馬智勇，李美成，馬巍，王春強

（錦州醫(yī)科大學畜牧獸醫(yī)學院，遼寧錦州 121001）

0 引言

RNA-seq技術的產(chǎn)生和發(fā)展為生物信息學領域的研究帶來了新的契機，其可分別檢測有、無參考序列的轉錄組，進一步發(fā)現(xiàn)和尋找新的信息[1]，其產(chǎn)生的大量數(shù)據(jù)為可變剪接的研究帶來了新的思路和方法，被廣泛應用于功能基因的挖掘[2]。Gilbert[3]于1978 年首次發(fā)現(xiàn)基因的AS現(xiàn)象，是指真核生物轉錄過程中，基因的一個mRNA前體通過不同的剪接方式切除內含子，重新拼接外顯子產(chǎn)生成熟的mRNA 的過程。近年來的試驗研究結果陸續(xù)表明，可變剪接在許多物種的多個生物學過程中起著重要作用，如遺傳信息的穩(wěn)定性及翻譯效率[4]，動植物生長、發(fā)育、信號轉導以及生物和非生物脅迫的反應等方面[5-8]。

下丘腦-垂體-性腺(HPG)軸控制家禽的生殖活動，是調控家禽生殖發(fā)育的主要樞紐[9]。雛雞性成熟后進入產(chǎn)蛋期，而其性成熟的主要特征是生殖系統(tǒng)的發(fā)育成熟，即卵泡發(fā)育成熟，正常排卵，形成雞蛋排出體外。生殖激素在這個過程中發(fā)揮著重要作用，而調控生殖激素分泌的中心是HPG軸[10-11]。來自機體內外的影響因素會通過刺激HPO軸或者卵巢、卵泡等靶器官來調控雞的內分泌激素，從而調控雞的產(chǎn)蛋性能。

莊河大骨雞以體大、蛋優(yōu)、肉美而聞名，是中國遼寧省的地方蛋雞品種，是中國優(yōu)良的肉蛋兼用型地方品種雞[12]。然而，近年來，由于系統(tǒng)選育的缺乏導致其產(chǎn)蛋性能遺傳進展緩慢[13-14]，因此，提高產(chǎn)蛋率是繁育工作的重點之一。目前調節(jié)母雞產(chǎn)蛋機制的研究集中在卵巢中不同卵泡發(fā)育階段基因調控的變化[15]，對蛋雞的垂體和下丘腦的研究相對較少。因此，本研究基于RNA-seq 技術對高產(chǎn)和低產(chǎn)蛋雞下丘腦和垂體中的AS事件和新轉錄本的預測進行分析。旨在尋找參與調控母雞產(chǎn)蛋過程的新基因，為加快莊河大骨雞產(chǎn)蛋性能的遺傳進展提供新思路。

1 材料與方法

1.1 試驗動物及分組

試驗用6只母雞均采自于錦州醫(yī)科大學大骨雞試驗場，屠宰后取垂體和下丘腦組織迅速置于液氮中，并在-80℃下儲存?zhèn)溆?。根?jù)母雞在產(chǎn)蛋高峰期39～42周內產(chǎn)蛋的數(shù)量，將母雞分為高產(chǎn)組和低產(chǎn)組（L組3只和N組3只），L組和N組在此期間分別產(chǎn)蛋25個和14個，組內各只母雞產(chǎn)蛋數(shù)量相同。

1.2 RNA分離，文庫構建及測序

利用Trizol試劑從垂體和下丘腦組織樣品中提取總RNA。Nanodrop 2000 分光光度計（北京科譽興業(yè)科技發(fā)展有限公司）檢測RNA純度。通過Qubit 2.0精確定量RNA濃度，并通過Agilent2100生物分析儀（安捷倫科技中國有限公司生產(chǎn)2100 生物分析儀）評估RNA 完整性。 樣品經(jīng)過測試后，利用NEBNext?UltraTMRNA 文庫制備試劑盒，試劑盒由安捷倫科技有限公司提供制備文庫。于Agilent Bioanalyzer 2100 系統(tǒng)上評估文庫質量。文庫制備物在Illumina HiSeq 2500 平臺上測序，使用PE 150 配對末端測序策略。

1.3 數(shù)據(jù)分析

Fastq 軟件對原始數(shù)據(jù)進行質控和評估。該研究中雞參考基因組序列（90 版）由基因組網(wǎng)站下載(ftp://ftp.ensembl.org/pub/current_fasta/gallus_gallus/dna/Gallus_gallus.Gallus_gallus-5.0.dna.toplevel.fa.gz)。Hisat2v2.0.5構建參考基因組索引，將配對末端過濾后讀數(shù)與參考基因組比對?；谒袛?shù)據(jù)的基因組定位結果，利用Cufflinks軟件組裝轉錄物。

