廖暉，吳峰華

(浙江農(nóng)林大學(xué)，浙江 杭州 311300)

香榧(Torreyagrandiscv. Merrili)又稱榧子、真榧、細榧等，紅豆杉科榧樹屬常綠喬木，為我國珍稀經(jīng)濟樹種之一，已有1 300多年的栽培歷史。香榧是一種營養(yǎng)價值較高的堅果，其食用部位為種仁，研究表明，香榧種仁中油脂含量高達42.61%～54.39%，其中80%為不飽和脂肪酸[1]；蛋白質(zhì)含量為10.43%～14.29%，含有17種氨基酸，且必需氨基酸總量約占總氨基酸含量的40%[2-3]。香榧餅粕是香榧子制油后產(chǎn)出的副產(chǎn)物，通常用于動物飼料和農(nóng)業(yè)肥料，經(jīng)濟效益低。但冷榨餅粕壓榨條件溫和，色澤淺、抗營養(yǎng)因子含量低、蛋白變性程度低，是一種極具開發(fā)價值的優(yōu)質(zhì)蛋白質(zhì)資源。

目前，堿法是提取植物蛋白主要方法之一，具有操作簡單、效率高、低成本等優(yōu)點。堿溶液不僅能破壞細胞壁，引起纖維素和半纖維素組分和結(jié)構(gòu)的改變，而且可以增加蛋白質(zhì)的溶解度[4]。但傳統(tǒng)堿法容易引起氨基酸結(jié)構(gòu)的變化，使蛋白質(zhì)變性，從而造成蛋白質(zhì)的營養(yǎng)品質(zhì)和必需氨基酸含量的下降，并且隨著pH值、溫度和提取時間的增加而加劇[5-6]。酶法輔助提取蛋白質(zhì)是通過糖酶降解細胞壁中的多糖，破壞細胞骨架結(jié)構(gòu)，增加細胞內(nèi)蛋白質(zhì)的溶出[7]。研究表明，酶輔助堿法具有提取能耗低、回收率高、溶劑用量少、對蛋白破壞程度小等特點[8-9]。本研究以香榧餅粕為原料，考察纖維素酶、半纖維素酶、果膠酶、木聚糖酶等細胞壁降解酶對蛋白質(zhì)提取率的影響，比較堿法與酶輔助堿法所提取蛋白的優(yōu)劣。在此基礎(chǔ)上，優(yōu)化酶輔助堿法提取蛋白工藝，旨在開發(fā)出一條綠色高效的高品質(zhì)蛋白制備新途徑。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

香榧產(chǎn)自浙江麗水市松陽縣三都鄉(xiāng)水竹村；植物提取復(fù)合酶制劑(主要包含纖維素酶、半纖維素酶、果膠酶等，純度≥99%)，購自成都萬象宏潤生物科技有限公司；果膠酶(30 000 U·g-1)、木聚糖酶(100 000 U·g-1)、纖維素酶(10 000 U·g-1)、半纖維素酶(5 000 U·g-1)，購自上海麥克林生化科技有限公司；石油醚(分析純，沸點30～60 ℃)、氫氧化鈉(分析純)、鹽酸(分析純)、考馬斯亮藍R-250(分析純)，購自國藥集團化學(xué)試劑有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

TDL-40B-Ⅱ低速大容量離心機，上海安亭科學(xué)儀器廠；PHSJ-3F 實驗室pH計，上海精密科學(xué)儀器有限公司；LC-ES-60SH 電動攪拌器，上海力辰邦西儀器科技有限公司；T6 新世紀型紫外可見分光光度計，北京普析通用儀器有限責(zé)任公司；AL104 電子天平，梅特勒-托利多儀器(上海)有限公司；HWS-24 電熱恒溫水浴鍋，上海一恒科學(xué)儀器有限公司；FD-1A-80冷凍干燥機，北京博醫(yī)康實驗儀器有限公司；GL-3250C磁力攪拌器，海門市其林貝爾儀器制造有限公司；質(zhì)譜儀，AutoflexⅢ型，日本島津儀器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 原料預(yù)處理方法

將香榧剝殼后，取香榧仁進行冷榨。餅粕處理方法：將香榧餅粕粉碎成粉后過60目篩，加入5倍的石油醚，在室溫下用磁性攪拌器攪拌提取2 h，然后將其過濾、棄去上清液后收集沉淀，以上過程重復(fù)操作3次后所得的沉淀物在室溫下置于通風(fēng)櫥揮干1 h后得脫脂粉。然后放入45 ℃的烘箱中干燥，使其含水量下降至5%后放入塑封袋放置于4 ℃的冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.2 香榧蛋白提取工藝

