任新萍，李 勝，齊一霖，冉 松，張 程，曾曉希

（湖南工業(yè)大學(xué) 生命科學(xué)與化學(xué)學(xué)院，湖南 株洲 412007）

0 引言

鐵是自然界中常見的一種金屬，也是生物體所必需的礦質(zhì)元素之一，在光合作用、呼吸作用、固氮作用、三羧酸循環(huán)、氧化磷酸化等生理代謝過程中發(fā)揮著重要的作用[1-2]。由于絕大部分的鐵處于中性或堿性的有氧環(huán)境中，會(huì)形成難溶的Fe3+化合物，抑制生物體對(duì)其的利用，導(dǎo)致農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中植物缺鐵現(xiàn)象比較普遍，影響農(nóng)作物的產(chǎn)量、品質(zhì)[3-5]。為了適應(yīng)高氧低鐵的脅迫條件，大多數(shù)微生物和禾本科植物會(huì)誘導(dǎo)自身產(chǎn)生鐵載體，一種強(qiáng)金屬螯合劑，在缺鐵環(huán)境下能與Fe3+螯合成鐵-鐵載體復(fù)合物，將Fe3+轉(zhuǎn)運(yùn)至胞內(nèi)并還原成Fe2+供生物體利用[6-7]。由于鐵載體與鐵離子具有強(qiáng)螯合作用，當(dāng)發(fā)生螯合時(shí)就能阻止病原菌對(duì)鐵的吸收，從而達(dá)到生物防治作用[8]。鐵載體根據(jù)螯合基團(tuán)的化學(xué)性質(zhì)不同可分為三大類：兒茶酚型（Catecholates）、異羥肟酸型（Hydroxamates）和羧酸型（Carboxylates）[9-10]。

近年來(lái)，鐵載體在病原菌抑制、植物生長(zhǎng)調(diào)控、環(huán)境污染修復(fù)等方面受到廣泛的關(guān)注。朱慧明等[11]研究發(fā)現(xiàn)，銅綠假單胞菌Z158 對(duì)金黃色葡萄球菌、普通變形桿菌等病原菌具有抑菌作用，可作為生防菌株用于植物疾病防控。彭雯杰等[12]篩選得到一株阿斯青霉菌XK-12，研究發(fā)現(xiàn)其能產(chǎn)生異羥肟酸型鐵載體，鐵載體發(fā)酵液對(duì)病原菌具有抑制作用，對(duì)葡萄座腔菌的抑制率達(dá)到了100%。王東升等[13]發(fā)現(xiàn)鐵載體可顯著提高龍葵的生物量，與對(duì)照組未接菌相比，接種產(chǎn)鐵載體菌后的實(shí)驗(yàn)組的莖葉干重分別增加1.55,1.47 倍，根干重增加2.45,2.28 倍。趙銳名等[14]研究發(fā)現(xiàn)，產(chǎn)鐵載體細(xì)菌可以通過產(chǎn)生鐵載體，并通過鐵載體螯合Pb2+來(lái)提高受鉛脅迫芒草幼苗的耐受性，降低根系鉛的富集程度。因此，對(duì)產(chǎn)鐵載體微生物的篩選及鐵載體相關(guān)應(yīng)用進(jìn)行研究，能豐富產(chǎn)鐵載體微生物資源，進(jìn)一步了解分泌性鐵載體在醫(yī)藥、環(huán)境保護(hù)和農(nóng)業(yè)等各個(gè)領(lǐng)域的應(yīng)用，對(duì)于鐵載體研究有一定的基礎(chǔ)意義。

1 實(shí)驗(yàn)

1.1 材料

1.1.1 菌種來(lái)源

采集校園內(nèi)葉片發(fā)黃具缺鐵癥狀的植物根際土壤，加入無(wú)菌水振蕩，從菌懸液中進(jìn)行菌種篩選。金黃色葡萄球菌（StaphyloccocusaureusRosenbach）和大腸桿菌（Escherichiacoli）均為湖南工業(yè)大學(xué)生命科學(xué)與化學(xué)學(xué)院微生物實(shí)驗(yàn)室保藏菌種。

