鄭海燕，武燕紅，張欣，吳雪溶，呂偉，張海平，王震，沈靜，高敏

(烏海市婦幼保健院檢驗(yàn)科中心實(shí)驗(yàn)室,烏海 016000)

1866年,英國(guó)醫(yī)生John Langdon Down第一次對(duì)唐氏綜合征(Down’s syndrome)進(jìn)行了描述,即21-三體綜合征[1]。新生兒21-三體綜合征發(fā)病率為1/800～1/600,且隨著孕婦年齡的增長(zhǎng)有顯著上升的趨勢(shì)?；純和ǔ４嬖趯W(xué)習(xí)障礙、智能障礙或伴有臟器畸形等問(wèn)題[2]。18-三體綜合征(愛德華氏綜合征)是僅次于21-三體綜合征的第二種常見染色體三體異常,新生兒中發(fā)病率為1/8 000～1/3 500,主要表現(xiàn)為發(fā)育遲緩、智能障礙和嚴(yán)重先心病等多發(fā)畸形,患兒多于出生后數(shù)周死亡。13三體綜合征(Patau綜合征),新生兒中發(fā)病率約為1/25 000[2],患兒有嚴(yán)重的智力發(fā)育障礙、嚴(yán)重先心病、全前腦畸形、多指(趾)、嚴(yán)重唇腭裂、多囊肝及多囊腎等異常,存活較久的患兒還有癲癇樣發(fā)作、肌張力低下等。在這類遺傳病中,胎兒期常有流產(chǎn)、畸胎、死胎等,患兒可表現(xiàn)為先天生長(zhǎng)發(fā)育遲緩、智力低下,伴有四肢、五官、內(nèi)臟等畸形。這三種綜合征尚無(wú)有效的治療方法,目前有效的預(yù)防措施就是廣泛開展產(chǎn)前篩查與診斷,同時(shí)也是防止染色體非整倍體胎兒出生的重要手段。

1997年,盧煜明教授在懷有男胎的孕婦血漿中分離并檢出胎兒游離DNA(cell-free fetal DNA,cffDNA)片段[3],從而為無(wú)創(chuàng)產(chǎn)前檢測(cè)(NIPT)提供了理論可能。目前,cffDNA的染色體非整倍體NIPT在臨床上得到廣泛應(yīng)用。本研究擬選取來(lái)自烏海市婦幼保健院接受產(chǎn)前檢查的7 478例孕婦的樣本,進(jìn)行大規(guī)模的平行測(cè)序技術(shù)檢測(cè),通過(guò)生物信息學(xué)分析來(lái)判斷胎兒患有21-三體、18-三體和13-三體的可能性,對(duì)結(jié)果為高風(fēng)險(xiǎn)的孕婦,進(jìn)行羊膜腔穿刺液熒光原位雜交(FISH)檢測(cè)和胎兒染色體核型分析,探討NIPT在常見產(chǎn)前染色體非整倍體疾病診斷中的重要臨床價(jià)值。

資料與方法

一、研究對(duì)象

選擇2015年6月至2023年1月于烏海市婦幼保健院遺傳與咨詢門診就診的7 478例孕婦為研究對(duì)象。納入標(biāo)準(zhǔn):(1)孕周在 12+6和22+6之間;(2)單胎或雙胎妊娠;(3)血清學(xué)唐氏篩查結(jié)果為高風(fēng)險(xiǎn)或臨界風(fēng)險(xiǎn);(4)產(chǎn)前B超提示胎兒異常;(5)孕婦主動(dòng)要求NIPT。排除標(biāo)準(zhǔn):(1)曾有染色體異常分娩史;(2)孕婦一年內(nèi)接受過(guò)異體輸血;(3)孕婦一年內(nèi)接受過(guò)移植手術(shù);(4)孕婦接受過(guò)細(xì)胞治療或接受過(guò)免疫治療等可能對(duì)高通量測(cè)序結(jié)果造成干擾的高風(fēng)險(xiǎn)人群。