酶輔助堿法提取工藝流程：香榧餅粕粉末(4 g)→添加蒸餾水(料液比1∶10)→調(diào)節(jié)pH→加酶→一定溫度水浴攪拌(100 r·min-1)酶解→95 ℃滅酶10 min→調(diào)節(jié)溶液pH值至9→50 ℃水浴攪拌(100 r·min-1)提取1 h→離心(8 000 r·min-1，10 min)分離→香榧蛋白提取液。

堿法提取工藝流程：香榧餅粕粉末(4 g)→添加蒸餾水(料液比1∶10)調(diào)節(jié)溶液pH至9→50 ℃水浴攪拌(100 r·min-1)提取3.5 h→離心(8 000 r·min-1，10 min)分離→香榧蛋白提取液。

1.3.3 蛋白提取率的計算

蛋白質(zhì)含量采用凱氏定氮法進行測定，蛋白提取率按以下公式計算：

Y=100m1/m2。

式中，Y為提取率，%；m1為提取液蛋白質(zhì)量，g；m2為香榧粕蛋白質(zhì)量，g。

1.3.4 酶預(yù)處理輔助堿法單因素試驗

酶的篩選：控制料液比為1∶10，酶添加量為1.0%，酶解時間2 h，堿提時間1 h，比較纖維素酶、半纖維素酶、木聚糖酶、果膠酶、復(fù)合酶制劑在其最適酶解pH值和溫度條件下的蛋白提取率，優(yōu)選提取率高的酶進行單因素試驗及響應(yīng)面優(yōu)化設(shè)計。

優(yōu)選出最優(yōu)酶后，分別對4個單因素進行梯度試驗。包括：酶添加量(0.5%、1.0%、1.5%、2.0%、2.5%)、酶解溫度(10、20、30、40、50 ℃)、酶解pH(4.4、4.7、5.0、5.3、5.6)和酶解時間(0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0 h)。

1.3.5 蛋白提取響應(yīng)面試驗

在單因素試驗基礎(chǔ)上，根據(jù)Box-Behnken試驗原理，采用響應(yīng)面分析法進行優(yōu)化，以蛋白提取率為指標，設(shè)計四因素三水平的響應(yīng)面試驗(表1)。

表1 響應(yīng)面實驗設(shè)計因素與水平

1.3.6 氨基酸含量分析

采用GB 5009.124—2016《食品安全國家標準 食品中氨基酸的測定》，略作修改。將100 mg樣品與10 mL 6 mol·L-1鹽酸放入水解管中混合，滴加苯酚2～3滴，搖勻封口。密封的水解管在110 ℃下水解22 h。水解后，將水解液轉(zhuǎn)移至比色管中進行稀釋和振動混勻。準確吸取水解液1.0 mL，置于60 ℃真空干燥箱中干燥，干燥后用1 mL水溶解殘渣，重復(fù)操作兩次。在液相色譜儀分析樣品之前，需要進行衍生化。最后采用高效液相色譜儀進行分析。

1.4 數(shù)據(jù)分析

每組實驗3次重復(fù)，實驗結(jié)果以n±SD表示，采用Microsoft Excel 2016進行數(shù)據(jù)整理和圖形繪制，Design-Expert 8.0.6.1用于響應(yīng)面試驗設(shè)計及分析，使用SPSS 24.0 中的單因素Tukey 檢驗進行顯著性分析(P<0.05 表示差異顯著)。

2 結(jié)果與分析

2.1 最優(yōu)酶的篩選

植物細胞壁主要由纖維素和多糖類物質(zhì)組成，蛋白質(zhì)被纖維類物質(zhì)包裹在其中。利用細胞破壁酶處理植物組織，可降解植物細胞壁的纖維素骨架，使植物細胞壁崩潰，細胞壁內(nèi)的有效成分游離，提高胞內(nèi)物質(zhì)的提取率[10]。由圖1可知，在相同條件下，木聚糖酶對香榧蛋白的提取率最高，較半纖維素酶高了10.8百分點，較纖維素酶和混合酶制劑的提取率高了24.1百分點和27.9百分點，果膠酶提取率最低，比木聚糖酶低了35.6百分點。故選擇木聚糖酶作為最優(yōu)酶進行試驗。

