梁萬徽 ，陶舒悅 ，左池靖 ，汪 杰 ，劉 艷 ，余衛(wèi)東 ，彭 燦 ，2，3，4，5#，王 茜 ，5（.安徽中醫(yī)藥大學藥學院，合肥 23002；2.省部共建安徽道地中藥材品質提升協(xié)同創(chuàng)新中心，合肥 23002；3.安徽省鄉(xiāng)村振興協(xié)同技術服務中心，合肥 23002；4.安徽省現(xiàn)代中藥產業(yè)共性技術研究中心，合肥 23002；5.藥物制劑技術與應用安徽省重點實驗室，合肥 23002）

心痛舒噴霧劑（國藥準字Z20194075）由牡丹皮、川芎及冰片3味中藥制備而成，在臨床上用于治療痰濁瘀血痹阻心脈而致的冠心病心絞痛；其經舌下噴霧給藥，被毛細血管吸收后直接進入體循環(huán)，起效快，療效確切，在心血管疾病急救方面具有獨特優(yōu)勢[1―2]。

中藥復方具有多成分、多靶點、綜合作用的特點，其藥效的發(fā)揮是多成分協(xié)同作用的結果[3]?，F(xiàn)行的心痛舒噴霧劑質量控制標準收載于《國家藥品標準新藥轉正標準》第42 冊[4]，主要為單味中藥薄層鑒定及單一成分含量測定，無法反映出整體的質量情況，同時也未見國內外關于心痛舒噴霧劑質量控制的研究。為保障中藥復方的質量及臨床藥效的發(fā)揮，有必要建立一種簡單、高效、準確的指紋圖譜和多成分含量測定方法，以應用于企業(yè)的生產和質檢。

中藥復方指紋圖譜和多成分含量測定研究是保障其質量的基礎，而對中藥復方質量的提升研究也同樣重要。中藥復方質量的提升離不開對其制備工藝的研究和優(yōu)化，而通過探究“指標成分”在中藥復方制備過程中的傳遞規(guī)律，則有利于發(fā)現(xiàn)和優(yōu)化影響其質量的關鍵工藝?；诖耍狙芯拷⑿耐词鎳婌F劑高效液相色譜（HPLC）指紋圖譜，對其指認成分進行含量測定；再以該噴霧劑中牡丹皮、川芎藥材的質控成分丹皮酚和阿魏酸為“指標成分”[5]，探究指標成分在飲片、中間體、噴霧劑中的傳遞規(guī)律，以期為心痛舒噴霧劑的工藝把關和質量控制提供參考。

1 材料

1.1 主要儀器

Waters ACQITY Arc 型HPLC 儀購自美國Waters 公司；YL-060ST 型超聲波清洗器購自深圳市語路清洗設備有限公司；AB135-S型電子分析天平購自賽多利斯科學儀器（北京）有限公司；BT-25S型高速離心機購自常州市萬豐儀器制造有限公司；HX-200 型中藥粉碎機購自永康市溪岸五金藥具廠。

1.2 主要藥品與試劑

沒食子酸、氧化芍藥苷、綠原酸、阿魏酸、洋川芎內酯Ⅰ的對照品（批號分別為J05GB153704、N26GB169459、A22GB158496、G13S11L124423、PZ7A11F122339，純度均≥98.0%）均購于上海源葉生物科技有限公司；咖啡酸、芍藥苷、丹皮酚的對照品（批號分別為PS010522、PS000825、PS000281，純度均≥98.0%）均購于成都普思生物科技有限公司；吐溫-80（藥用級）購于上海麥克林生化科技有限公司；乙腈、甲醇為色譜純，甲酸為分析純，水為娃哈哈純凈水。牡丹皮、川芎、冰片飲片和13批心痛舒噴霧劑（批號分別為20221001、20221002、20221003、20221004、20221005、20221006、20221007、20221008、20221009、20221010、20220101、20220201、20220202，編號S1～S13）均由華佗國藥股份有限公司提供。另外，本實驗室自制了心痛舒噴霧劑6 批，編號S14～S19。