1.4 可變剪接事件分析

使用 rMATS(http://rnaseq- mats.sourceforge.net/index.html)軟件比較結果中每個樣本的AS 事件進行分類、數(shù)量統(tǒng)計以及對差異可變剪接事件進行分析。根據(jù)P值和錯誤發(fā)生率(False discovery rate，F(xiàn)DR)鑒定差異AS 事件。以FDR＜0.05 作為差異AS 事件的篩選標準。

1.5 差異剪接基因(DSG)的功能富集分析

應用DAVID 在線功能注釋軟件(http://david.ncifcrf.gov/summary.jsp)進行差異可變剪接基因的GO注釋和KEGG途徑的富集分析。

1.6 新轉錄本的預測和基因結構的優(yōu)化

使用rMATs 軟件分析樣品基因剪接與原有剪接模型之間的差異，對映射數(shù)據(jù)中的讀數(shù)進行新可變剪接事件預測。使用cufflinks 拼接得到的基因注釋文件，與原有基因注釋文件進行比較，找出原有注釋中未包含的基因并對基因的位置進行優(yōu)化，補充并修改原有注釋文件。

1.7 RT-PCR驗證雌激素受體1(ESR1)的AS事件

使用逆轉錄酶HIScript III RT 試劑盒(Vazyme Biotech Co.，Ltd)、oligo-dT 引物對總RNA 進行逆轉錄分析。使用DNAman 根據(jù)不同轉錄物的保守區(qū)域在單個反應中擴增出4 個剪接變體。用于RT-PCR 的ESR1的引物序列如下：正向 5'-TTGATGGTGCTTTGAG- 3' 和反向5'-GAATGCCAGGTTCTGT-3'，由北京華大基因生物公司完成引物合成。

2 結果

2.1 構建文庫的測序

為研究高產(chǎn)和低產(chǎn)蛋雞垂體和下丘腦中的AS 事件，本試驗對莊河大骨雞的垂體和下丘腦組織進行了RNA-seq 分析。構建了12 個cDNA 文庫，共產(chǎn)生約8.25 億原始讀數(shù)，經(jīng)質量控制后共有約7.99 億干凈讀數(shù)，用于后續(xù)分析檢測。85.57%～87.92%的序列被定位到參考基因組上。構建的12個文庫中，讀數(shù)映射到“+”鏈(41.09%～42.23%)和“-”鏈上(41.15%～42.32%)比例幾乎相等（表1），AT和GC曲線均基本重合，表明堿基組成平衡，測序正常。

表1 測序分析

2.2 AS及DSGs的檢測

6 個垂體組織文庫中，從8720 個基因中檢測到16458 AS 事件（平均每個基因可檢測到1.89 個AS 事件），差異AS事件總數(shù)為769，其中，上調差異AS事件為384，下調差異AS事件為385，可識別5種不同類型的AS事件，按發(fā)生頻率由高到低分別為：SE(83.87%)、MXE(8.90% )、RI(3.11% )、A3SS(2.41% )、A5SS(1.71%)?；騍LMAP（39AS 事件）、CIB1（28AS 事件）、NRCAM（24AS事件）產(chǎn)生AS事件頻率較高，且主要為SE和MXE類型。

6 個下丘腦組織文庫中，從9448 個基因中檢測到19021 AS 事件（平均每個基因可檢測到2.01 個AS 事件），差異AS事件總數(shù)為813，其中，上調差異AS事件為418，下調差異AS 事件為395，可識別5 種不同類型的AS事件，按發(fā)生頻率由高到低分別為：SE(83.77%)、MXE(10.06% )、RI(2.64% )、A3SS(2.07% )、A5SS(1.46%)?；騈RCAM（38AS 事件）、SLMAP（33AS 事件）、CIB1（28AS事件）產(chǎn)生AS事件頻率較高，主要類型同垂體文庫檢測結果（表2）。綜上，12 個組織文庫中，SE類型發(fā)生的比例均為最高，A5SS發(fā)生的比例均為最低；基因NRCAM、SLMAP、CIB1在兩類組織文庫中均發(fā)生較高頻率的AS事件。

表2 AS分類、數(shù)量及DSGs

以FDR＜0.05為標準對rMATS軟件分析結果進行差異篩選，垂體組織文庫中共篩選到644 個顯著的差異剪接基因，在SE、MXE、RI、A3SS、A5SS事件中鑒定到的差異剪接基因數(shù)分別為548、159、32、18、11；下丘腦組織文庫中共篩選到680 個顯著的差異剪接基因，在SE、MXE、RI、A3SS、A5SS 事件中鑒定到的差異剪接基因數(shù)分別為613、142、31、24、9；兩類文庫差異剪接基因中，SE 占比例均為最高，A5SS 占比例均為最低，趨勢同AS事件相似（表2、表3）。