研究對(duì)象均行NIPT檢測(cè)且在知情同意書上簽字。本研究經(jīng)過(guò)本院倫理委員會(huì)審批通過(guò)(LI202309)。

二、檢測(cè)方法

1.主要試劑和儀器:胎兒染色體非整倍體21-三體、18-三體和13-三體檢測(cè)試劑盒(半導(dǎo)體測(cè)序法)、DA8600高通量測(cè)序儀(廣州達(dá)瑞);染色體核型分析的培養(yǎng)基(廣州白云山);產(chǎn)前熒光原位雜交檢測(cè)試劑盒(北京金菩嘉);ThermoBrite雜交儀(賽默飛,美國(guó));奧林巴斯熒光顯微鏡(Olympus,日本);全自動(dòng)染色體顯微圖像掃描系統(tǒng)(上海北昂)。

2.NIPT檢測(cè):采用EDTA抗凝管采集孕婦靜脈血2管,各5 ml,4℃可保存8 h。血漿分離,2 981 rpm,4℃ 離心10 min;分離后的血漿于12 900 rpm,4℃離心10 min。采用磁珠法提取孕婦血漿中的游離DNA,文庫(kù)構(gòu)建、PCR擴(kuò)增、上機(jī)測(cè)序、通過(guò)DA8600 proton平臺(tái)進(jìn)行生物信息分析,得到Z值。

3.結(jié)果判讀:Z值公式如下:

chri:待檢測(cè)樣本的i號(hào)染色體;mean%chrireference:參考數(shù)據(jù)庫(kù)中i染色體占常染色體比例的平均值;%chrisample:待測(cè)樣本i號(hào)染色體占常染色體的比例;S.D.%chrireference:參考數(shù)據(jù)庫(kù)中i染色體占比的標(biāo)準(zhǔn)方差。NIPT高風(fēng)險(xiǎn)判定:正常孕婦的Z值介于(-3,+3)之間,Z值≥3的樣本判定為染色體異常高風(fēng)險(xiǎn)。

4.分組:對(duì)NIPT高風(fēng)險(xiǎn)的Z值進(jìn)行適當(dāng)分類及劃分,探討21-三體、18-三體、13-三體在不同區(qū)間內(nèi)的假陽(yáng)性與Z值的關(guān)系,把高風(fēng)險(xiǎn)例數(shù)的Z值按大小分為四組:A組(3≤Z≤5)、B組(512)進(jìn)行假陽(yáng)性率比較。

5.FISH和羊水細(xì)胞染色體核型分析:對(duì)于NIPT檢測(cè)提示胎兒存在21-三體、18-三體、13-三體及性染色體異常高風(fēng)險(xiǎn)的孕婦,進(jìn)行羊水穿刺。取羊水25 ml,7 ml用于FISH檢測(cè),離心去上清,膠原酶B消化25 min、氯化鉀低滲25 min,固定、滴片、烤片、胃蛋白酶消化9 min,脫水、雜交、玻片洗滌、暗視野觀察玻片。剩余18 ml平均接種在兩個(gè)培養(yǎng)瓶中,于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)7 d,先換液、再轉(zhuǎn)種,約10 d左右根據(jù)細(xì)胞生長(zhǎng)情況收取細(xì)胞。用秋水仙素終止羊水細(xì)胞生長(zhǎng),刮取培養(yǎng)瓶壁上細(xì)胞,氯化鉀低滲18 min、預(yù)固定、第一次固定、第二次固定、滴片、烤片、胰酶消化及 Giemsa 染色制備羊水染色體片,儀器掃片。每個(gè)標(biāo)本至少計(jì)數(shù)20個(gè)分裂相,分析5個(gè)完整核型。

三、隨訪

跟蹤孕婦的妊娠結(jié)局,進(jìn)行產(chǎn)前產(chǎn)后隨訪,通過(guò)隨訪判斷有無(wú)其他異常情況、假陽(yáng)性或假陰性的情況出現(xiàn),以分娩后無(wú)異常為陰性。

