孫嬌嬌，朱衛(wèi)紅，金 日，曹光蘭,3*

(1.延邊大學(xué)地理與海洋科學(xué)學(xué)院，吉林 延吉 133002；2.哈爾濱學(xué)院，黑龍江省寒區(qū)濕地生態(tài)與環(huán)境研究重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，黑龍江 哈爾濱 150086；3.南開大學(xué)環(huán)境科學(xué)與工程學(xué)院，天津 300350)

土壤中的微生物是土壤生態(tài)系統(tǒng)的核心組成部分[1-2]。受水文和地貌條件以及植物群落的綜合影響，不同類型濕地為土壤中微生物提供的生存環(huán)境存在差異[3-4]。磷脂脂肪酸(phospholipid fatty acid，PLFA)是細(xì)菌和真核生物細(xì)胞膜中的關(guān)鍵結(jié)構(gòu)成分，不同微生物菌群的磷脂脂肪酸的組成和含量差異顯著[5]。磷脂脂肪酸分析技術(shù)是一種基于“生物標(biāo)志物”的技術(shù)，可以標(biāo)記土壤中的活體微生物類群[6]。研究表明，利用磷脂脂肪酸含量數(shù)據(jù)，可以直接分析土壤中細(xì)菌、真菌和放線菌等的生物量，定量評(píng)估微生物群落結(jié)構(gòu)的動(dòng)態(tài)[7-8]。近年來，磷脂脂肪酸分析技術(shù)被廣泛應(yīng)用于土壤中微生物生態(tài)特征的研究中。

圖們江流域擁有類型多樣、豐富的濕地資源[9-10]。不同濕地土壤中的養(yǎng)分含量具有高度的空間異質(zhì)性，其對(duì)土壤中的微生物群落組成有明顯影響[11-13]。已經(jīng)開展了圖們江下游濕地土壤中微生物群落的結(jié)構(gòu)[11]、圖們江下游流域濕地中遷徙水鳥多樣性[14]和圖們江下游自然濕地土壤種子庫特征[15]等方面的研究，而對(duì)濕地中不同植物群落區(qū)土壤中微生物群落的研究尚需要進(jìn)一步深入。

在圖們江下游流域的濕地中，主要分布著菰(Zizania latifolia)群落、灰脈薹草(Carex appendiculata)群落、蘆葦(Phragmites australis)群落、大葉章(Deyeuxia purpurea)群落、大穗薹草(Carex rhynchophysa)群落、皺果薹草(Carex dispalata)群落和長芒稗(Echinochloa caudata)群落等植物群落。本研究以圖們江下游琿春市濕地中的大葉章群落區(qū)、皺果薹草群落區(qū)和長芒稗群落區(qū)表層土壤中的菌類為研究對(duì)象，采用磷脂脂肪酸標(biāo)記法，研究菌類的磷脂脂肪酸的組成和含量，分析濕地類型、植物類型和土壤性質(zhì)對(duì)菌類的磷脂脂肪酸含量的影響。

1 材料與方法

1.1 采樣地布設(shè)、土壤樣品采集和分析測(cè)試

在吉林省延邊朝鮮族自治州琿春市的沼澤(42°37′19.25″N，130°34′17.95″E)、河流濕地(42°35′33.26″N，130°34′59.83″E)和湖泊濕地(42°35′33.41″N，130°35′0.82″E)中，布設(shè)采樣地。

在河流濕地中，選擇長芒稗群落區(qū)、大葉章群落區(qū)和皺果薹草群落區(qū)，分別作為采樣地1、采樣地2和采樣地3；在湖泊濕地中，選擇長芒稗群落區(qū)和大葉章群落區(qū)，分別作為采樣地4和采樣地5；在沼澤中，選擇皺果薹草群落區(qū)，作為采樣地6。所有被選擇的植物群落區(qū)的規(guī)格都大于2 m×10 m。

于2014年8月中旬，在每處采樣地中，隨機(jī)布設(shè)3個(gè)規(guī)格為1 m×1 m的樣方，樣方之間的間隔大于10 m。在每個(gè)樣方中，采用五點(diǎn)法，利用土鉆，采集0～10 深度土壤樣品5份，將所有表層土壤樣品中的植物殘根挑揀出來，然后，將5份表層土壤樣品混合均勻，分成2份，裝入滅菌自封袋中，運(yùn)回實(shí)驗(yàn)室。

在實(shí)驗(yàn)室中，將采集到的表層土壤樣品過2 mm篩；將每個(gè)樣方中的1份表層土壤樣品凍干，用于測(cè)定微生物群落組成；將另1份表層土壤樣品用于土壤理化指標(biāo)測(cè)定。

