大等優(yōu)點，但是如何提高扦插苗質(zhì)量和出圃率、降低育苗成本一直是茶葉科技工作者關(guān)注和研究的重要課題[11]。與傳統(tǒng)扦插育苗法相比，容器扦插育苗、營養(yǎng)袋育苗法不但解決了苗床的“心土”問題，且能夠培育壯苗，移植不傷根系等優(yōu)點[12,13]，但成本較高限制了其推廣。有研究表明，使用激素噴施母樹或全浸插穗，能夠促進插穗生根，大幅度節(jié)約成本，且能提高幼苗成活率[5,6]。沈妮等發(fā)現(xiàn)使用200 mg·L-1NAA 浸泡2 h后在扦插第35 d 才開始生根，60 d 后總生根率只有72.55%，皮層生根率僅為40.69%；而使用200 mg·L-1ABT1 混合生長調(diào)節(jié)劑浸泡2 h 后的插穗發(fā)根最早，在扦插后第25 d 開始生根，60 d 后總生根率達98.04%，皮層生根率為92.25%[14]。因此，相比單一生長調(diào)節(jié)劑，混合生長調(diào)節(jié)劑處理插穗表現(xiàn)出顯著的增效作用，不同生長調(diào)節(jié)劑能夠相互彌補各自不足，更有利于不定根形成和新梢萌發(fā)，進而獲得更佳的促生效果[15,16]。

楊婷等[17]使用‘龍井43’‘金萱’‘烏牛早’‘白毫早’‘中茶108’等茶樹良種進行夏季扦插發(fā)現(xiàn)，種苗出圃率為72%，但其平均苗高僅為20.8 cm，低于茶樹種苗標(biāo)準(zhǔn)（GB 11767—2003）規(guī)定的I 級種苗（苗高≥30 cm）。本研究結(jié)果表明，以0.1%碧護（赤·吲乙·蕓苔）和0.05%生根粉共同處理插穗不僅能顯著提高扦插苗地上和地下部分生長勢，出圃種苗平均苗高為30.8 cm，其高度能夠達到I級種苗要求，同時種苗成活率和出圃率高，可達96.7%和87.8%。

有研究表明，插穗的生根能力與其體內(nèi)內(nèi)源激素含量密切相關(guān)，外源生根劑可以通過調(diào)控內(nèi)源激素的含量，進而實現(xiàn)對穗條不定根誘導(dǎo)和生長發(fā)育的調(diào)控[18]。任恒澤等認(rèn)為用100 mg·L-1ABT-1 號生根劑浸泡茶樹插穗有利于提高插穗莖基部IAA 含量，并使IAA/ZR、IAA/ABA 和（IAA+ZR+GA3）/ABA 值增加，有利于扦插苗根系和地上部的生長[19]。植物內(nèi)源激素的含量往往伴隨生長發(fā)育進程而有顯著的變化，這種現(xiàn)象提示在不同生長發(fā)育階段相應(yīng)由不同的激素起特定作用。茉莉酸（JA）是一種調(diào)控植物細(xì)胞發(fā)育的重要信號物質(zhì)，參與生長發(fā)育過程及環(huán)境脅迫響應(yīng)，如葉片表皮毛發(fā)育、花青素積累和抗凍害反應(yīng)等[20]。本研究對不同生長調(diào)節(jié)劑組合處理后插穗發(fā)育的幼苗體內(nèi)激素分析發(fā)現(xiàn)，僅JA 含量表現(xiàn)出隨著扦插苗發(fā)育生長逐漸上升的趨勢，在碧護和生根粉共同處理組中濃度最高可達14.27 ng·g-1，分別為對照和生根粉處理組的2.64 倍和1.29 倍，推測JA可能是影響夏季扦插苗快速生長的關(guān)鍵激素。