四、統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

本研究中的計(jì)數(shù)資料采用百分率(%)表示,僅進(jìn)行描述性統(tǒng)計(jì)分析。

結(jié) 果

一、NIPT檢測(cè)、FISH及細(xì)胞染色體核型分析結(jié)果

本研究共納入研究對(duì)象7 478例。NIPT檢測(cè)為染色體異常的有62例,檢出率0.83%(62/7 478),其中21-三體高風(fēng)險(xiǎn)44例(70.9%)、18-三體高風(fēng)險(xiǎn)12例(19.4%)、13-三體高風(fēng)險(xiǎn)5例(8.1%)、性染色體異常 1例(1.6%)。62例高風(fēng)險(xiǎn)孕婦中有54例自愿接受羊水穿刺,50例在我院經(jīng)FISH技術(shù)及染色體核型分析,其中40例得到確診(21-三體29例、18-三體9例,13-三體1例、X-三體1例);有4例在外院進(jìn)行了羊水穿刺,其中3例為21-三體、1例正常。其余8例高風(fēng)險(xiǎn)孕婦拒絕羊水穿刺,后期追蹤隨訪得知:5例直接引產(chǎn),經(jīng)胎盤驗(yàn)證,4例為21-三體,1例為13-三體;1例個(gè)人原因產(chǎn)下一21-三體患兒;1例雙胎,其中一個(gè)胎死宮內(nèi)診斷為21-三體,另一個(gè)34周剖宮產(chǎn)為正常嬰兒;1例18-三體高風(fēng)險(xiǎn)產(chǎn)下正常胎兒。經(jīng)計(jì)算,NIPT對(duì)21-三體、18-三體和13-三體陽(yáng)性預(yù)測(cè)值(PPV)分別為86.4%(38/44)、75.0%(9/12)、40.0%(2/5);NIPT與FISH及染色體核型結(jié)果分析顯示,符合率21-三體、18-三體和13-三體分別為82.8%(29/35)、81.8%(9/11)和33.3%(1/3)(表1)。

表1 NIPT與FISH及染色體核型結(jié)果分析(%)

二、根據(jù)不同Z值篩查三種遺傳疾病的假陽(yáng)性率比較

排除掉1例性染色體異常,將其余61例高風(fēng)險(xiǎn)按Z值大小分為四組進(jìn)行分析,結(jié)果分布情況見表2。A組13例,假陽(yáng)性9例,假陽(yáng)性率為69.2%;B組14例,假陽(yáng)性2例,假陽(yáng)性率為14.3%;C組19例,假陽(yáng)性1例,假陽(yáng)性率為5.3%;D組15例,假陽(yáng)性為0。假陽(yáng)性主要集中在3≤Z≤5,Z值越高假陽(yáng)性率越低(表2)。

表2 NIPT篩查胎兒染色體非整倍體的檢測(cè)結(jié)果不同Z值分布情況比較(%)

三、NIPT 陽(yáng)性結(jié)果篩查效率

FISH及細(xì)胞染色體核型分析異常與 NIPT 陽(yáng)性結(jié)果篩查效率分析結(jié)果顯示,NIPT診斷胎兒染色體非整倍體疾病的敏感度為100.00%(50/50),總特異性為 99.84%(7 416/7 428),總假陽(yáng)性率為0.16%(12/7 428),假陰性率為 0(表3)。

表3 NIPT 陽(yáng)性結(jié)果篩查效率分析(%)