采用烘干法，測(cè)定表層土壤樣品的干質(zhì)量。利用表層土壤樣品的鮮質(zhì)量和干質(zhì)量數(shù)據(jù)，計(jì)算出表層土壤的含水量。土壤含水量等于土壤的鮮質(zhì)量與干質(zhì)量之差除以干質(zhì)量再乘以100%。

采用電位法，測(cè)定表層土壤樣品的pH(水土比為2.5∶1)。采用重鉻酸鉀容量法[13-14,16]，測(cè)定表層土壤中的有機(jī)質(zhì)含量。采用重鉻酸鉀-硫酸消化法[17]，測(cè)定表層土壤中的全氮含量。采用堿解擴(kuò)散法[18]，測(cè)定表層土壤中的速效氮含量。采用漬提-鉬銻抗比色法[19]，測(cè)定表層土壤中的速效磷含量。采用火焰光度法[19]，測(cè)定表層土壤中的速效鉀含量。

采用改良的Bligh-Dyer方法[20]，萃取表層土壤中的磷脂脂肪酸。利用氣象色譜儀(Agilent 7890B)搭載火焰離子檢測(cè)器(GC-FID)[21]，檢測(cè)土壤中微生物物種的磷脂脂肪酸的標(biāo)志物。利用MIDI Sherlock軟件，進(jìn)行磷脂脂肪酸的識(shí)別與定性。

參照文獻(xiàn)[21]和文獻(xiàn)[22]中的相關(guān)方法，對(duì)所得到的各種磷脂脂肪酸所表征的微生物進(jìn)行分類。

1.2 數(shù)據(jù)分析方法

采用雙因素方差分析方法，利用SPSS 25.0軟件，分析表層土壤中微生物群落結(jié)構(gòu)對(duì)不同類型濕地、植物群落區(qū)及其兩者的交互作用的響應(yīng)。

采用最小顯著性差異法，檢驗(yàn)各類型濕地、各植物群落區(qū)的各指標(biāo)值的變化。

采用Pearson相關(guān)分析方法，分析土壤中菌類的磷脂脂肪酸含量及其比值與表層土壤理化指標(biāo)值之間的關(guān)系。

采用冗余分析方法，利用Canoco 5.0 軟件，分析表層土壤理化指標(biāo)對(duì)菌類的磷脂脂肪酸含量的影響。采用蒙特卡羅檢驗(yàn)方法，分析表層土壤理化指標(biāo)的顯著性(499 次)。采用方差分解方法，分析表層土壤理化指標(biāo)、濕地類型、植物類型對(duì)菌類結(jié)構(gòu)變化的貢獻(xiàn)率。

2 結(jié)果與分析

2.1 各采樣地表層土壤的理化性質(zhì)

由表1可知，河流濕地中的長芒稗群落區(qū)表層土壤的全氮含量、有機(jī)質(zhì)含量、速效氮含量、速效磷含量和含水量都明顯大于湖泊濕地中的長芒稗群落區(qū)，而前者的速效鉀含量和pH略小于后者。

河流濕地中的大葉章群落區(qū)表層土壤的全氮含量、有機(jī)質(zhì)含量、速效氮含量、速效磷含量、含水量和pH都明顯小于湖泊濕地中的大葉章群落區(qū)，而前者的速效鉀含量明顯大于后者。

河流濕地中的皺果薹草群落區(qū)表層土壤的全氮含量、有機(jī)質(zhì)含量、速效氮含量和含水量都明顯大于沼澤中的皺果薹草群落區(qū)，而前者的速效磷含量、速效鉀含量和pH略小于后者。

雙因素方差分析(n=18)結(jié)果顯示，除了表層土壤的速效鉀含量以外，濕地類型對(duì)表層土壤的全氮含量(p＜0.05)、有機(jī)質(zhì)含量(p＜0.001)、速效氮含量(p＜0.01)、速效磷含量(p＜0.05)、含水量(p＜0.001)、pH(p＜0.001)都具有顯著影響。

除了表層土壤的速效磷含量和pH以外，植物群落類型對(duì)表層土壤的全氮含量(p＜0.01)、有機(jī)質(zhì)含量(p＜0.001)、速效氮含量(p＜0.001)、速效鉀(p＜0.001)、含水量(p＜0.001)都具有顯著影響。

除了表層土壤的速效磷含量以外，濕地類型與植物群落類型的交互作用對(duì)表層土壤的全氮含量(p＜0.001)、有機(jī)質(zhì)含量(p＜0.001)、速效氮含量(p＜0.001)、速效鉀(p＜0.001)、含水量(p＜0.05)、pH(p＜0.05)都具有顯著影響。