2 方法與結果

2.1 色譜條件

色譜柱為East Laboratory Epic C18（4.6 mm×250 mm，5 μm）；流動相為乙腈（A）-0.1%甲酸溶液（B），梯度洗脫（0～10 min，10%A→15%A；10～24 min，15%A→25%A；24～28 min，25%A→26%A；28～30 min，26%A→30%A；30～48 min，30%A→57%A；48～52 min，57%A→80%A；52～57 min，80%A→10%A；57～62 min，10%A）；流速為0.8 mL/min；柱溫為30 ℃；進樣量為10 μL；檢測波長分別為254、320 nm（指紋圖譜研究時選擇254 nm；含量測定時選擇254 nm作為沒食子酸、氧化芍藥苷、芍藥苷、洋川芎內酯Ⅰ、丹皮酚的檢測波長，320 nm作為綠原酸、咖啡酸、阿魏酸的檢測波長）。

2.2 心痛舒噴霧劑的制備

按心痛舒噴霧劑現(xiàn)行工藝進行制備[4]，具體為：取牡丹皮235 g，用80%乙醇浸漬48 h，再用65%乙醇緩緩滲漉（料液比約為1∶12），收集漉液，減壓回收乙醇，得牡丹皮流浸膏，備用。取川芎392 g，用水蒸氣蒸餾法提取揮發(fā)油，揮發(fā)油用乙醇溶解后，備用；提取揮發(fā)油后的藥液濾出，藥渣再加水煎煮2 h，煎液與上述藥液合并，濾過，得川芎水提液；將該水提液減壓濃縮至適當相對密度，加乙醇使含醇量達60%，靜置48 h，濾過；濾液減壓回收乙醇，并濃縮至適量，得川芎醇沉濃縮液，備用。取19 g冰片與20 mL 吐溫-80，加適量乙醇混勻，備用。將上述備用的藥液合并，用乙醇及蒸餾水調整藥液總量為1 000 mL并使含醇量＜30%，混勻，濾過，即得。

2.3 溶液的制備

2.3.1 混合對照品溶液的制備

精密稱取沒食子酸、氧化芍藥苷、綠原酸、咖啡酸、芍藥苷、阿魏酸、洋川芎內酯Ⅰ、丹皮酚對照品適量至容量瓶中，加入75%甲醇制備成質量濃度分別為69.0、72.8、34.8、11.0、366.0、24.2、31.4、379.0 μg/mL 的混合對照品溶液。

2.3.2 供試品溶液的制備

（1）心痛舒噴霧劑供試品溶液的制備：精密吸取心痛舒噴霧劑藥液1 mL 至20 mL 容量瓶中，加75%甲醇至刻度，搖勻，過0.22 μm有機微孔濾膜，取續(xù)濾液即得。（2）飲片供試品溶液的制備：取牡丹皮、川芎飲片粗粉各0.5 g 至錐形瓶，加75%甲醇50 mL，超聲（頻率40 kHz，功率360 W）提取30 min；補足失重，離心，取上清液，過0.22 μm 有機微孔濾膜，取續(xù)濾液即得。（3）中間體供試品溶液的制備：按“2.2”項下處方中各飲片量與制備工藝，制得牡丹皮滲漉液和流浸膏樣品，川芎水提液和醇沉濃縮液樣品，分別按“2.3.2（1）”項下方法制備即得。（4）陰性對照供試品溶液制備：按“2.2”項下處方中各飲片量與制備工藝，制得缺川芎、缺牡丹皮的陰性對照樣品，分別按“2.3.2（1）”項下方法制備即得。

2.4 心痛舒噴霧劑HPLC圖譜的建立

2.4.1 精密度試驗

取S1 號心痛舒噴霧劑樣品，按“2.3.2（1）”項下方法制備供試品溶液，按“2.1”項下色譜條件進行檢測，連續(xù)進樣6 次，獲取色譜圖。以31 號峰（丹皮酚，下同）為參照峰，計算得各共有峰的相對保留時間RSD＜0.13%，相對峰面積RSD＜2.99%（n＝6），符合中藥指紋圖譜的要求。

2.4.2 重復性試驗

取S1 號心痛舒噴霧劑樣品，按“2.3.2（1）”項下方法平行制備6份供試品溶液，按“2.1”項下色譜條件進行檢測，獲取色譜圖。以31號峰為參照峰，計算得各共有峰的相對保留時間RSD＜0.18%，相對峰面積RSD＜4.46%（n＝6），符合中藥指紋圖譜的要求。