討 論

傳統(tǒng)的染色體非整倍體篩查手段是妊娠早期前3個(gè)月母體血清生化標(biāo)志物妊娠相關(guān)蛋(PAPP-A)和人絨毛膜促性腺激素(β-HCG)檢測(cè),結(jié)合頸項(xiàng)透明層厚度(NT)超聲檢測(cè);也有在妊娠中期進(jìn)行甲胎蛋白(AFP)、游離雌三醇(uE3)和β-HCG二聯(lián)或三聯(lián)檢測(cè)并結(jié)合NT超聲檢測(cè)進(jìn)行篩查。篩查結(jié)果風(fēng)險(xiǎn)高的孕婦,需進(jìn)行胎兒細(xì)胞染色體核型分析,有羊水細(xì)胞培養(yǎng)和絨毛細(xì)胞培養(yǎng)兩種方法,分別通過(guò)羊膜穿刺和絨毛膜取樣進(jìn)行。但是目前的篩查手段僅能檢出50%～95%的異常,漏檢率很高,而且假陽(yáng)性率高達(dá)5%。21-三體的陽(yáng)性預(yù)測(cè)值僅為3.4%[4-5],即1 000個(gè)篩查陽(yáng)性結(jié)果中只有34個(gè)為真陽(yáng)性,導(dǎo)致本不必要接受羊水穿刺的孕婦數(shù)量大大增加,不但有流產(chǎn)的風(fēng)險(xiǎn)(1%～2%)[6],而且還給孕婦帶來(lái)了嚴(yán)重的焦慮,可能導(dǎo)致后代神經(jīng)發(fā)育和精神異常[7]。NIPT對(duì)胎兒染色體非整倍體的篩查具有較高的準(zhǔn)確性、檢出率以及較低的假陰性率和假陽(yáng)性率[8-9],通過(guò)對(duì)母血中cffDNA進(jìn)行基因檢測(cè),提高胎兒的早期診斷有效性,減少風(fēng)險(xiǎn)事件的發(fā)生,最大程度上了解胎兒的生長(zhǎng)情況,為后續(xù)的治療和生產(chǎn)提供相應(yīng)的參考依據(jù)[10]。

本研究7 478例孕婦標(biāo)本中NIPT檢出染色體非整倍體異常高風(fēng)險(xiǎn)62例,其中21-三體44例,18-三體12例,13-三體5例,X-三體1例,陽(yáng)性檢出率為0.83%(62/7 478),國(guó)內(nèi)類似報(bào)道中染色體非整倍體的陽(yáng)性率分別為0.82%、0.98%、1.11%和1.05%[11-14]。把NIPT高風(fēng)險(xiǎn)與羊膜腔穿刺液FISH檢測(cè)及細(xì)胞染色體核型分析以及后續(xù)的追蹤隨訪作為金標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行比較,PPV分別為21-三體86.4%(38/44)、18-三體75.0%(9/12)、13-三體40.0%(2/5),性染色體異常樣本量少不作為研究。朱賽娟等[15]的研究中,這三種異常的PPV分別為81.6%、68.2%和8.1%,略低于本研究。本研究主要以21-三體和18-三體檢出為主,13號(hào)染色體PPV較低,說(shuō)明NIPT技術(shù)可快速準(zhǔn)確地檢測(cè)胎兒21號(hào)染色體和18號(hào)染色體的非整倍性,雖然NIPT不是診斷試驗(yàn),但是與標(biāo)準(zhǔn)篩查相比,敏感性、特異性、陽(yáng)性預(yù)測(cè)值和陰性預(yù)測(cè)值等診斷指標(biāo)更為理想,大大減少了很多不必要的介入性檢查;并且假陰性率低,具有很好的臨床應(yīng)用價(jià)值。NIPT雖然是一種優(yōu)于常規(guī)血清學(xué)檢測(cè)的無(wú)創(chuàng)產(chǎn)前診斷手段,檢測(cè)敏感性較好,但特異性受限導(dǎo)致NIPT不能徹底取代介入性產(chǎn)前FISH、染色體核型分析、基因芯片等產(chǎn)前診斷方法。

