王詩瑞,繆增強,邢江娃,沈國平,朱德銳,李永臻

(青海大學醫(yī)學院基礎醫(yī)學研究中心,西寧 810016)

相容性溶質(zhì)是耐鹽或嗜鹽菌為抵抗高鹽等外界極端條件而在體內(nèi)合成的有機小分子。四氫嘧啶類相容性溶質(zhì)具有耐高溫、抗干燥等特性,其中四氫嘧啶羥化酶(ectoine hydroxylase,EctD)是5-羥基四氫嘧啶(5-Hydroxyectoine,5-HE)在體內(nèi)合成的關鍵酶[1],是非含血紅素依賴的Fe2+與α-酮戊二酸(α-ketoglutarate)輔助的雙加氧超家族酶。本研究基于影響EctD催化合成5-HE的溫度、酸堿度、底物濃度和酶濃度等單因素實驗,利用響應面法探索用EctD于體外催化合成5-HE的最優(yōu)條件。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

EctD為課題組自制品。α-ketoglutarate購自上海麥克林生化科技有限公司,FeSO4、KCl、SDS、Tris和EDTA均購自天津市大茂化學試劑廠,四氫嘧啶(Ectoine,Ect)標準品、5-羥基四氫嘧啶(5-Hydroxyectoine,5-HE)標準品購自西格瑪奧德里奇(上海)貿(mào)易有限公司。

酶標儀(Bio-Rad,XmarkTM)購自美國BioRad公司,恒溫水浴鍋(EYELA OSB-2200)購自日本東京理化公司,酸堿度計(PHS-25-3C-2F)購自上海雷磁公司,高效液相色譜儀(HPLC,Agilent 1260II)購自美國安捷倫公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 5-HE標準曲線的建立

1.2.2 EctD反應體系的建立

參照文獻[4]建立EctD反應體系。配制10 mM TES緩沖液和0.5 mM Ect、1 mM Fe2+、10 mM α-ketoglutarate溶液,依次向反應管中加入各溶液30 μL及酶液50 μL,得到最終酶反應體系的總量為200 μL。反應25 min后,利用HPLC檢測,并根據(jù)2.1.1所示標準曲線相關方程計算5-HE合成量。

1.2.3 pH對EctD催化反應的影響

將反應溶液的pH分別調(diào)至5、6、7、8、9,在室溫下根據(jù)1.2.2所示反應條件進行催化反應實驗,研究酸堿性對酶催化反應的影響。

1.2.4 溫度對EctD催化反應的影響

在最適酸堿度下,將酶反應混合液分別置于25、30、35、40、45℃下,根據(jù)1.2.2所示反應條件進行催化反應實驗,研究溫度對酶催化反應的影響。

1.2.5 底物濃度對EctD催化反應的影響

在最適酸堿度和溫度下,在酶反應混合液中分別加入不同濃度(0.25、0.50、1.00、1.25、1.50 mM)Ect,根據(jù)1.2.2所示反應條件進行催化反應實驗,研究Ect濃度對酶催化反應的影響。

1.2.6 響應面Box-Benhnken實驗設計

以單因素實驗結果為基礎,選擇X1(溫度)、X2(酸堿度)、X3(Ect濃度)、X4(EctD濃度)為影響因素,以5-HE產(chǎn)量為響應值,設計4因素3水平響應面Box-Benhnken實驗29組,每組實驗重復3次,其數(shù)據(jù)以平均值±標準差表示,用Design-Expert 12.0軟件對實驗數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計分析,并得到相關回歸方程。EctD反應體系響應面實驗因素水平表見表1,響應面實驗設計方案與結果見表2。

表1 EctD酶反應體系響應面實驗因素水平表

表2 響應面實驗設計方案與結果

1.3 統(tǒng)計學方法

2 結果

2.1 酶促反應單因素實驗

2.1.1 5-HE標準曲線的繪制

按1.2.1所示方法得到5-HE濃度與峰面積的對應關系。不同濃度5-HE的HPLC峰面積見表3。以峰面積為縱坐標、5-HE標準液濃度為橫坐標繪制標準曲線。5-HE標準曲線圖見圖1。擬合得到回歸方程y=3874.9x+63.754,R2=0.9999,說明回歸方程可靠,可用以EctD反應產(chǎn)物5-HE的定量分析。

