顧 凡，陶 亮，2，3*，代佳和，2，3，李昌源，湯木果，田 洋，2，3

（1 云南農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)技術(shù)學(xué)院 昆明650201 2 食藥同源資源開發(fā)與利用教育部工程研究中心 昆明650201 3 云南省藥食同源功能食品工程研究中心 昆明 650201）

蜂蜜是蜜蜂采集植物的花蜜、分泌物或蜜露，與自身分泌物混合后，經(jīng)充分釀造而成的天然甜性物質(zhì)[1]，其含有酚類化合物[2]、酶[3]、礦物質(zhì)[4]等，營養(yǎng)成分豐富，具有抗氧化[5]、抗菌[6]、抗炎[7]，促進(jìn)骨骼、智力、造血系統(tǒng)發(fā)育[8]等多種生物活性。野生蜂蜜是指野生蜜蜂生產(chǎn)，而非人工飼養(yǎng)采集的蜂蜜。云南生態(tài)環(huán)境優(yōu)越，植物花卉繁多，蜜源豐富，有助于蜜蜂的生長繁殖及野生蜂蜜的釀造，是全國重要的蜂產(chǎn)品生產(chǎn)地。當(dāng)?shù)匾吧涿劢?jīng)加工處理保持了蜂蜜的營養(yǎng)價值及產(chǎn)品質(zhì)量，因其具有綠色天然的標(biāo)簽而大量出口，成為一種廣受人們歡迎的消費(fèi)品。風(fēng)味通常決定食物整體獨(dú)特的感官特征[9]，揮發(fā)性成分對食物整體的風(fēng)味有較大的影響。每種蜂蜜的風(fēng)味都具有一定差異，蜂蜜中豐富的揮發(fā)性風(fēng)味成分對其風(fēng)味有重要的貢獻(xiàn)，分析蜂蜜中的揮發(fā)性風(fēng)味成分，可作為鑒別蜂蜜蜜源及品質(zhì)的一種方法。目前云南野生蜂蜜品質(zhì)良莠不齊，差異較大，不利于蜂蜜的標(biāo)準(zhǔn)化與出口，急需建立一種快速檢測野生蜂蜜風(fēng)味品質(zhì)并對其特征風(fēng)味物質(zhì)進(jìn)行鑒別的分析方法。

現(xiàn)今常用的揮發(fā)性物質(zhì)分析方法有氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用（GC-MS）、電子鼻（E-nose）、氣相色譜-嗅聞（GC-O）等技術(shù)，國內(nèi)外學(xué)者運(yùn)用這些技術(shù)手段在揮發(fā)性成分研究方面取得了重要進(jìn)展[10-13]。氣相色譜（GC）是利用樣品與固定相吸附能力不同進(jìn)行分離；離子遷移光譜（IMS）是對化學(xué)離子物質(zhì)進(jìn)行表征的一項(xiàng)分析技術(shù)[14]；氣相色譜-離子遷移譜（GC-IMS）結(jié)合了氣相色譜的高分離能力和離子遷移譜（IMS）的快速響應(yīng)，是一種采用頂空進(jìn)樣分析固體或液體的頂空成分，對復(fù)雜的目標(biāo)化合物進(jìn)行無損定性分析的方法，具有無需前處理、操作簡單、分析周期短、靈敏度高等優(yōu)點(diǎn)，已被廣泛用于藥物檢測[15]、疾病監(jiān)測[16]、環(huán)境保護(hù)[17]等方面，在食品風(fēng)味分析方面優(yōu)勢突出。如Liedtke等[18]首次將激光解吸與GC-IMS 應(yīng)用于橄欖油鑒定，提出了GC-IMS 在質(zhì)量控制和摻假分析中的應(yīng)用。Chen 等[19]利用配備頂空儀的GC-IMS 對3類植物油進(jìn)行分類，對不同類型植物油的篩選識別準(zhǔn)確率達(dá)到100%。Zhang 等[20]通過HS-GC-IMS指紋識別與主成分分析相結(jié)合，研究4 ℃和25 ℃儲存過程中干魚揮發(fā)性組分的變化，可用于指導(dǎo)干魚的加工與儲藏。目前，關(guān)于GC-IMS 技術(shù)在蜂蜜研究中的應(yīng)用鮮有報道。