同組柱上無相同小寫字母表示不同處理間差異顯著(P<0.05)，圖2～5同。

2.2 提取工藝單因素試驗結(jié)果

2.2.1 木聚糖酶添加量對蛋白提取率的影響

由圖2可知，隨著酶添加量的增加，蛋白質(zhì)提取率不斷增加，當(dāng)添加量為1.0%時提取率達到最高，為68.9%。這是因為隨著木聚糖酶添加量的增加，酶濃度增大，酶與底物接觸機會相應(yīng)增大，提高蛋白提取效率。但當(dāng)木聚糖酶添加量超過1%后，蛋白提取率開始下降，這是因為過量的酶濃度作用，酶會將底物包裹而減少了酶解作用[11]。故選擇酶的添加量為1.0%。

圖2 木聚糖酶添加量對蛋白提取率的影響

2.2.2 溫度對蛋白提取率的影響

由圖3可知，隨著酶解溫度的升高，蛋白提取率升高，在50 ℃時達到最高點，提取率為71.4%。這是因為木聚糖酶受外界溫度變化影響大[12]。在低溫時，酶活性會被抑制，導(dǎo)致提取率較低，在未達到最適溫度時，隨著溫度增加，被活化的分子數(shù)增加，分子間反應(yīng)幾率增加，促進酶促反應(yīng)。但當(dāng)溫度超過50 ℃時，蛋白提取率反而下降。這是因為高溫條件會造成酶的失活，影響蛋白提取率。此外，溫度過高會引起蛋白質(zhì)發(fā)生熱變性，部分溶解的蛋白質(zhì)會發(fā)生交聯(lián)聚合，蛋白質(zhì)的溶解度降低使得蛋白質(zhì)得率降低[13]。故選擇酶解提取溫度為50 ℃為宜。

圖3 提取溫度對蛋白提取率的影響

2.2.3 pH值對蛋白提取率的影響

由圖4可知，pH值對蛋白提取率的影響呈現(xiàn)出先上升后下降的趨勢。當(dāng)pH值較低時，蛋白質(zhì)提取率隨著pH值增大而增大，當(dāng)pH值達到5.0時，提取效果最佳，為70.3%。這是因為木聚糖酶在最適pH值時，酶活性強，有利于細胞壁的破裂，pH值偏高或偏低均使酶活性減弱，影響提取率[14]。故酶解pH值選擇5.0為宜。

圖4 pH值對蛋白提取率的影響

2.2.4 酶解時間對蛋白提取率的影響

由圖5可知，在酶解時間0.5～2.0 h時，蛋白提取率隨著時間的增加呈顯著上升趨勢，這是因為隨著時間的延長木聚糖酶與底物反應(yīng)逐漸完全[15]，當(dāng)時間達到2.0 h時，提取率達到了65.1%；當(dāng)酶解時間為3.0 h時，蛋白提取率為68.5%，僅比2.0 h的提取率增加了3.4百分點。綜合考慮生產(chǎn)效率和蛋白質(zhì)得率來看，繼續(xù)延長時間對蛋白提取意義不大，而且還會隨著時間的增加導(dǎo)致蛋白質(zhì)變性，發(fā)生凝集沉淀[16]，因此選擇酶解時間為2.0 h。

圖5 酶解時間對蛋白提取率的影響

2.3 提取工藝響應(yīng)面試驗結(jié)果

選擇木聚糖酶添加量、酶解溫度、酶解pH值、酶解時間為響應(yīng)因素，蛋白提取率為響應(yīng)值，運用Box-Behnken試驗設(shè)計原理，進行響應(yīng)面試驗，試驗結(jié)果見表2。

表2 香榧蛋白提取Box-Behnken實驗設(shè)計及結(jié)果

設(shè)木聚糖酶添加量為A，酶解溫度為B，酶解pH值為C，酶解時間為D，對表2試驗數(shù)據(jù)進行逐步回歸多次擬合，可得提取率(Y)二次多項式方程：

Y= 75.16+4.08A+0.20B+3.73C-2.76D-2.83AB+0.060AC+0.10AD-4.35BC-5.78BD+0.68CD-4.26A2-9.33B2-6.29C2-8.86D2。

由表3可知，提取率的回歸模型極顯著(P<0.001)；失擬項F值為3.66，表明模型擬合度良好，能較好解釋響應(yīng)中的變異。同時模型的決定系數(shù)R2=0.982 7，說明模型擬合程度良好，該模型能解釋98%響應(yīng)值的變化；校正決定系數(shù)R2Adj=0.965 5，說明試驗結(jié)果有96.55%受試驗因素的影響；失擬項P值不顯著(0.111 2>0.05)，說明試驗無失擬因素存在，表明預(yù)測值與實測值之間具有高度相關(guān)性，殘差均由隨機誤差引起。因此，可以用此回歸模型對蛋白提取率進行分析和預(yù)測。