2.4.3 穩(wěn)定性試驗

取S1 號心痛舒噴霧劑樣品，按“2.3.2（1）”項下方法制備供試品溶液，分別在室溫放置0、2、4、8、12、24 h 時按“2.1”項下色譜條件進行檢測，獲取色譜圖。以31 號峰為參照峰，計算得各共有峰的相對保留時間RSD＜0.21%，相對峰面積RSD＜3.51%（n＝6），符合中藥指紋圖譜的要求。

2.4.4 指紋圖譜的建立和相似度評價

取13 批（編號S1～S13）心痛舒噴霧劑樣品，按“2.3.2（1）”項下方法制備供試品溶液，按“2.1”項下色譜條件進行檢測。將獲取的色譜圖導入《中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統(tǒng)（2012 版）》，將S1 批次設為參照圖譜，對照圖譜生成方法選擇平均數法，時間窗寬度設為0.1，經過多點校正后進行峰匹配獲得對照圖譜R 及13批樣品的疊加圖譜，如圖1所示。結果顯示，共標定共有峰33 個，其中31 號峰（丹皮酚）峰面積最大，分離度較好，故選擇31號峰為參照峰；各批次心痛舒噴霧劑樣品與對照圖譜的相似度均≥0.994，表明各批次樣品之間的差異性較小。

圖1 13批心痛舒噴霧劑的指紋圖譜和對照圖譜R

2.4.5 共有峰的指認和歸屬

取“2.3.1”項下混合對照品溶液、“2.3.2（4）”項下陰性對照供試品溶液，按“2.1”項下色譜條件進行檢測，獲得色譜圖。如圖2所示，將對照圖譜R 與混合對照品圖譜進行比對，指認出5號峰為沒食子酸、9號峰為氧化芍藥苷、10 號峰為綠原酸、14 號峰為咖啡酸、17 號峰為芍藥苷、21 號峰為阿魏酸、27 號峰為洋川芎內酯Ⅰ、31 號峰為丹皮酚。將對照圖譜R與缺川芎、缺牡丹皮的陰性對照圖譜進行對比發(fā)現(xiàn)，2、3、5、9、12、16～20、22、23、25、26、28～31 號峰歸屬于牡丹皮；1～4、6～8、10、11、13～15、21、24、25、27、28、32、33 號峰歸屬于川芎，其中2、3、25、28號峰同時歸屬于牡丹皮和川芎。

圖2 各樣品含量測定專屬性試驗的HPLC圖譜

2.5 8個指認成分的含量測定

2.5.1 專屬性試驗

取空白溶劑、混合對照品溶液、S1 號心痛舒噴霧劑供試品溶液及陰性對照供試品溶液按“2.1”項下色譜條件進行檢測，并記錄色譜圖。如圖3所示，空白溶劑基線平整，除溶劑峰外無干擾峰；在各對照品成分的相應位置上，心痛舒噴霧劑供試品中均有色譜峰與之對應；陰性對照供試品中也無色譜峰干擾，表明該方法專屬性較好，可以用于含量測定。

圖3 專屬性試驗考察結果

2.5.2 線性關系考察

精密吸取“2.3.1”項下混合對照品溶液1.0、1.5、2.0、2.5、4.0、5.0 mL，分別置于5 mL 容量瓶中，加75%甲醇稀釋至刻度，搖勻；過0.22 μm 有機微孔濾膜，取續(xù)濾液按“2.1”項下色譜條件進樣分析，以進樣量為橫坐標（X），峰面積為縱坐標（Y），獲得各成分的回歸方程和線性范圍，同時測定檢測限和定量限，結果見表1。

2.5.3 精密度試驗

取“2.3.1”項下混合對照品溶液，按“2.1”項下色譜條件連續(xù)進樣6次，記錄色譜圖。結果顯示，沒食子酸、氧化芍藥苷、綠原酸、咖啡酸、芍藥苷、阿魏酸、洋川芎內酯Ⅰ、丹皮酚峰面積的RSD 分別為0.02%、0.09%、0.06%、0.05%、0.10%、0.20%、0.11%、0.40%（n＝6），表明儀器精密度較好。