本研究以云南6 種野生蜂蜜為對象，利用GC-IMS 技術(shù)結(jié)合相關(guān)性分析、主成分分析、偏最小二乘判別分析方法對其特征風(fēng)味進(jìn)行測定，構(gòu)建6 種云南野生蜂蜜特征風(fēng)味物質(zhì)氣相離子遷移譜庫，以期確定6 種云南野生蜂蜜特征風(fēng)味物質(zhì)，為其鑒定提供理論依據(jù)，也可為個性化野生蜂蜜產(chǎn)品研發(fā)提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

試驗(yàn)材料為云南野生蜂蜜，樣品編號、蜂蜜種類、蜜蜂種類、采花種類（地區(qū)）見表1。

表1 蜂蜜樣品Table 1 Honey samples

1.2 方法

1.2.1 樣品處理 分別稱取云南6 種野生蜂蜜樣品2 g，置于20 mL 頂空瓶中，60 ℃孵育15 min 后進(jìn)樣，每種蜂蜜樣品重復(fù)試驗(yàn)3 次。

1.2.2 分析條件 氣相離子遷移譜檢測條件如下：分析時間：20 min；色譜柱類型：MXT-5（15 m ID：0.53 mm）；柱溫：60 ℃；載氣/漂移氣：N2；IMS 溫度：45 ℃；采用自動頂空進(jìn)樣，進(jìn)樣體積為500 μL；孵育時間：15 min；孵育溫度：60 ℃；進(jìn)樣針溫度：65 ℃；孵化轉(zhuǎn)速：500 r/min。柱流速初始為2 mL/min，保持2 min，2～20 min 柱流速線性增加至100 mL/min；飄逸氣體流速150 mL/min。

1.3 數(shù)據(jù)處理

采用GC-IMS 儀器配置軟件和插件進(jìn)行揮發(fā)性有機(jī)化合物的分析，主成分分析和偏最小二乘分析采用SMICA 14.1 分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同品種野生蜂蜜揮發(fā)性物質(zhì)差異對比

圖1 為采用GC-IMS 儀器LAV 分析軟件中的Reporter 插件程序，生成的不同品種蜂蜜揮發(fā)性化合物的氣相-離子遷移三維譜圖，圖2 為不同品種蜂蜜揮發(fā)性化合物氣相-離子遷移二維俯視圖。圖3 為不同品種蜂蜜揮發(fā)性化合物氣相-離子遷移譜圖（差異圖）。

圖1 不同品種蜂蜜揮發(fā)性化合物氣相-離子遷移三維譜圖Fig.1 Three-dimensional GC-IMS images of characteristic flavors of honey samples from different varieties

圖2 不同品種蜂蜜揮發(fā)性成分二維氣相-離子遷移分析譜圖Fig.2 Two-dimensional GC-IMS images of characteristic flavors of honey samples from different varieties

由圖1 可直觀地看出不同品種蜂蜜揮發(fā)性化合物具有一定差異，需要進(jìn)一步結(jié)合二維俯視圖和差異圖對樣品的氣相離子遷移譜進(jìn)行詳細(xì)分析。由圖2 可以看出大多數(shù)信號在保持時間100～800 s 和漂移時間1.0～1.6 ms 內(nèi)，云南6 種不同品種野生蜂蜜的揮發(fā)性風(fēng)味含量具有一定差異，標(biāo)注的黃色區(qū)域內(nèi)樣品4 含量較高，紅色區(qū)域內(nèi)樣品1 含量較低。圖3 是以江城野生大掛蜜為參比的差異譜圖，其余譜圖是扣除樣品1（江城野生大掛蜂蜜）中的信號峰所得到，藍(lán)色a 區(qū)域中的藍(lán)色信號峰，說明該物質(zhì)在此樣品中較樣品1 低，紅色b 區(qū)域中的紅色信號峰，說明在此樣品中較樣品1多，顏色越深，說明差異越大，差異圖譜更加容易區(qū)別出蜂蜜樣品的差異。