1.1.2 培養(yǎng)基

MKB 培養(yǎng)基：甘油15 mL、酸水解酪蛋白5 g、磷酸氫二鉀2.5 g、硫酸鎂1 g，溶于1 L 水中，pH 自然，121 ℃溫度下滅菌20 min。

CAS 固體培養(yǎng)基：質(zhì)量分?jǐn)?shù)為10%的酸水解酪蛋白30 mL、質(zhì)量分?jǐn)?shù)為20%的蔗糖溶液10 mL、0.1 mol/L 磷酸鹽緩沖液5 mL、1 mmol/L CaCl21 mL、CAS 染液50 mL、瓊脂18 g，溶于1 L 水中，121℃溫度下滅菌20 min。

CAS 雙層固體培養(yǎng)基：兩層培養(yǎng)基，上層為MKB 固體培養(yǎng)基，下層為CAS 固體培養(yǎng)基

PDA 培養(yǎng)基：馬鈴薯浸粉5 g、葡萄糖20 g、氯霉素0.1 g、瓊脂18 g，溶于1 L 水中，pH 自然，121℃溫度下滅菌20 min。

LB 培養(yǎng)基：蛋白胨5 g、酵母浸粉10 g、NaCl 5 g、瓊脂 18 g，加水定容至1 L，121℃溫度下滅菌20 min。

1.1.3 主要試劑

CAS（鉻天青）染液：A 液，CAS 0.605 g，100 μL 濃鹽酸，100 mL 濃度為1 mmol/L 的氯化鐵，500 mL 去離子水；B 液，CTAB 0.729 g，400 mL 去離子水；A 液倒入B 液混勻。

質(zhì)量分?jǐn)?shù)為10%的酸水解酪蛋白：稱取10 g 酸水解酪蛋白粉末溶于100 mL 水中。

質(zhì)量分?jǐn)?shù)為20%的蔗糖溶液：稱取20 g 蔗糖溶于100 mL 水中。

檸檬酸緩沖液（pH 值為4）：84.7 mL 濃度為0.1 mol/L醋酸與15.3 mL濃度為0.25 μmol/L醋酸鈉混勻。

鉬酸鹽溶液：100 g 硝酸鈉、100 g 鉬酸鈉，定容至1 000 mL。

1 mmol/L AgNO3：稱取AgNO30.169 88 g，定容至1 000 mL。

0.1 mol/L 磷酸鹽緩沖液（pH 值為6.8）：Na2HPO4·12H2O 24.27 g、NaH2PO4·2H2O 5.905 g、KH2PO40.75 g、NH4Cl 2.5 g、NaCl 1.25 g，溶于1 L水中。

瓊脂、蛋白胨、酵母浸粉、氯化鈣、甘油、蔗糖、3,5-二硝基水楊酸，上海生工生物工程有限公司；葡萄糖，天津大茂化學(xué)試劑廠；無(wú)水乙醇，湖南匯虹試劑有限公司；硝酸鈉、硝酸銀、鉬酸鈉、酸水解酪蛋白、磷酸氫二鉀，國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；以上試劑均為分析純。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 菌株篩選

1）初篩。取土樣5 g 溶于100 mL 的錐形瓶中，振蕩培養(yǎng)30 min，使樣品充分混合均勻。采用濃度梯度稀釋法，稀釋成10-2,10-3,10-4,10-5g·mL-14 個(gè)濃度梯度備用；采用涂布平板法，取各濃度的菌懸液各100 μL，涂布在CAS 雙層平板上，倒置培養(yǎng)3～5 d，待有菌落出現(xiàn)，挑取周圍產(chǎn)生棕黃色或紅色螯合圈的菌落進(jìn)行反復(fù)劃線分離，將分離后得到的純菌株進(jìn)行復(fù)篩并保藏。