表3 不同濃度5-HE的HPLC峰面積

2.1.2 pH對EctD催化反應的影響

pH對EctD催化反應的影響見表4、圖2。5-HE的產(chǎn)量隨著pH的增大呈現(xiàn)先增高后降低的趨勢,且pH在5～6及6和9之間時無差異,其余各指標間的5-HE產(chǎn)量均有差異(P<0.05)。在pH為7時5-HE的產(chǎn)量達到最高值,說明EctD催化反應的最適pH為7。

圖2 pH對EctD催化反應影響圖

表4 不同pH下EctD酶催化合成5-HE的產(chǎn)量

2.1.3 溫度對EctD催化反應的影響

溫度對EctD催化反應的影響見表5、圖3。5-HE的產(chǎn)量隨著溫度的增加呈現(xiàn)先增高后降低的趨勢,且溫度在35℃～40℃之間時無差異,其余各指標間5-HE產(chǎn)量均有差異(P<0.05)。在溫度為35℃～40℃之間時,5-HE的量達到最高值,但在40℃～45℃之間時,5-HE的產(chǎn)量快速降低。

圖3 溫度對EctD催化反應影響圖

表5 不同溫度下EctD催化合成5-HE的產(chǎn)量

2.1.4 Ect濃度對EctD催化反應的影響

Ect濃度對EctD催化反應的影響見表6、圖4。5-HE的產(chǎn)量隨著Ect濃度的增加呈現(xiàn)先增高后逐漸穩(wěn)定的趨勢,且濃度在1.25～1.5 mM之間時無差異,其余各指標間5-HE產(chǎn)量均有差異(P<0.05)。當Ect濃度在1.25～1.5 mM之間時,隨著Ect濃度的增加5-HE的產(chǎn)量幾乎不再增加,說明此時底物Ect與酶催化活性中心的結合達到飽和,酶促反應效果達到最佳。

圖4 Ect濃度對EctD催化反應影響圖

表6 不同Ect濃度下EctD催化合成5-HE的產(chǎn)量

2.2 響應面回歸模型的建立及分析

響應面實驗設計與結果見表2,利用Design-Expert12.0軟件對實驗數(shù)據(jù)進行分析,經(jīng)方差分析結果可知,X1(溫度)、X2(酸堿度)、X3(底物Ect濃度)、X4(EctD濃度)的單獨作用及X1(溫度)與X4(EctD濃度)的交互作用對EctD催化合成5-HE產(chǎn)量的影響具有統(tǒng)計學意義(P<0.05),而X1(溫度)與X2(酸堿度)、X1(溫度)與X3(底物Ect濃度)、X2(酸堿度)與X3(底物Ect濃度)、X2(酸堿度)與X4(EctD濃度)及X3(底物Ect濃度)與X4(EctD濃度)的交互作用對EctD催化合成5-HE產(chǎn)量的影響無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。二次多項式模型的回歸方程:

Y=19.63-2.74X1-0.6845X2+2.46X3+4.35X4-4.13X1X4-7.06X12-10.87X22-4.20X32-5.16X42

由方差分析得出,所選模型的F為9.41,P<0.0001,表明模型具有顯著性,各因素對其響應值的影響具有統(tǒng)計學意義[2]。失擬項P為0.0634,不具有顯著性,因此該回歸方程可用于預測EctD催化合成5-HE產(chǎn)量的結果。影響EctD催化合成5-HE產(chǎn)量的最顯著因素是X4(EctD濃度),其次是X3(底物Ect濃度)和X1(溫度),而X2(酸堿度)的影響不大。X1(溫度)與X4(EctD濃度)的交互作用對EctD催化合成5-HE的產(chǎn)量具有顯著影響(P<0.05),其他交互項對EctD催化合成5-HE的產(chǎn)量影響相對較小。

2.3 響應面優(yōu)化

三維響應面圖和等高線圖可分析各因素之間對EctD催化合成5-HE產(chǎn)量的影響,每個響應面圖都代表著其中任意一個因素保持零水平時,其余兩個獨立因素之間的相互作用對響應值影響的變化趨勢。響應曲面坡度平緩,表明響應值可以耐受處理因素的變異,不影響響應值的大小;響應面坡度陡峭,表明響應值對處理因素敏感[3]。響應面三維立體圖曲面的最高點表示各因素相互作用后的最佳反應結果。根據(jù)回歸方程可做三維響應面圖和等高線圖,見圖5,A1A2、B1B2、C1C2分別是溫度與酸堿度、Ect濃度與EctD濃度、溫度與EctD濃度相互作用對EctD催化合成5-HE產(chǎn)量影響的三維立體圖和等高線圖。其中溫度與EctD濃度交互作用的等高線圖見圖5C2(接近橢圓形),表明兩者交互作用顯著,其余交互作用不顯著,與方差分析結果一致。由圖5C1和A1可知當酶濃度介于(0.4～1) U/mL、溫度介于30℃～45℃、酸堿度介于5～9之間時,EctD催化合成5-HE的產(chǎn)量可達到最大值。