2.2 不同品種野生蜂蜜HS-GC-IMS 揮發(fā)性風(fēng)味成分定性分析

為了定性比較6 種樣品中揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)的相對差異，利用VOCal 插件處理數(shù)據(jù)，得到6 種蜂蜜樣品的離子遷移譜圖（圖4），圖中不同的點(diǎn)代表不同的揮發(fā)性有機(jī)化合物，有機(jī)物的濃度由這些點(diǎn)的顏色深淺表示?？v坐標(biāo)表示保留時間（s），橫坐標(biāo)表示漂移時間，紅色垂直線表示反應(yīng)離子峰（RIP 峰）。有的化合物有2 個斑點(diǎn)，分別代表濃度和性質(zhì)不同的單體和二聚體，它們雖保留時間相近，但遷移時間不同，故出現(xiàn)兩個斑點(diǎn)[21]。

圖4 不同品種蜂蜜中揮發(fā)性成分離子遷移譜定性分析Fig.4 IMS qualitative analysis of volatile compounds of honey samples from different varieties

根據(jù)數(shù)據(jù)庫定性分析后6 種野生蜜蜂樣品共檢出80 種揮發(fā)性物質(zhì)，定性檢出65 種，主要包括醛類24 種、醇類22 種、酮類6 種、酯類7 種、呋喃3 種、吡嗪類1 種、酸類1 種、醚類1 種。

圖5 為云南6 種野生蜂蜜揮發(fā)性組分相對含量變化，由圖可得蜂蜜的揮發(fā)性風(fēng)味成分主要為醛類、醇類、酮類，三者在6 種蜂蜜占比分別為94.3%，90.03%，80.18%，86.9%，82.46%，83.18%。醛類物質(zhì)是蜂蜜風(fēng)味的重要來源[22]，6 種野生蜂蜜中相對含量為26.46%，38.07%，27.70%，31.34%，28.92%，29.32%，并且醛類風(fēng)味閾值低[23]，故對風(fēng)味貢獻(xiàn)較大。醇類是蜂蜜釀造過程中產(chǎn)生，在樣品中相對含量雖較高，但通常閾值也較高，故對整體風(fēng)味貢獻(xiàn)率偏低。4、5、6 號樣品醇類物質(zhì)相對含量較高，經(jīng)分析其都來自普洱瀾滄縣，普洱瀾滄縣氣候適宜油菜花的生長，該地區(qū)大量種植油菜花，可能蜜蜂采集蜜源較多為油菜花，導(dǎo)致4、5、6 號樣品中蜂蜜中醇類物質(zhì)較多，與陳廷廷等[24]、涂世等[13]等研究分析蜜蜂采集油菜花會導(dǎo)致蜂蜜揮發(fā)性物質(zhì)中醇類較多結(jié)果吻合，為進(jìn)一步明確還需繼續(xù)研究。檢測到的酮類和酯類，為蜂蜜香味的重要組成，與前人研究的報道一致[25]。酮是由多不飽和脂肪酸氧化，游離氨基酸降解和微生物代謝產(chǎn)生[26-27]，感知閾值低，對風(fēng)味貢獻(xiàn)較大。雖然酯類相對含量較低，因其閾值也較低，所以對風(fēng)味貢獻(xiàn)率也較大，主要賦予蜂蜜香甜的果香味。

圖5 不同品種蜂蜜揮發(fā)性組分相對含量Fig.5 Relative content of volatile components of different varieties of honey