2）復(fù)篩。采用CAS 平板檢測(cè)法和CAS 液體顯色法進(jìn)行復(fù)篩，將初篩菌株用接種環(huán)點(diǎn)接到CAS 固體培養(yǎng)基上，在30 ℃倒置培養(yǎng)7 d，觀察菌落透明圈的顏色和大小。將初篩菌株接種于MKB 培養(yǎng)基中，在30 ℃、180 r/min 培養(yǎng)7 d，取發(fā)酵液用多層紗布過濾菌體，將上清液與CAS 染液1:1 混勻，觀察混合液的顏色變化。

1.2.2 菌株鑒定

1）形態(tài)學(xué)鑒定。參考《微生物學(xué)實(shí)驗(yàn)教程》[15]，將活化后的菌株稀釋涂布至PDA 培養(yǎng)基上，在30 ℃溫度下倒置培養(yǎng)3～7 d，觀察菌落形成過程及菌落特征。

2）分子生物學(xué)鑒定。提取真菌RNA，逆轉(zhuǎn)錄生成cDNA 后以真菌通用引物進(jìn)行PCR 擴(kuò)增[16]，將PCR 擴(kuò)增產(chǎn)物送至上海生工測(cè)序，測(cè)序結(jié)果利用NCBI-BLAST 進(jìn)行序列比對(duì)，并利用MEGA 軟件構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹。

1.2.3 菌株鐵載體曲線測(cè)定

將活化后的菌株接種至發(fā)酵培養(yǎng)基MKB 培養(yǎng)基上，在30℃、180 r/min 的搖床上培養(yǎng)7 d。用無(wú)菌紗布進(jìn)行過濾，得到發(fā)酵上清液，吸取2 mL 發(fā)酵上清液并加入等體積的CAS 染液，混合均勻后測(cè)定其OD630值，記作As；測(cè)定空白培養(yǎng)基的OD630值，記作Ar；鐵載體活性單位[17]記作SU（%），表示鐵載體產(chǎn)量，計(jì)算公式為SU=（Ar-As）/Ar×100%。

1.2.4 鐵載體類型鑒定

鐵載體類型鑒定，分別采用Arnow 實(shí)驗(yàn)檢驗(yàn)兒茶酚型鐵載體，F(xiàn)eCl3實(shí)驗(yàn)檢驗(yàn)異羥肟酸型鐵載體或兒茶酚型鐵載體，分光光度法鑒定是否羧酸型鐵載體[18-19]。

Arnow 實(shí)驗(yàn)。取1 mL 發(fā)酵上清液和未接菌的培養(yǎng)基分別加入2 根試管中，再向兩根試管中分別加入1 mL濃度為0.5 mol/L鹽酸和1 mL鉬酸鹽溶液。若此時(shí)溶液顏色變黃，再加入1 mL 濃度為1 mol/L的氫氧化鈉溶液；若溶液顏色由黃變紅，并且紅色保持一個(gè)小時(shí)不會(huì)消失，說明產(chǎn)生的鐵載體為兒茶酚型鐵載體。

FeCl3實(shí)驗(yàn)。取1 mL 發(fā)酵上清液和未接菌的培養(yǎng)基分別加入2 根試管中，再加入2 g/L 的FeCl3溶液，一次加入1 mL，總共加入5 mL。若加入1 mL FeCl3溶液后立即變紅，則為異羥肟酸型鐵載體；若加入多于1 mL FeCl3溶液才發(fā)生顏色變化，則為兒茶酚型鐵載體。

分光光度法。取1 mL 發(fā)酵上清液于試管中，依次加入1 mL 濃度為0.25 μmol/L 的CuSO4溶液和1 mL（pH 值為4.0）醋酸鹽緩沖液，將其在紫外分光光度計(jì)下進(jìn)行全波長(zhǎng)掃描，若在190～280 nm 之間有吸收峰出現(xiàn)，說明產(chǎn)生的鐵載體為羧酸型鐵載體。