2.5.4 穩(wěn)定性試驗

取S1 號心痛舒噴霧劑樣品，按“2.3.2（1）”項下方法制備供試品溶液，分別在室溫放置0、2、4、8、12、24 h 時按“2.1”項下色譜條件進行檢測，記錄色譜圖。結果顯示，沒食子酸、氧化芍藥苷、綠原酸、咖啡酸、芍藥苷、阿魏酸、洋川芎內酯Ⅰ、丹皮酚峰面積的RSD 分別為0.26%、0.46%、0.16%、0.17%、0.20%、0.28%、0.09%、0.12%（n＝6），表明供試品溶液在室溫放置24 h 內穩(wěn)定性較好。

2.5.5 重復性試驗

取S1 號心痛舒噴霧劑樣品，按“2.3.2（1）”項下方法平行制備供試品溶液6份，按“2.1”項下色譜條件進行檢測，記錄色譜圖，然后代入回歸方程中計算含量。結果顯示，沒食子酸、氧化芍藥苷、綠原酸、咖啡酸、芍藥苷、阿魏酸、洋川芎內酯Ⅰ、丹皮酚含量的RSD 分別為0.53%、0.27%、0.61%、0.68%、0.56%、0.38%、1.89%、0.57%（n＝6），表明方法重復性較好。

2.5.6 加樣回收率試驗

取各對照品適量，用75%甲醇配制成沒食子酸、氧化芍藥苷、綠原酸、咖啡酸、芍藥苷、阿魏酸、洋川芎內酯Ⅰ、丹皮酚質量濃度分別為0.704、0.874、0.351、0.106、2.900、0.197、0.309、3.780 mg/mL 的混合對照品溶液；精密吸取混合對照品溶液和已知濃度的心痛舒噴霧劑供試品溶液（編號S1）各0.5 mL，置于20 mL 容量瓶中，加75%甲醇稀釋至刻度，平行制備6 份；再按“2.1”項下色譜條件進樣分析，計算加樣回收率。結果顯示，上述8種的平均加樣回收率分別為98.57%、100.34%、104.75%、98.81%、102.35%，97.04%、101.14%、98.20%，RSD 分別為0.81%、1.50%、1.58%、1.31%、1.70%、2.69%、0.82%、0.19%（n＝6）。結果見表2。

表2 8個成分的加樣回收試驗結果

2.5.7 樣品含量測定

取心痛舒噴霧劑樣品（編號S1～S13），按“2.3.2（1）”項下方法制備供試品溶液，按“2.1”項下色譜條件進行檢測，記錄各待測成分的峰面積，然后代入回歸方程中計算含量，結果見表3。心痛舒噴霧劑的國家標準為丹皮酚含量＞1.6 mg/mL，企業(yè)內控標準為丹皮酚含量＞2.6 mg/mL、阿魏酸含量＞0.15 mg/mL，由此可見13 批心痛舒噴霧劑均合格，但在成分的含量上存在一定差異。為探明影響心痛舒噴霧劑質量的關鍵工藝，本研究選擇丹皮酚和阿魏酸為指標成分，進一步探究其在飲片、中間體、噴霧劑中的傳遞規(guī)律，全面剖析制備工藝。

表3 8個成分的含量測定結果（n＝3，mg/mL）

2.5.8 指標成分的傳遞規(guī)律分析

取S14～S19 批次實驗室自制的心痛舒噴霧劑樣品和對應的牡丹皮、川芎飲片及牡丹皮滲漉液、流浸膏，川芎水提液、醇沉濃縮液等中間體樣品，按“2.3.2”項下相應方法制備供試品溶液，再按“2.1”項下色譜條件進行檢測，記錄各供試品中指標成分丹皮酚和阿魏酸的峰面積，代入回歸方程中計算丹皮酚和阿魏酸兩種指標成分在各樣品中的總量，結果如表4和表5所示。結果顯示，丹皮酚從飲片→噴霧劑總量的平均轉移率為63.76%，在滲漉提取和減壓蒸餾提取中損失較大，損失比例超30%；阿魏酸從飲片→噴霧劑總量的平均轉移率為38.06%，在水蒸氣蒸餾提取中損失較大，損失比例超50%。