表2 為云南6 種野生蜂蜜揮發(fā)性成分定性分析，風(fēng)味描述在http：//www.thegoodscentscompany.com/查詢得出。

2.3 不同品種蜂蜜特征風(fēng)味HS-GC-IMS 指紋圖譜分析

不同產(chǎn)地、品種蜂蜜特征風(fēng)味指紋圖譜的構(gòu)建可為蜂蜜品質(zhì)評價和產(chǎn)地溯源提供有效手段。為進(jìn)一步分析比較不同產(chǎn)地蜂蜜樣品之間揮發(fā)性風(fēng)味化合物之間的差異，對云南6 種野生蜂蜜樣品揮發(fā)性成分平行測試3 次獲得HS-GC-IMS 二維圖譜中所有待鑒定信號峰，生成云南野生蜂蜜揮發(fā)性成分指紋圖譜，如圖6 所示。從圖中可以看出云南6 種野生蜂蜜樣品檢測得到的揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)，以及不同野生蜂蜜樣品之間的差異，數(shù)字表示未鑒定明確的揮發(fā)性化合物，顏色越亮，含量越高。

圖6 不同品種蜂蜜的指紋圖譜Fig.6 Fingerprint of volatile organic compounds of honey samples from different varieties

由圖6 可得，6 種蜂蜜揮發(fā)性物質(zhì)種類差異顯著。對比其它5 個樣品，1 號樣品中，癸醛、壬醛、辛醛、庚醛、戊醛、1-辛烯-3-醇、1-庚醇、2-己醇、1-戊醇、2，3-丁二醇、1-丁醇、2-戊酮、2-丁酮、丙酮等物質(zhì)的相對含量較高，其中壬醛（5.11%）、庚醛（2.63%）占據(jù)大部分，具有柑橘花香，在生產(chǎn)蜂蜜類產(chǎn)品時可添加江城野生大掛蜜使其具有一定柑橘花香，柑橘花香可能是江城野生大掛蜜的潛在特征風(fēng)味；2 號樣品中苯乙醛、苯甲醛、2-甲基丁醛、3-甲基丁醛、2-甲基-1-丁醇、2-丙醇、3-羥基-2-丁酮、丁酸甲酯、乙酸丙酯、二丙基二硫醚等物質(zhì)的含量較高，苯乙醛（2.38%）、苯甲醛（2.90%）具有玫瑰花香和杏仁味，添加野生黑蜜可使產(chǎn)品具有果香，略帶玫瑰花香；3 號樣品中乙酸苯甲酯、己醛、芳樟醇、6-甲基-5-庚烯-2-酮、乙酸甲酯等物質(zhì)的含量較高，乙酸苯甲酯（3.16%）是其主要成分，在茉莉、梔子、白蘭、風(fēng)信子香精中起主香劑作用，具有淡淡的茉莉和梔子花清香味；4 號樣品中氧化芳樟醇、γ-丁內(nèi)酯、2-乙酰基呋喃、糠醛、苯甲醇、2-呋喃甲醇、Z-3-己烯醇、2-甲基吡嗪、丙酸等物質(zhì)的含量較高，其中糠醛（15.93%）最高，具有木香、清涼感覺，適量添加可使飲料等產(chǎn)品別具風(fēng)味；6 號樣品中環(huán)己酮、E-2-庚烯醛、E-2-己烯醛、2-戊基呋喃、丁醛、5-甲基糠醛、1-己醇、異丁醇、異戊醇、乙醇、香茅醇、2-甲基丙酸乙酯、乙酸乙酯、2，3-丁二酮等物質(zhì)的含量較高。其中環(huán)己酮（30.42%）含量豐富，具有薄荷味，可作為甜味劑用于清涼型果凍、飲料等產(chǎn)品。本研究分析了不同的蜂蜜的特征風(fēng)味，可為蜂蜜的鑒定及產(chǎn)品開發(fā)應(yīng)用提供理論參考。

2.4 不同品種蜂蜜相似度與主成分分析

對云南6 種野生蜂蜜揮發(fā)性有機(jī)化合物進(jìn)行主成分分析（PCA）[28]，選取云南6 種不同野生蜂蜜樣品的特征峰的峰強(qiáng)度值為特征參數(shù)變量，得到第1、2 主成分圖（圖7a），不同顏色的點(diǎn)代表云南6 種不同品種的野生蜂蜜樣品的歸類情況。

