吳姍娜,盧桂清

(廈門大學(xué)附屬第一醫(yī)院,福建 廈門 361000)

紫杉醇是從紅豆杉植物中提取出來的,屬于抗腫瘤藥物,在臨床得到廣泛應(yīng)用,用于治療非小細(xì)胞肺癌、子宮內(nèi)膜癌和膀胱癌等[1-2]。微管蛋白可以與紫杉醇結(jié)合,細(xì)胞在G2/M期能夠進(jìn)行有絲分裂阻滯,促使腫瘤細(xì)胞增殖受到抑制。紫杉醇無法與水相溶,臨床紫杉醇抑制劑包含多種類型。通過分析生物樣本中紫杉醇的含量,通常采用高效相色譜方法,但是分析靈敏度不高,不同生物樣品,特異性存在差異,消耗時(shí)間較長[3-4]。如今液相色譜技術(shù)發(fā)展迅猛,選擇性和靈敏度較高,成為檢測藥物中物質(zhì)的首選方案。

1 資料與方法

1.1 一般資料

選擇高效液相色譜儀、全自動進(jìn)樣器、高靈敏光纖型紫外檢測器(設(shè)備來源為Thermo Fisher Scientific公司),乙腈、紫杉醇對照品、無水乙醇(所選物質(zhì)來源為BASF公司,批號為31163947G0)、純化水系統(tǒng)、渦旋混合器、四級桿質(zhì)譜檢測器。

1.2 研究方法

1.2.1 配置儲備液

精密稱定10mg紫杉醇,甲醇溶解,定容到50mL,之后搖勻,得到紫杉醇標(biāo)準(zhǔn)儲備液,避光儲存,儲存溫度為4℃。吸取標(biāo)準(zhǔn)儲備液,采用濃度為50%的甲醇溶液,進(jìn)行稀釋處理,配置濃度范圍為0.05～20μg/m L,稀釋到0.1μg/mL、2.5μg/mL、20μg/mL,稀釋后的溶液為質(zhì)控點(diǎn)工作液。

1.2.2 配置內(nèi)標(biāo)溶液

稱取7.5mg炔諾酮,作為對照品,甲醇溶液,定容到25mL,得到濃度為300μg/mL的炔諾酮內(nèi)標(biāo)儲備液,避光儲存,放置在零下20℃。內(nèi)標(biāo)溶液為使用甲醇稀釋1000倍的炔諾酮內(nèi)標(biāo)儲備液(0.3μg/mL)。

1.2.3 配置緩沖液

稱取甲酸鹽(稱取量為1.26g),定容25mL,使用純水稀釋母液,稀釋倍數(shù)為1000倍,得到緩沖液,緩沖液濃度為0.2mmol/L。各儲備液,內(nèi)標(biāo)溶液與標(biāo)準(zhǔn)系列溶液以相同體積,應(yīng)用校正的容量瓶,與移液進(jìn)行配置,放置在冰箱內(nèi),進(jìn)行避光存儲,保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.4 色譜條件

色譜柱:流動相A為水,B為乙腈 梯度洗脫(5分鐘以內(nèi)濃度為40%,5～11分鐘濃度為40%～80%;10～11分鐘濃度為80%);檢測波長設(shè)置為227nm,柱溫設(shè)置為40℃,流速為每分鐘0.6mL。

1.2.5 系統(tǒng)適用性溶液

選取30mg紫杉醇對照品,測定精密,將其放置在25mL量瓶中,添加0.01mol/L氫氧化鉀甲醇溶液,溶液為1mL,搖動1分鐘后,使用濃度為0.1%的冰醋酸乙醇溶液進(jìn)行稀釋,搖勻處理。

1.2.6 系統(tǒng)適用性溶液

精密稱取三種雜質(zhì)對照品,使用乙醇溶液進(jìn)行稀釋,稀釋后的紫杉醇為0.5mg/mL,選擇適量雜質(zhì),雜質(zhì)1、雜質(zhì)2各為 2.5 μg/mL,雜質(zhì)3為 25μg/mL的溶液。選取無水甲醇溶液和聚氧乙烯35蓖麻油適量,精密稱取25mg紫杉醇作為對照品,放置在20mL量瓶中,使用甲醇溶液進(jìn)行稀釋,搖勻處理,稱量1mL上述溶液,放置在100mL量瓶中,搖勻處理。

1.2.7 測定色譜條件

強(qiáng)制降解試驗(yàn)法,選取紫杉醇注射液,進(jìn)行酸、高溫、堿降解,制成0.5 mg/mL 的溶液,分別進(jìn)樣。(1)酸破壞試驗(yàn),添加1.0 mol/L的鹽酸,鹽酸含量2mL,放置在溫度25℃環(huán)境中,放置時(shí)間為2小時(shí),之后加入1.0mol/L的氫氧化鈉2mL中和,使用甲醇定容,搖勻處理。

1.3 觀察指標(biāo)

(1)強(qiáng)制降解試驗(yàn);(2)分析準(zhǔn)確度考核結(jié)果;(3)線性分析。

2 結(jié)果

2.1 強(qiáng)制降解試驗(yàn)