表3 參與AS事件的基因（5例）

2.3 基因的功能注釋和富集分析

為進一步闡明DSGs的功能，本試驗進行了GO和KEGG 途徑富集分析，以注釋DSGs 并研究其分布。垂體組織文庫中，644 個DSGs 中的329 個基因得到功能注釋，基因富集在生物過程、細胞組分、分子功能的占比分別為27%、33%、40%（圖1A）。68%的DSG 同時富集于3 個功能分類。下丘腦組織文庫中，680 個DSGs中的337個基因得到功能注釋，基因富集在生物過程、細胞組分、分子功能的占比分別為26%、52%、22%（圖1B）。64%的DSG同時富集于3個功能分類。

圖1 GO分類

垂體組織文庫中，24 個DSGs 富集于3 個KEGG途徑，其中MAPK信號傳導途徑顯著富集(P＜0.05)，12個DSGs 參與MAPK 途徑。下丘腦組織文庫中，22 個DSGs富集于3個KEGG途徑，粘附連接途徑顯著富集(P＜0.05)，7個DSGs參與該途徑（表4）。

表4 KEGG途徑富集分析以注釋DSGs

2.4 新轉錄本預測和基因結構優(yōu)化

構建的12個文庫中共獲得6758個新轉錄本，長度分布于170～35112 bp之間。根據(jù)外顯子的預測結果，新轉錄本包含1～68個外顯子。部分新轉錄本的結構和功能預測見表5。構建的文庫中共12486個基因結構得到優(yōu)化，6230個基因的5’端發(fā)生延伸，6256個基因的3’端發(fā)生延伸，部分已注釋基因的優(yōu)化結果見表6。

表5 新轉錄本結構注釋結果（7例）

表6 已知基因結構優(yōu)化（10例）

2.5 ESR1基因的RT-PCR檢測

分析中發(fā)現(xiàn)雌激素受體基因ESR1具有較多的AS事件，產(chǎn)生4種類型AS（圖2）。RT-PCR結果發(fā)現(xiàn)存在3個不同長度的片段（分別為845、624、509 bp）（圖3），表明垂體中的ESR1確實存在于不同的AS事件中。

圖2 4種AS類型

圖3 ESR1基因的RT-PCR檢測

3 討論

本研究基于RNA-seq 技術，以雞基因組序列（版本90）作為參考基因組，構建了雞垂體和下丘腦文庫。檢測到5 種類型的AS 事件(SE、RI、A5SS、A3SS、MXE)，均為普遍認同的AS的5種基本形式。AS事件的類型在不同生物中發(fā)生情況各不相同：據(jù)報道，在哺乳動物特別是小鼠中，SE 是AS 事件的最常見類型[8,16]；但在植物研究中發(fā)現(xiàn)，RI 是水稻和竹子的主要AS 事件類型，分別占總數(shù)的47%和27.43%[13,17]；在對低等生物的研究中，已發(fā)現(xiàn)RI 是根瘤菌的主要AS 事件類型，占總數(shù)的84.3%[14]。本實驗對蛋雞的垂體和下丘腦的研究表明，SE占AS事件的比例最高，分別為83.87%和83.77%，A5SS 的比例最低，分別占AS 事件的1.71%和1.46%，與大多數(shù)哺乳動物相同。

家禽可以通過HPG 軸合成和釋放激素以調節(jié)繁殖活動。家禽中的HPG 軸與哺乳動物中的HPG 軸差異較大，表現(xiàn)出可塑性[18]。本研究中，低產(chǎn)蛋雞下丘腦中的22 個DSGs 被定位到粘連、緊密連接和鈣信號傳導途徑，26 個DSGs 參與了Ca2+結合或釋放通道活性的生物學過程。目前，普遍認為鈣信號傳導是促性腺激素釋放激素(GnRH)調節(jié)促性腺激素合成和釋放的主要機制。研究表明，下丘腦鈣離子信號傳導途徑異常會影響中樞神經(jīng)系統(tǒng)的發(fā)育，調節(jié)下丘腦進食神經(jīng)元的興奮性，從而影響動物的進食以減少能量的攝入，進而影響營養(yǎng)物質的吸收和運輸[15]。同時，大量研究證實，鈣離子在調節(jié)GnRH 快速分泌促性腺激素中起重要作用[19-20]。因此，我們推測下丘腦Ca2+相關通路異?？赡芙档偷孜锖铣尚剩绊懘傩韵偌に氐暮铣珊头置?。

本研究中，低產(chǎn)蛋雞垂體中的24 個DSGs 定位于心肌細胞中的MAPK信號通路、心肌收縮或腎上腺素能信號通路。研究表明，GnRH與GnRHR的結合可激活MAPK途徑，但機制尚不完全清楚，GnRHRs可能參與了許多蛋白質信號復合物的組裝[14]。在小鼠垂體細胞中，GnRHRs與ERK2共定位于脂筏[21]，ERK 的GnRH 活化也參與鈣離子募集過程，這可能部分解釋了GnRH在垂體中的作用機理。