圖7 不同品種蜂蜜的主成分得分圖（a）及載荷圖（b）Fig.7 Plot of principal component scores（a）and loadings（b）for different varieties of honey

當(dāng)累積貢獻(xiàn)率達(dá)到60%時，PCA 模型則可以作為分離模型[29]，通過信號強(qiáng)度進(jìn)行主成分分析（PCA）以突出揮發(fā)性化合物的不同，如Li 等[21]基于PCA 模型可清楚區(qū)分新鮮和干燥的松茸樣品的不同部分。利用PCA 模型，Martín-Gómez 等[30]基于不同的揮發(fā)性組分，可以有效區(qū)分煙熏的干火腿與其它類型干火腿，同時通過鑒定揮發(fā)性成分可用于區(qū)別不同地區(qū)的干腌火腿[31]。如圖7a 所示，第1 主成分（PC1）貢獻(xiàn)率和第2 主成分（PC2）貢獻(xiàn)率分別為43%，24.4%，PC1 與PC2 的貢獻(xiàn)率之和為67.4%，說明2 個主成分能較好地體現(xiàn)原始數(shù)據(jù)所反映的信息。通過圖7a 可以看出，1 號樣品在第4 象限，2 號樣品在第1 象限、4 號樣品在第2 象限，3、5、6 號樣品在第3 象限。主成分分析分析表明，云南6 種野生蜂蜜能得到較好的區(qū)分，3、5、6 號樣品相似度較強(qiáng)，1、2、4 號樣品差異較大。同時結(jié)合圖7b 可以清楚地看出，每種蜂蜜的揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)分布情況，如圖7a 樣品1 對應(yīng)圖7b 位置處紅色方框內(nèi)揮發(fā)性物質(zhì)含量較多。

2.5 云南6 種野生蜂蜜揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)PLSDA 及模型驗(yàn)證

PCA 側(cè)重于描述樣本的分類趨勢，與PCA 分析不同的是PLS-DA 是一種有監(jiān)督的分析，可對復(fù)雜數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，讓數(shù)據(jù)可視化，從而建立模型對數(shù)據(jù)進(jìn)行預(yù)測的一種方法。可用于建立HS-GC-IMS 測定的VOCs 強(qiáng)度與樣品類別之間的相關(guān)模型，從而可以得到影響分組的重要變量[32]。

通過偏最小二乘判別分析法對云南6 種野生蜂蜜揮發(fā)性有機(jī)化合物進(jìn)行分析，得到6 種蜂蜜樣品的PLS-DA 得分圖，結(jié)果如圖8a 所示，與主成分分析結(jié)果一致，不同的蜂蜜樣品得到了明顯的區(qū)分。SIMCA 軟件處理數(shù)據(jù)顯示，R2X=0.969、R2Y=0.988、Q2=0.972，當(dāng)R2和Q2大于0.5 時，表明模型具有較為準(zhǔn)確的概括解釋能力和預(yù)測能力，可以根據(jù)本研究中鑒定得到的云南6 種野生蜂蜜揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)組成，區(qū)分開不同的品種，明確它們之間的差異。

圖8 云南6 種野生蜂蜜中揮發(fā)性有機(jī)物的得分圖（a）、PLS-DA 擬合曲線（b）及VIP 值分布（c）Fig.8 Score plot（a）、PLS-DA simulation（b）and VIP distribution（c）of volatile organic compounds in 6 wild honeys from Yunnan