2.2 各采樣地表層土壤中菌類的組成和磷脂脂肪酸含量

在河流濕地中的長芒稗群落區(qū)、大葉章群落區(qū)和皺果薹草群落區(qū)、湖泊濕地中的長芒稗群落區(qū)和大葉章群落區(qū)、沼澤中的皺果薹草群落區(qū)的表層土壤中，檢測(cè)出了17種磷脂脂肪酸。

圖1顯示，表征革蘭氏陽性菌的6種磷脂脂肪酸 分 別 為14:0iso、15:0iso、16:0iso、17:0iso、15:0anteiso 和17:0anteiso；表征革蘭氏陰性菌的3 種磷 脂 脂 肪 酸 分 別 為16:1ω7c、cyclo17:0ω7c 和cyclo19:0ω7c；表征其他細(xì)菌的3 種磷脂脂肪酸分別為磷脂脂肪酸14:0、磷脂脂肪酸15:0 和磷脂脂肪酸17:0；表征真菌的1 種磷脂脂肪酸為18:2ω6c；表征叢枝菌根真菌的1 種磷脂脂肪酸為16:1ω5c；表征放線菌的3 種磷脂脂肪酸分別為10Me16:0、10Me17:0和10Me18:0。

圖1 河流濕地、湖泊濕地和沼澤的3種植物群落區(qū)表層土壤中菌類的磷脂脂肪酸相對(duì)豐度示意圖Fig.1 Schematic map of the relative abundance of phospholipid fatty acids of bacteria in surface soil of 3 plant community areas in the river wetlands,lake wetlands and marshes

在河流濕地、湖泊濕地和沼澤中，各植物群落區(qū)表層土壤中15:0iso、16:1ω7c 和10Me16:0 的相對(duì)豐度都較大。

湖泊濕地和河流濕地的大葉章群落區(qū)表層土壤中的細(xì)菌、放線菌、真菌、叢枝菌根真菌的磷脂脂肪酸含量都最大或者第二大；除了真菌和叢枝菌根真菌的磷脂脂肪酸含量以外，沼澤的皺果薹草群落區(qū)表層土壤中的細(xì)菌和放線菌的磷脂脂肪酸含量都最小(表2)。

表2 河流濕地、湖泊濕地和沼澤3種植物群落區(qū)表層土壤中菌類的磷脂脂肪酸含量Table 2 Contents of phospholipid fatty acids of bacteria in surface soil of 3 plant community areas in the river wetlands,lake wetlands and marshes

在各植物群落區(qū)表層土壤的真菌與細(xì)菌的磷脂脂肪酸含量的比值、革蘭氏陽性菌與革蘭氏陰性菌的磷脂脂肪酸含量的比值、細(xì)菌與放線菌的磷脂脂肪酸含量的比值中，沼澤的皺果薹草群落區(qū)表層土壤中的真菌與細(xì)菌的磷脂脂肪酸含量的比值、革蘭氏陽性菌與革蘭氏陰性菌的磷脂脂肪酸含量的比值都最大，湖泊濕地的皺果薹草群落區(qū)表層土壤中的真菌與細(xì)菌的磷脂脂肪酸含量的比值最小，湖泊濕地的大葉章群落區(qū)表層土壤中的革蘭氏陽性菌與革蘭氏陰性菌的磷脂脂肪酸含量的比值最?。缓礉竦氐拇笕~章群落區(qū)表層土壤中的細(xì)菌與放線菌的磷脂脂肪酸含量的比值最大，湖泊濕地的長芒稗群落區(qū)表層土壤中的細(xì)菌與放線菌的磷脂脂肪酸含量的比值最小。