方差分析中的顯著性檢驗可以判斷自變量對因變量的影響。由表4和圖6可知，B、C和D對蛋白提取率的影響極顯著(P<0.01)，而A影響不顯著(P>0.05)；模型中的交互項BC和BD對蛋白提取率的影響極顯著(P<0.000 1)，AB影響高度顯著(P<0.01)，而AC、AD和CD影響不顯著(P>0.05)；模型中的二次項A2、B2、C2和D2對蛋白提取率的影響均達極顯著水平(P<0.000 1)。

圖6 不同因素對香榧蛋白提取率影響的響應(yīng)面圖

表4 蛋白質(zhì)中氨基酸含量組成 單位：mg·g-1

通過Design-Expert 8.0.6.1軟件對回歸模型進行數(shù)學(xué)分析獲得最佳工藝為木聚糖酶添加量1.26%、酶解溫度48.85 ℃、酶解pH值5.10、提取時間2.45 h，在此條件下，預(yù)測的蛋白提取率最大理論值為76.97%。

2.4 香榧蛋白提取驗證實驗

為了方便實際操作，將條件調(diào)節(jié)為木聚糖酶添加量1.30%、酶解溫度49 ℃、酶解pH 值5.1、提取時間2.5 h，并結(jié)合料液比1∶10(g·mL-1)，pH 9.0堿提1 h，對香榧餅粕中蛋白進行提取驗證試驗。3次平行試驗得到實際平均蛋白提取率為76.13%，與理論值相比，其相對誤差為1.09%，小于5%，因此，該法優(yōu)化得到的蛋白提取工藝條件準確可靠，且與堿提3.5 h蛋白提取率(77.82%)效果相當(dāng)，有效減少了堿提時間，可以作為工業(yè)化應(yīng)用的依據(jù)。

2.5 蛋白質(zhì)中氨基酸含量分析

蛋白質(zhì)中的必需氨基酸含量的高低及構(gòu)成比例直接反映了蛋白質(zhì)的優(yōu)劣[17]。對兩種方法提取的蛋白質(zhì)中的氨基酸組成進行了分析，由表4可知，酶輔助堿法與堿法所提取的蛋白中均含有此次檢測的17種氨基酸，并包含7種必需氨基酸，色氨酸因堿性條件下水解未能檢測出。兩種方法所提取蛋白中的總氨基酸含量相近，必需氨基酸/總氨基酸平均值均高于WHO/FAO的推薦值(36%)，但酶輔助堿法所提取蛋白中的必需氨基酸/總氨基酸平均值(43.26%)顯著高于堿法所提取的蛋白中的必需氨基酸/總氨基酸平均值(39.58%)。這主要是因為用堿溶解蛋白質(zhì)時間太長會導(dǎo)致-OH和-SH的脫氫和脫硫，導(dǎo)致一些氨基酸的含量降低[18]。趙素斌等[19]對燕麥麩蛋白的研究中也發(fā)現(xiàn)，與堿法相比，同等條件下酶輔助堿法所提取蛋白的必需氨基酸/總氨基酸更高。因此，酶輔助堿法切實地優(yōu)化了所提取香榧蛋白的營養(yǎng)價值。

3 結(jié)論

本文以香榧餅粕作為研究對象，以蛋白提取率為判定標準，從幾種常見的破壁酶中篩選出木聚糖酶為蛋白提取最優(yōu)酶。通過單因素試驗和Box-Behnken設(shè)計優(yōu)化，考察了影響蛋白提取率的4個因素，得到的最佳提取工藝參數(shù)為料液比1∶10(g·mL-1)、木聚糖酶添加量1.30%、酶解溫度49 ℃、酶解pH值5.1、酶解時間2.5 h，在此條件下蛋白提取率為76.13%，與堿法所得蛋白提取率接近，但所提取的蛋白較堿法所提取的蛋白更為優(yōu)質(zhì)。利用酶輔助堿法提取香榧蛋白，方法操作和儀器設(shè)備簡單，反應(yīng)條件溫和，蛋白提取率高?？s短了常規(guī)堿性提取的持續(xù)時間，減少了蛋白質(zhì)損傷和不期望產(chǎn)物形成的可能，明顯提高了被提取的香榧蛋白的質(zhì)量。