紫杉醇具有不穩(wěn)定性,在各種降解條件下,實(shí)施降解處理,測定降解雜質(zhì)不干擾目標(biāo),在光照條件下,以及堿條件下,會增加雜質(zhì)數(shù)量和雜質(zhì)質(zhì)量,在酸、光照與堿條件下,原料峰值面積會降低90%左右,不同雜質(zhì)峰之間分離良好。

2.2 分析準(zhǔn)確度考核結(jié)果

原有量為1.5μg/mL,加入量為0.49μg/mL,則測得量為1.99μg/mL,回收率為99.3%,標(biāo)準(zhǔn)偏差為2.95%。原有量為0.98μg/mL,測得量為2.46μg/mL,回收率為99.3%,標(biāo)準(zhǔn)偏差為2.38%。原有量為1.5μg/mL,加入量為1.45μg/mL,測得量為2.94μg/mL,回收率為99.6%,標(biāo)準(zhǔn)偏差為1.5%。

2.3 線性

波長為225nm,標(biāo)準(zhǔn)偏差為0.89%,雜質(zhì)個(gè)數(shù)為5個(gè);溫度為38℃,標(biāo)準(zhǔn)偏差為0.89%,雜質(zhì)個(gè)數(shù)為5個(gè);流速為0.54ml/min,標(biāo)準(zhǔn)偏差為2.49%,雜質(zhì)個(gè)數(shù)為5個(gè);色譜柱為1個(gè),標(biāo)準(zhǔn)偏差為1.79%,雜質(zhì)個(gè)數(shù)為5個(gè)。

3 討論

應(yīng)用超高液相色譜儀,對色譜條件進(jìn)行優(yōu)化,促使檢測時(shí)間縮短[5-6]。由于紫杉醇水溶性較弱,如果使用傳統(tǒng)紫杉醇注射液,需要將無水甲醇與聚陽已烯麻油相互混合作為增溶劑[7-8]。在紫杉醇外吸收波長,可以觀察到輔助色譜峰。文章設(shè)置空白對照溶液,促使機(jī)械和輔料的干擾峰得以排除。

進(jìn)樣體積需要得到優(yōu)化,為促使要點(diǎn)方法的延續(xù)性得到保障。文章所選供試品及對照品的溶液,具有相同濃度,色譜柱體積與進(jìn)樣體積之間呈現(xiàn)正比例特點(diǎn),最后能夠計(jì)算出進(jìn)樣體積。在實(shí)驗(yàn)過程中,可以將進(jìn)樣體積設(shè)置為1,促使有關(guān)物質(zhì)的檢出率得到保證。

優(yōu)化梯度洗脫程序,為促使梯度變化不會對分離效果產(chǎn)生影響,需要保持不同規(guī)格色譜柱的洗脫體積倍數(shù)相同。在藥典方法中,有機(jī)相比例在20分鐘以內(nèi),從40%逐漸上升到80%。時(shí)間為25分鐘,計(jì)算出梯度段時(shí)間為5分鐘。預(yù)估其他梯度洗滌時(shí)間,可以促使結(jié)果進(jìn)一步優(yōu)化。

分析不同流速、不同柱溫,對紫杉醇以及各雜質(zhì)的分離情況,結(jié)果發(fā)現(xiàn),在各種分離條件均滿足情形下,選擇為每分鐘0.6mL的速度?？梢源偈挂筮_(dá)到滿足,分析時(shí)間減少,柱溫40℃時(shí),紫杉醇能夠與雜質(zhì)相互分離。

細(xì)致優(yōu)化色譜和質(zhì)譜條件,包括評估與流動相添加劑相關(guān)的加合物離子的情況。通過采用氣相色譜方式,通過分析紫杉醇在含不同添加劑的溶液或流動相中規(guī)律,采用上述方式,對溶液中添加劑種類、濃度等條件作出締選的結(jié)果高度一致。說明在建立紫杉醇定量方法時(shí),采用高效液氣相色譜是一種可行的優(yōu)化方案[9-10]。上述方式具有經(jīng)濟(jì)環(huán)保、高效特點(diǎn),是分析紫杉醇的重要方法,具有可靠性和有效性。通過分析紫杉醇裂解規(guī)律,發(fā)現(xiàn)紫杉醇質(zhì)譜特點(diǎn),說明紫杉醇特征性碎片例子。通過采用分離鑒定方式,鑒定紫杉醇在人體中的代謝物,推測出代謝物的代謝途徑與產(chǎn)物。紫杉醇裂解期間,主要核心內(nèi)容為脫水和酷鍵斷裂,其中碎片離子數(shù)量較多,同時(shí)穩(wěn)定性較好[11-12]。紫杉醇包含3個(gè)代謝物,主要代謝物為6α-羥基。通過分析紫杉醇代謝物質(zhì)譜行為,通過定量分析,或者質(zhì)譜定性分析方式,能夠提供良好參考。本次研究所用方案,生物品檢測與高通量要求需要得到滿足,在注射階段,使用紫杉醇聚合物膠束,檢測結(jié)果更加良好。

綜上所述,文章結(jié)果發(fā)現(xiàn)高效液相色譜法測定紫杉醇注射液相關(guān)物質(zhì)含量具有良好耐用性和靈敏度,為注射紫杉醇制劑的有關(guān)物質(zhì)檢測提供良好方法。