1.2.5 菌株產(chǎn)鐵載體條件優(yōu)化

以MKB 液體培養(yǎng)基為基礎(chǔ)，選擇不同碳源、氮源和初始pH 值進(jìn)行菌株產(chǎn)鐵載體的條件優(yōu)化。

最佳碳源選擇。選擇果糖、乳糖、可溶性淀粉、蔗糖、葡萄糖和甘油作為不同的碳源進(jìn)行優(yōu)化，在裝液量為100 mL 的錐形瓶中，培養(yǎng)條件如下：以2%的量接種、培養(yǎng)溫度為30 ℃、轉(zhuǎn)速為180 r/min 和初始pH 值為7 進(jìn)行接種，并搖床培養(yǎng)7 d。測(cè)定不同條件下菌株的生長(zhǎng)量和鐵載體產(chǎn)量。選擇最佳碳源種類，將其濃度分別設(shè)置為5,10,15,20,25 g/L 的濃度梯度進(jìn)行優(yōu)化，采用上述培養(yǎng)條件，測(cè)定不同碳源濃度下菌株的生長(zhǎng)量和鐵載體產(chǎn)量。

最佳氮源選擇。選擇半胱氨酸、酸水解酪蛋白、(NH4)2SO4、KNO3、谷氨酸作為不同的氮源進(jìn)行優(yōu)化，在裝液量為100 mL 的錐形瓶中，在上述培養(yǎng)條件下培養(yǎng)。測(cè)定不同條件下菌株的生長(zhǎng)量和鐵載體產(chǎn)量。選用最佳氮源種類，將其質(zhì)量濃度分別設(shè)置2,3,4,5,6 g/L 的濃度梯度進(jìn)行優(yōu)化，培養(yǎng)條件同上所述，測(cè)定不同氮源濃度下菌株的生長(zhǎng)量和鐵載體產(chǎn)量。

最佳初始pH 值選擇。選擇初始pH 值為5,6,7,8,9 共5 個(gè)梯度，在裝液量為100 mL 的錐形瓶中，按照上述培養(yǎng)條件培養(yǎng)。測(cè)定不同初始pH 條件下菌株的生長(zhǎng)量和鐵載體產(chǎn)量。

1.2.6 探究鐵載體對(duì)病原菌的抑制作用

本實(shí)驗(yàn)取目標(biāo)菌株發(fā)酵至鐵載體活性最大時(shí)的發(fā)酵液，取發(fā)酵上清液來(lái)探究鐵載體對(duì)金黃色葡萄球菌和大腸桿菌的抑制作用，金黃色葡萄球菌和大腸桿菌為實(shí)驗(yàn)室保藏的菌株活化后備用。

1）鐵載體添加量對(duì)抑菌效果的影響。將提取出的鐵載體粗提取液與活化后的兩種菌液分別按比例混合，使鐵載體添加量梯度分別為0%,10%,20%,30%,40%?；旌虾髮⒒旌弦悍胖糜诤銣?fù)u床培養(yǎng)1 h后，用稀釋涂布平板法將兩種菌株接于平板中培養(yǎng)。觀察菌落的數(shù)目并記錄。

2）鐵載體粗提取液與病原菌培養(yǎng)時(shí)間對(duì)抑菌效果的影響。將提取出的鐵載體發(fā)酵液與活化后的兩種菌液分別按最優(yōu)添加量混合，混勻后將其置于恒溫?fù)u床分別培養(yǎng)1,3,5,8,12,24 h 后，用稀釋涂布平板法將兩種菌株接于平板中培養(yǎng)。觀察菌落數(shù)目并記錄。

2 結(jié)果與分析

2.1 產(chǎn)鐵載體菌株的篩選

利用CAS 雙層平板進(jìn)行初篩，對(duì)圖1a 中產(chǎn)生了橙紅色的菌群進(jìn)行分離純化，對(duì)初篩后的單菌株進(jìn)行CAS 平板復(fù)篩，結(jié)果如圖1b所示，菌株Ti-11 在平板上出現(xiàn)了明顯的透明圈并且出現(xiàn)橙紅色色暈，初步鑒定有鐵載體產(chǎn)生。將菌株Ti-11 的發(fā)酵液離心處理后，取上清液與CAS 染液1:1 混合，實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖1c所示，左邊為空白對(duì)照組，右邊為實(shí)驗(yàn)組，實(shí)驗(yàn)組中的液體逐漸從藍(lán)色轉(zhuǎn)變?yōu)榧t色，這進(jìn)一步證明該菌株有產(chǎn)生鐵載體的能力。