雙因素方差分析(n=18)結(jié)果顯示，除了叢枝菌根真菌的磷脂脂肪酸含量和細(xì)菌與放線菌的磷脂脂肪酸含量的比值以外，濕地類型對(duì)表層土壤中的革蘭氏陽性菌的磷脂脂肪酸含量(p＜0.001)、革蘭氏陰性菌的磷脂脂肪酸含量(p＜0.001)、細(xì)菌的磷脂脂肪酸含量(p＜0.001)、放線菌的磷脂脂肪酸含量(p＜0.001)、真菌的磷脂脂肪酸含量(p＜0.05)、菌類的磷脂脂肪酸總含量(p＜0.001)、真菌與細(xì)菌的磷脂脂肪酸含量的比值(p＜0.001)、革蘭氏陽性菌與革蘭氏陰性菌的磷脂脂肪酸含量的比值(p＜0.01)都具有顯著影響；植物類型對(duì)表層土壤中的革蘭氏陽性菌的磷脂脂肪酸含量(p＜0.001)、革蘭氏陰性菌的磷脂脂肪酸含量(p＜0.001)、叢枝菌根真菌的磷脂脂肪酸含量(p＜0.001)、細(xì)菌的磷脂脂肪酸含量(p＜0.001)、放線菌的磷脂脂肪酸含量(p＜0.001)、真菌含量(p＜0.05)、菌類的磷脂脂肪酸總含量(p＜0.001)、真菌與細(xì)菌的磷脂脂肪酸含量的比值(p＜0.05)、革蘭氏陽性菌與革蘭氏陰性菌的磷脂脂肪酸含量的比值(p＜0.01)、細(xì)菌與放線菌的磷脂脂肪酸含量的比值(p＜0.01)都具有顯著影響；除了真菌的磷脂脂肪酸含量、叢枝菌根真菌的磷脂脂肪酸含量和真菌與細(xì)菌的磷脂脂肪酸含量的比值以外，濕地類型與植物群落類型的交互作用對(duì)表層土壤中的革蘭氏陽性菌的磷脂脂肪酸含量(p＜0.05)、革蘭氏陰性菌的磷脂脂肪酸含量(p＜0.001)、細(xì)菌的磷脂脂肪酸含量(p＜0.001)、放線菌的磷脂脂肪酸含量(p＜0.05)、菌類的磷脂脂肪酸總含量(p＜0.001)、革蘭氏陽性菌與革蘭氏陰性菌的磷脂脂肪酸含量的比值(p＜0.001)、細(xì)菌與放線菌的磷脂脂肪酸含量的比值(p＜0.05)都具有顯著影響。

2.3 表層土壤中菌類結(jié)構(gòu)的影響因素

Pearson 相關(guān)分析結(jié)果顯示，除了真菌與細(xì)菌的磷脂脂肪酸含量的比值和真菌的磷脂脂肪酸含量以外，表層土壤中的全氮含量分別與菌類的其他8個(gè)指標(biāo)值都顯著相關(guān)；除了真菌與細(xì)菌的磷脂脂肪酸含量的比值以外，表層土壤中的有機(jī)質(zhì)含量、速效氮含量都分別與菌類的其他9個(gè)指標(biāo)值顯著相關(guān)(表3)。

表層土壤中的速效磷含量、速效鉀含量都分別與菌類所有10個(gè)指標(biāo)值都不相關(guān)。表層土壤的含水量只分別與叢枝菌根真菌的磷脂脂肪酸含量、真菌的磷脂脂肪酸含量、革蘭氏陰性菌的磷脂脂肪酸含量顯著負(fù)相關(guān)，而與菌類的其他指標(biāo)值都不相關(guān)。表層土壤pH 只分別與真菌與細(xì)菌的磷脂脂肪酸含量的比值、菌的磷脂脂肪酸總含量、細(xì)菌的磷脂脂肪酸含量、放線菌的磷脂脂肪酸含量、革蘭氏陽性菌的磷脂脂肪酸含量顯著相關(guān)，而與菌類的其他指標(biāo)值都不相關(guān)。

冗余分析結(jié)果顯示，排序軸1解釋了土壤理化性質(zhì)對(duì)菌類結(jié)構(gòu)影響的91.76%(圖2)。其中，表層土壤中全氮含量、有機(jī)質(zhì)含量和速效氮含量是影響表層土壤中菌類的磷脂脂肪酸含量及其比值的主要因素(F=67.3，p=0.002)，這與Pearson 相關(guān)分析的結(jié)果相似。

圖2 表層土壤中菌類的磷脂脂肪酸含量及其比值與土壤理化指標(biāo)值的冗余分析排序圖Fig.2 Redundancy analysis sort diagram between contents of phospholipid fatty acids of bacteria in surface soil and their ratios and the values of physicochemical indexes of surface soil

圖3 顯示，土壤理化性質(zhì)、濕地類型和植物類型對(duì)表層土壤中菌類的磷脂脂肪酸含量變化的總解釋率為90%。其中，土壤理化性質(zhì)、濕地類型和植物類型對(duì)表層土壤中菌類的磷脂脂肪酸含量變化的單獨(dú)解釋率分別為5%、7%和12%，土壤理化性質(zhì)與植物類型對(duì)其的共同解釋率為21%，土壤理化性質(zhì)與濕地類型對(duì)其的共同解釋率為22%，三者對(duì)其的共同解釋率為8%。