圖8b 為經(jīng)過置換檢驗(yàn)對PLS-DA 所做的模型進(jìn)行驗(yàn)證，從圖8b 可以看出，R2與縱軸相交（0，0.193），Q2與縱軸相交（0，-0.646），2 條回歸線斜率較大，該模型具有較好的預(yù)測能力，無過擬合現(xiàn)象。經(jīng)過驗(yàn)證，確定本模型可用于研究云南6 種不同品種蜂蜜樣品的揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)分類判別。VIP值是蜂蜜樣品中每種揮發(fā)性化合物對蜂蜜樣品的風(fēng)味影響程度大小的量化指標(biāo)，VIP 值越大，差異越顯著，通過觀測VIP 值，可以分析得到潛在的標(biāo)志物。經(jīng)過對云南6 種野生蜂蜜揮發(fā)性化合物篩選，從圖8c 可清楚看出共篩選了20 種VIP>1 的揮發(fā)性化合物，分別是1-庚醇（VIP=2.09）、6-甲基-5-庚烯-2-酮（VIP=1.89）、2-甲基丙酸乙酯（VIP=1.52）、乙酸乙酯（VIP=1.44）、己醛（VIP=1.43）、環(huán)己酮（VIP=1.35）、芳樟醇（VIP=1.34）、丁醛（VIP=1.25）、二丙基二硫醚（VIP=1.22）、香茅醇（VIP=1.22）、（E）-2-己烯醛（VIP=1.14）、氧化芳樟醇（VIP=1.14）、2-己醇（VIP=1.13）、2-戊基呋喃（VIP=1.11）、1-庚醇（VIP=1.09）、（E）-2-庚烯醛（VIP=1.08）、苯乙醛（VIP=1.04）、苯甲醇（VIP=1.04）、異丁醇（VIP=1.03）和2-呋喃甲醇（VIP=1.00），其種類和含量差異具有潛在鑒定蜂蜜種類、品質(zhì)的作用。

2.6 樣品聚類分析

圖9a 為最近鄰-歐氏距離圖，從圖中可以直觀看出江城野生大掛蜜（樣品1）和野生小掛蜜（樣品4）差異最大，可能的原因是蜜蜂種類、蜜源和地域具有差異，江城野生大掛蜜產(chǎn)地為云南省普洱江城縣樹，是大掛蜂和馬叉蜂采集橡膠花釀造而成，野生小掛蜜產(chǎn)地為普洱瀾滄縣，采花蜜蜂為小掛蜂和小蜂蜜，采花種類為山間百花。同時為了明確篩選出的20 種特征揮發(fā)性標(biāo)志物是否能區(qū)分6 種野生蜂蜜特征揮發(fā)性化合物，依據(jù)篩選出的20 種特征揮發(fā)性標(biāo)志物的峰強(qiáng)度值繪制熱圖（圖9b），結(jié)果表明聚類分析與歐式距離圖結(jié)果一致，篩選出的20 種特征揮發(fā)性標(biāo)志物能有效的將6 種野生蜂蜜區(qū)分開，可作為鑒別6 種蜂蜜的重要依據(jù)。

圖9 不同品種蜂蜜的最近鄰-歐氏距離圖（a）及聚類熱圖（b）Fig.9 Nearest-neighbour-Euclidean distance plots（a）and clustered heat maps（b）for different varieties of honey

3 結(jié)論

本研究采用GC-IMS 分析技術(shù)檢測了江城野生大掛蜜、野生黑蜜、野生崖蜜、野生小掛蜜、野生樹洞蜜和瀾滄野生大掛蜜6 種云南野生蜂蜜的揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)，共鑒定出65 種化合物，主要包括醛類、酸類、醇類，酯類等成分。通過構(gòu)建GC-IMS風(fēng)味指紋圖譜，明確了云南省6 種野生蜂蜜的特征風(fēng)味物質(zhì)。利用相關(guān)性、主成分分析、偏最小二乘判別處理，不同產(chǎn)地蜂蜜得到了較好的區(qū)分，篩選出的20 種特征揮發(fā)性標(biāo)志物，GC-IMS 分析技術(shù)可為蜂蜜揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)分析不同品種蜂蜜的風(fēng)味鑒別評價提供理論依據(jù)和技術(shù)支持，基于野生蜂蜜特征風(fēng)味成分研究也可為蜂蜜產(chǎn)品開發(fā)提供參考數(shù)據(jù)。