彩圖

圖1 產(chǎn)鐵載體菌株Ti-11的篩選結(jié)果Fig.1 Screening of iron producing carrier strain Ti-11

2.2 菌株的鑒定

2.2.1 形態(tài)學(xué)鑒定

Ti-11 菌株在PDA 培養(yǎng)基上培養(yǎng)，菌落表面隆起并形成白色菌絲（圖2）。生長(zhǎng)后期出現(xiàn)深綠色的孢子，深綠色的孢子會(huì)把附近菌落的菌絲染成深綠色，菌株背面呈現(xiàn)發(fā)散狀，邊緣呈現(xiàn)鋸齒狀，且與培養(yǎng)基緊密貼合，質(zhì)地較硬。在顯微鏡下該真菌的菌絲為比較細(xì)長(zhǎng)、表面光滑、邊緣整齊的單條管狀有隔膜的細(xì)絲。

彩圖

圖2 Ti-11 的菌株形態(tài)Fig.2 Strain morphology of Ti-11

2.2.2 分子生物學(xué)鑒定

提取Ti-11 的RNA，逆轉(zhuǎn)錄生成cDNA 后以真菌通用引物進(jìn)行PCR，PCR 產(chǎn)物凝膠電泳驗(yàn)證后送至上海生工測(cè)序，將測(cè)序結(jié)果利用NCBI-BLAST 進(jìn)行序列比對(duì)，選取同源性高的序列進(jìn)行系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹的構(gòu)建。Ti-11 系統(tǒng)發(fā)育樹結(jié)果如圖3所示，與菌株Ti-11 同源性最高的為Penicilliumoxalicum，即為草酸青霉菌。再結(jié)合以上形態(tài)學(xué)鑒定結(jié)果可以綜合得出Ti-11 為草酸青霉菌。

圖3 Ti-11 系統(tǒng)發(fā)育樹Fig.3 Phylogenetic tree of Ti-11

2.3 菌株產(chǎn)鐵載體曲線測(cè)定

利用紫外分光光度法測(cè)定菌株的產(chǎn)鐵載體能力，每隔1 d 測(cè)定其鐵載體活性，結(jié)果如圖4所示。

圖4 菌株Ti-11 產(chǎn)鐵載體變化曲線Fig.4 Iron production carrier curve of strain Ti-11

Ti-11 的產(chǎn)鐵載體周期較長(zhǎng)，在1～7 d 呈現(xiàn)穩(wěn)步上升的趨勢(shì)，在第9 d 達(dá)到最大值，鐵載體活性達(dá)84.13%，比曹宏麗等[20]篩選得到的惡臭假單胞菌培養(yǎng)48 h 的產(chǎn)鐵載體含量增長(zhǎng)了30.69%。且在7～9 d保持相對(duì)穩(wěn)定，之后隨著時(shí)間的增大，菌株產(chǎn)生的代謝廢物不斷增加，抑制菌株的生長(zhǎng)和鐵載體的產(chǎn)生，呈現(xiàn)緩慢下降的趨勢(shì)。

2.4 菌株產(chǎn)鐵載體類型鑒定

采用Arnow 實(shí)驗(yàn)鑒定該菌株產(chǎn)鐵載體是否為兒茶酚型鐵載體，結(jié)果如圖5a所示（左邊為對(duì)照組，右邊為實(shí)驗(yàn)組），加入鐵載體的實(shí)驗(yàn)組未出現(xiàn)顯色反應(yīng)，故該鐵載體不為兒茶酚型鐵載體。加入1 mL 和3 mL FeCl3均未出現(xiàn)變紅反應(yīng)（圖5b），說明該鐵載體不為異羥肟酸型鐵載體和兒茶酚型鐵載體。紫外分光光度法鑒定該菌株產(chǎn)鐵載體是否為羧酸型鐵載體，結(jié)果如圖5c所示，該反應(yīng)液在190～280 nm之間出現(xiàn)吸收峰，證明菌株Ti-11 所產(chǎn)鐵載體類型為羧酸型鐵載體。