圖5 響應面分析圖

由Box-Benhnken優(yōu)化實驗得到了EctD體外催化反應的最優(yōu)條件:溫度為35℃、pH為7、底物Ect濃度為1 mM、EctD濃度為0.6 U/mL。此條件下EctD催化合成5-HE產(chǎn)量的預測值為19.83/mg·L-1,實驗測得EctD催化合成5-HE的產(chǎn)量為(20.69±1.63) mg·L-1,與預測值接近(相對誤差=4.2%)。說明所得最優(yōu)條件可用于5-HE體外酶法合成。

3 討論

5-HE不僅具有抵抗高滲透壓、高溫、冷凍及干燥等作用[4],而且具有對生物大分子的保護功能[5],在生物醫(yī)藥和化妝品領域具有良好的應用前景[6]。但現(xiàn)有5-HE生產(chǎn)工藝產(chǎn)量偏低,限制了其在各領域的研究和應用。ectD是嗜鹽菌應對極端環(huán)境時合成相容性溶質(zhì)5-HE的關鍵基因,廣泛存在于Firmicutes、Proteobacteria、Actinobacteria等嗜鹽微生物中。目前提高5-HE產(chǎn)量的合成策略有工程菌的構建和體外酶催化合成,但在工程菌胞內(nèi)合成5-HE的調(diào)控機制復雜,且后期5-HE與其前體物Ect分離純化困難。因此,本研究主要從EctD體外催化合成5-HE的方向研究酸堿度、溫度、底物濃度、酶濃度對EctD催化合成5-HE產(chǎn)量的影響。

源自Sphongopyxisalaskensis[7]、Paenibacilluslautus[8]、Alkalilimnicolaehrlichi[9]、Acidiphiliumcryptum[10]、Halomonaselongata[11]和Paenibacillusstutzeri[12]等菌株的EctD催化機制研究顯示,與Fe2+結合的His146、Asp148、His248,與α-ketoglutarate結合的Arg259、Ser250、Phe143、Arg131、Asn133、Phe95,及與Ect結合的Gln129、Trp152、Ser165、Phe242、Phe263等氨基酸殘基是保持EctD活性的必須結構[13]。EctD催化合成5-HE的機理是,先由共底物α-ketoglutarate脫去羧基形成琥珀酸并釋放一分子二氧化碳,與此同時,氧分子中的一個氧原子被納入琥珀酸鹽,而另一個氧原子取代四氫嘧啶芳香環(huán)上的5-位氫原子形成羥基,得到產(chǎn)物5-HE[14]。

響應面優(yōu)化法是一種實驗條件尋優(yōu)方法,通過連續(xù)對實驗過程中各個因素水平進行分析,構建預測模型,找出實驗的最優(yōu)條件。本實驗利用此方法來優(yōu)化EctD催化反應條件,通過實驗數(shù)據(jù)的方差分析結果發(fā)現(xiàn),模型的F為9.41,P小于0.0001,失擬項P為0.0634時,模型具有顯著性而失擬項不具有顯著性,說明該回歸方程可信。X1(溫度)、X3(底物Ect濃度)、X4(EctD濃度)的單獨作用及 X1(溫度)與X4(EctD濃度)的交互作用對EctD催化合成5-HE的產(chǎn)量影響顯著,回歸方程一次項系數(shù)的絕對值的大小依次為X4(EctD濃度)>X3(底物Ect濃度)>X1(溫度)>X2(酸堿度),說明X4(EctD濃度)對EctD催化反應的影響最大。

綜上所述,本實驗主要篩選了對酶催化反應影響較大的溫度、酸堿度和Ect、EctD濃度四個因素,利用Box-Benhnken法設計實驗對EctD體外催化合成5-HE的體系進行優(yōu)化,獲得了EctD體外催化反應的最優(yōu)條件,為5-HE的相關研究及工業(yè)利用奠定了實驗基礎。