下丘腦中合成的GnRH通過作用于垂體前葉以將其天然的高親和力跨膜受體GnRHR結合在細胞表面上，從而刺激促性腺激素的信號級聯(lián)[22]。迄今為止，已經(jīng)使用常規(guī)的生化和生物信息學工具鑒定了許多GnRH 和GnRHR基因[23-24]。已在哺乳動物中鑒定出GnRHR家族的3個成員[25]，但尚未對家禽中的GnRHR基因進行系統(tǒng)的研究。本研究中確定了垂體中5 個GnRHR的AS事件，其中4個為SE、1個為MXE。

在GO分析中，垂體的4個DSGs，即神經(jīng)生長因子(NGF)，視黃酸8(STRA8)，EPH 受體A5(EPHA5)和mutS 同系物4(MSH4)注釋為卵泡發(fā)育的生物學過程。神經(jīng)生長因子(NGF)AS 事件在低產(chǎn)和高產(chǎn)母雞垂體中有所不同。雖然關于NGF對雞垂體生殖功能的影響少有報道。但近年來，NGF在哺乳動物的非神經(jīng)系統(tǒng)中的作用已成為研究熱點。如，已經(jīng)在NGF敲除小鼠模型中系統(tǒng)地研究了NGF在卵泡形成和早期卵泡發(fā)育中的作用[26]。缺乏NGF基因的小鼠卵巢表現(xiàn)出嚴重的異型增生，卵母細胞不能被顆粒細胞包圍而形成卵泡結構。初級卵泡和次級卵泡的數(shù)量也顯著減少，表明NGF對于次級卵泡的形成至關重要[27]。NGF可以影響卵巢中某些基因的表達。NGF的丟失會導致FSHR基因在卵巢中的表達顯著降低。相反，當使用外源性NGF治療新生野生型小鼠卵巢時，F(xiàn)SHR的表達顯著增加[28]。需要進一步的研究來確定母雞垂體中NGF的不同AS事件是否以內分泌方式影響母雞卵泡的發(fā)育，并進一步影響產(chǎn)蛋過程。STRA8編碼視黃酸反應蛋白。小鼠中STRA8的同源蛋白已被證明參與精子發(fā)生和卵子發(fā)生中減數(shù)分裂起始的調控[29]。但小鼠和母雞STRA8蛋白之間的特異性差異表明，這些同源物在功能上并不相同。編碼STRA8的基因被認為在母雞產(chǎn)蛋過程中起作用。但有研究表明，EPHA5和MSH4參與卵巢卵泡顆粒細胞和卵泡內膜細胞的細胞增殖和分化以及激素的合成和分泌[27-30]。EPHA5和MSH4在垂體中的作用和調節(jié)機制尚未見報道。不同AS形式的具體功能需要進一步研究。

在垂體中發(fā)現(xiàn)了許多AS 事件，如據(jù)報道雌激素受體1(ESR1)在垂體中發(fā)揮作用。雌激素對于動物卵泡的發(fā)育至關重要，并且2 種雌激素受體具有獨立的功能[31]。雌激素受體(ERs)是配體激活的轉錄因子，當結合在細胞質中時，會轉移到細胞核，引起以ER為中心的信號傳導過程[32]。雌激素受體的2 種亞型ESR1和ESR2存在于垂體中，但受體敲除模型表明ESR1是雌激素負反饋調節(jié)的主要受體[33]。此外，雌激素可負面調節(jié)女性的垂體功能并調節(jié)其生殖活動[34]。此外，有研究發(fā)現(xiàn)ESR1基因多態(tài)性與中國大骨雞的產(chǎn)蛋特性密切相關[35]。解剖母雞后，發(fā)現(xiàn)蛋雞卵巢上的大卵泡數(shù)量明顯高于高產(chǎn)蛋雞組。由于ESR 表達是在雌激素刺激下發(fā)生的，因此我們推測排卵紊亂會導致大卵泡的持續(xù)存在，ESR1的不同亞型可能通過介導的負反饋調節(jié)垂體功能，進而影響母雞的產(chǎn)蛋性能。

4 結論

AS 事件類型在莊河大骨雞下丘腦和垂體中分布與大多數(shù)哺乳動物相同；低產(chǎn)蛋雞下丘腦和垂體中的DSGs 主要定位于鈣信號途徑和MAPK 途徑，參與促性腺激素的合成和分泌，但機制尚不清楚；垂體中的ESR1存在于不同的AS事件類型中。綜上，AS事件對母雞的產(chǎn)蛋數(shù)量起著至關重要的作用，為蛋雞產(chǎn)蛋性能的研究奠定一定的基礎。