彩圖

圖5 Ti-11 產(chǎn)鐵載體類型鑒定結(jié)果Fig.5 Identification of Ti-11 iron production carrier types

2.5 菌株產(chǎn)鐵載體條件優(yōu)化

干重可以直接表明菌株的生長(zhǎng)狀況，而鐵載體活性單位則可以表明菌株在此條件下產(chǎn)鐵載體的情況。如圖6所示，Ti-11 菌株的最佳碳源是葡萄糖，最佳葡萄糖濃度為15 g/L。如圖7所示，Ti-11 菌株的最佳氮源是酸水解酪蛋白，其最佳濃度為6 g/L。

圖6 碳源及碳源濃度優(yōu)化結(jié)果Fig.6 Carbon source and carbon source concentration optimization results

圖7 氮源及氮源濃度優(yōu)化結(jié)果Fig.7 Nitrogen source and nitrogen source concentration optimization results

如圖8所示，初始pH 值為8 時(shí)，鐵載體活性最高，可達(dá)76.95%，但是干重在pH 值為6～7 時(shí)最大，說明Ti-11 菌株在酸性的條件下生長(zhǎng)較好，但是在偏堿性的初始pH 值環(huán)境下鐵載體產(chǎn)量較高。

圖8 初始pH 值優(yōu)化結(jié)果Fig.8 Initial pH optimization

2.6 鐵載體對(duì)病原菌的抑制作用探討

1）鐵載體添加量對(duì)抑菌效果的影響。鐵載體對(duì)金黃色葡萄球菌具有一定的抑菌效果，且效果隨濃度逐漸增加，如圖9（上）所示，從左至右添加量依次為0%，10%，20%，30%，40%，明顯看出隨著添加量的增大，菌落數(shù)量不斷減少，大于30%后抑菌效果沒有較大提升。鐵載體對(duì)大腸桿菌無(wú)明顯抑菌效果，如圖9（下）所示，從左至右添加量依次為0%，10%，20%，30%，40%，但菌落數(shù)無(wú)明顯差異。

圖9 鐵載體添加量對(duì)金黃色葡萄球菌（上）和大腸桿菌（下）的抑制作用Fig.9 Inhibitory effects of Fe-carrier supplementation on Staphylococcus aureus (top) and Escherichia coli (bottom)

2）鐵載體粗提液與病原菌培養(yǎng)時(shí)間對(duì)抑菌效果的影響。該鐵載體粗提液對(duì)于金黃色葡萄球菌有一定的抑制作用。繼續(xù)探討30%添加量下，不同反應(yīng)時(shí)間對(duì)抑制效果的影響，結(jié)果如圖10所示，從左到右分別為處理1,3,5,8,24 h，可以明顯看出隨著反應(yīng)時(shí)間的增長(zhǎng)，菌落數(shù)顯著減少。

圖10 反應(yīng)時(shí)間對(duì)金黃色葡萄球菌的抑制作用Fig.10 Inhibitory effect of reaction time on Staphylococcus aureus

3 結(jié)語(yǔ)

本研究從植物根際土壤中篩選得到一株高產(chǎn)鐵載體真菌Ti-11，經(jīng)鑒定為草酸青霉菌（Penicillium oxalicum）。測(cè)定其產(chǎn)鐵載體曲線，在第9 d 達(dá)到最大產(chǎn)量，為84.13%。通過單因素試驗(yàn)確定產(chǎn)鐵載體最佳培養(yǎng)條件為：10-3mol/L Fe3+能促進(jìn)菌株生長(zhǎng)，葡萄糖為最佳碳源，酸水解酪蛋白為最佳氮源，最佳初始pH 值為8.0。以大腸桿菌和金黃色葡萄球菌為抑菌實(shí)驗(yàn)對(duì)象，發(fā)現(xiàn)該含鐵載體的上清液能顯著抑制金黃色葡萄球菌，且處理24 h 時(shí)的抑菌效果最好。本研究為微生物產(chǎn)鐵載體提供了新資源，為鐵載體的廣泛應(yīng)用提供了新思路。