圖3 土壤理化性質(zhì)、濕地類型和植物類型對(duì)表層土壤中菌類的磷脂脂肪酸含量變化的解釋率Fig.3 The explanation rates of physical and chemical property of soil,type of wetlands and type of plants to the changes of phospholipid fatty acid contents of bacteria in surface soil

3 討 論

在本研究中，3種類型濕地的不同植物群落區(qū)表層土壤中的菌類的組成和磷脂脂肪酸含量存在差異。不同類型的濱海濕地土壤中的微生物群落組成存在顯著差異[23]。河流和湖泊濕地明顯受季節(jié)性降水的影響，特別是在豐水期，河流和湖泊濕地中都會(huì)有較豐富的營養(yǎng)物質(zhì)輸入，能促進(jìn)養(yǎng)分在土壤中的積累[24-25]。植物可以為土壤中的微生物提供棲息地、養(yǎng)分和能量[26]。植物的凋落物可以為土壤中的微生物提供基質(zhì)和顯著影響微生物群落的結(jié)構(gòu)[27]。植物根系將氧氣輸送至根區(qū)土壤中，并釋放分泌物為微生物提供養(yǎng)分，其分泌物的特定代謝物對(duì)土壤中的微生物具有重要影響[28]。例如，在河流濕地中，因土壤的含水量較大，土壤缺氧，叢枝菌根真菌主要生活在植物根際區(qū)的土壤中，通過利用根系分泌物和根際釋放的氧氣進(jìn)行生長和發(fā)育[29]。土壤的理化性質(zhì)對(duì)土壤中的微生物影響較大[30]。在本研究中，表層土壤中的全氮含量、有機(jī)質(zhì)含量和速效氮含量是影響土壤菌類磷脂脂肪酸組成和含量的主要因素。良好的土壤環(huán)境能夠促進(jìn)微生物的生長和繁殖，土壤中的有機(jī)質(zhì)和氮元素能在微生物的代謝過程中為其提供可以利用的能源和合成細(xì)胞所需要的主要營養(yǎng)元素[31]，利于微生物的大量生長。在本研究中，3種類型濕地不同植物群落區(qū)表層土壤中真菌與細(xì)菌的磷脂脂肪酸含量的比值都小于1，說明細(xì)菌的磷脂脂肪酸含量大，而真菌的磷脂脂肪酸含量較小。這可能是由于土壤偏酸性所致，細(xì)菌適宜在微堿性或弱酸性環(huán)境中生存[32]。

土壤中微生物群落結(jié)構(gòu)受植物類型和土壤性質(zhì)等的綜合影響[33]。在本研究中，土壤理化性質(zhì)與濕地類型、其與植物類型分別共同解釋22%和21%的表層土壤中菌類的磷脂脂肪酸含量的變化，三者共同解釋8%的表層土壤中菌類的磷脂脂肪酸含量的變化。一方面，不同類型濕地的水文條件和形成過程具有顯著差異，其對(duì)土壤環(huán)境的影響大于植物對(duì)土壤環(huán)境的改造作用[34]。另一方面，雖然不同類型濕地中生長著相同的植物，但是土壤環(huán)境的差異不僅影響植物個(gè)體的生長、發(fā)育和繁殖過程，而且不同程度地影響土壤中的有機(jī)質(zhì)和養(yǎng)分含量，進(jìn)而導(dǎo)致不同類型濕地土壤中微生物群落結(jié)構(gòu)的差異性[35]。在本研究中，大葉章群落區(qū)表層土壤中菌類的磷脂脂肪酸含量明顯大于長芒稗群落區(qū)和皺果薹草群落區(qū)。與長芒稗相比，大葉章屬于多年生草本植物，根莖發(fā)達(dá)，具有較好的通氣組織，能改善土壤的微環(huán)境，促進(jìn)土壤中微生物的生長和發(fā)育[28,36]。

4 結(jié) 論

在圖們江下游濕地的長芒稗群落區(qū)、大葉章群落區(qū)和皺果薹草群落區(qū)的表層土壤中，檢測(cè)出17 種磷脂脂肪酸，其分別表征細(xì)菌(革蘭氏陽性菌、革蘭氏陰性菌和其他細(xì)菌)、真菌、叢枝菌根真菌和放線菌。表層土壤中菌類的磷脂脂肪酸組成和含量受濕地類型、植物類型和土壤性質(zhì)的共同影響。在土壤理化指標(biāo)中，全氮含量、有機(jī)質(zhì)含量和速效氮含量是影響表層土壤中菌類的磷脂脂肪酸組成和含量的主要因素。