表4 飲片、中間體、噴霧劑中丹皮酚的傳遞結果

表5 飲片、中間體、噴霧劑中阿魏酸的傳遞結果

3 討論

3.1 色譜條件的優(yōu)化

本文考察了甲醇-水、甲醇-0.1%甲酸、乙腈-水、乙腈-0.1%甲酸4 種不同的流動相體系，結果顯示，以乙腈-0.1%甲酸為流動相，所得色譜峰數量最多，且分離和響應效果最好。前期筆者參考相關文獻[6―8]，對心痛舒噴霧劑供試品和對照品進行了全波長掃描，最終含量測定時選擇254 nm作為沒食子酸、氧化芍藥苷、芍藥苷、洋川芎內酯Ⅰ、丹皮酚的檢測波長，選擇320 nm作為綠原酸、咖啡酸、阿魏酸的檢測波長；且發(fā)現(xiàn)在254 nm波長下色譜峰數目多、響應高、分離度較好，故選擇254 nm作為指紋圖譜的檢測波長。筆者還考察了3 種不同的柱溫（25、30、35 ℃）和3 種不同的流速（0.8、1.0、1.2 mL/min）對色譜分離效果的影響，結果發(fā)現(xiàn)，在柱溫30 ℃、流速0.8 mL/min時，色譜圖峰形均較為對稱，分離度較好。

3.2 心痛舒噴霧劑樣品稀釋溶劑的優(yōu)化

本文前期考察了10%甲醇、50%甲醇、75%甲醇、甲醇4種不同的樣品稀釋溶劑。結果發(fā)現(xiàn)，當采用10%甲醇和50%甲醇作為稀釋溶劑時，色譜圖峰面積降低，可能的原因是心痛舒噴霧劑中絕大多數成分為脂溶性成分，當稀釋溶劑中水的含量升高時導致脂溶性成分不溶解，色譜峰面積降低；當采用甲醇作為樣品稀釋溶劑時，沒食子酸和綠原酸的色譜峰均發(fā)生了前延與分叉，推測產生了溶劑化效應。因此，本研究最終選擇75%甲醇作為稀釋溶劑，所得色譜圖峰形較為對稱。

3.3 基于指標成分的傳遞規(guī)律分析

心痛舒噴霧劑制備工藝復雜，其工藝參數上的不均一則可能導致質量上的差異。本文選取牡丹皮和川芎的藥典質控成分丹皮酚和阿魏酸作為指標成分，探究其在飲片、中間體、噴霧劑中的傳遞規(guī)律。結果顯示，牡丹皮的滲漉提取和減壓濃縮及川芎的水蒸氣蒸餾提取是指標成分顯著損失的關鍵工藝。

在牡丹皮的滲漉提取中，乙醇的濃度、用量和滲漉速度等參數均會影響丹皮酚的提取率，此外丹皮酚具有隨水蒸氣蒸餾的物理性質，因此減壓濃縮時的溫度、轉速、真空度等參數也會顯著影響丹皮酚的提取率。在川芎的水提工藝中阿魏酸損失較高，筆者查閱相關文獻發(fā)現(xiàn)，川芎水提時阿魏酸轉移率普遍較低，如高揚等[9]發(fā)現(xiàn)阿魏酸從飲片至標準湯劑的平均轉移率為37.7%，莫雨佳等[10]發(fā)現(xiàn)阿魏酸從飲片至全方水煎液的平均轉移率為45.97%。因此，筆者推測導致阿魏酸轉移率低的主要原因與其水溶性較差有關，建議在水提川芎時，可以通過增加加水量、提取次數，添加乙醇和趁熱過濾等操作來增加阿魏酸轉移率。

綜上所述，本文建立的指紋圖譜和多成分含量測定方法重復性好、專屬性強，可以用于心痛舒噴霧劑的質量評價；其次，本文探明了丹皮酚和阿魏酸兩種指標成分在飲片、中間體、噴霧劑中的傳遞規(guī)律，明確了影響心痛舒噴霧劑質量的關鍵工藝，可以為企業(yè)的生產和工藝優(yōu)化提供參考。