NIPT是利用孕婦外周血cffDNA,結(jié)合高通量測(cè)序技術(shù)和生物信息學(xué)方法,準(zhǔn)確判斷胎兒是否患三大染色體疾病的檢測(cè)技術(shù)。孕婦在妊娠期間,血漿中胎兒游離DNA(cffDNA)大部分源于母體自身細(xì)胞凋亡和胎盤絨毛膜滋養(yǎng)層細(xì)胞脫落降解釋放的cffDNA,通常認(rèn)為這部分cffDNA 能較準(zhǔn)確地體現(xiàn)胎兒的遺傳物質(zhì)。NIPT與胎兒的直接檢測(cè)不同,其可能會(huì)出現(xiàn)假陽(yáng)性或假陰性等問(wèn)題。本研究經(jīng)FISH和核型分析驗(yàn)證檢出11例假陽(yáng)性,假陽(yáng)性率為0.16%(12/7 478),這可能與染色體拷貝數(shù)變異、限制性胎盤嵌合、母體嵌合等生物因素有關(guān),具體原因需進(jìn)一步研究。無(wú)創(chuàng)產(chǎn)前檢測(cè)對(duì)染色體非整倍體的結(jié)果判定主要依賴于Z值,NIPT提示低風(fēng)險(xiǎn)的Z值參考范圍為(-3,+3),當(dāng)Z參考范圍<-3或>3時(shí)即判定為染色體為非整倍體,此時(shí)NIPT報(bào)告提示為高風(fēng)險(xiǎn),建議孕婦進(jìn)行遺傳咨詢并行產(chǎn)前診斷。本研究通過(guò)把NIPT高風(fēng)險(xiǎn)的Z值分為四組來(lái)探討Z值的范圍和假陽(yáng)性率的關(guān)系,結(jié)果顯示Z值在3～5時(shí)假陽(yáng)性率高,并且隨著Z值的增高假陽(yáng)性率逐漸減小,顯示Z值大小與PPV呈正相關(guān),與既往研究相符[16-20]。對(duì)NIPT高風(fēng)險(xiǎn)的Z值進(jìn)行適當(dāng)分類及劃分能進(jìn)一步提高21-三體、18-三體、13-三體在不同區(qū)間內(nèi)的真陽(yáng)性數(shù),同時(shí)更利于指導(dǎo)臨床醫(yī)師對(duì)高風(fēng)險(xiǎn)孕婦進(jìn)行遺傳咨詢[18],探究NIPT高風(fēng)險(xiǎn)中Z值與真假陽(yáng)性分布的相關(guān)性,提升NIPT高風(fēng)險(xiǎn)孕婦Z值在3～12之間時(shí)進(jìn)行產(chǎn)前診斷的依從性,減少因過(guò)于信賴NIPT提示高風(fēng)險(xiǎn)而放棄產(chǎn)前診斷進(jìn)而選擇直接引產(chǎn)的孕婦人數(shù)。結(jié)合Z值和不同風(fēng)險(xiǎn)因素可對(duì)NIPT檢測(cè)高風(fēng)險(xiǎn)人群提供更準(zhǔn)確的遺傳咨詢。

綜上所述,NIPT 檢測(cè)對(duì)一些非整倍體染色體異常如唐氏綜合征以及愛德華氏增多有較高檢出率,但是NIPT還具有較低的假陽(yáng)性率,不能完全取代有創(chuàng)產(chǎn)前診斷。本研究NIPT 胎兒染色體非整倍體疾病的陽(yáng)性檢出率為0.83%,主要以21-三體和18-三體檢出為主。篩查結(jié)果為陽(yáng)性或高風(fēng)險(xiǎn)時(shí),孕婦通常對(duì)檢測(cè)結(jié)果表現(xiàn)出焦慮和難以接受,應(yīng)在對(duì)結(jié)果進(jìn)行解釋后,給予孕婦一定的時(shí)間考慮再做決定。在對(duì)結(jié)果解釋時(shí),應(yīng)告知孕婦陽(yáng)性預(yù)測(cè)值,并對(duì)造成假陽(yáng)性的原因進(jìn)行說(shuō)明。由于在檢測(cè)前遺傳咨詢時(shí)對(duì)敏感度、特異性進(jìn)行了介紹,再加上某些宣傳會(huì)造成孕婦認(rèn)為NIPT結(jié)果的準(zhǔn)確性很高,因此需要對(duì)孕婦認(rèn)真解釋準(zhǔn)確性高和陽(yáng)性預(yù)測(cè)值的區(qū)別。某些情況下,孕婦會(huì)希望直接終止妊娠,這時(shí)應(yīng)強(qiáng)調(diào)接受產(chǎn)前診斷的重要性,確認(rèn)孕婦在已經(jīng)充分理解假陽(yáng)性結(jié)果的情況下做出這一決定。當(dāng)NIPT檢測(cè)結(jié)果為3≤Z≤5時(shí),應(yīng)該引起實(shí)驗(yàn)室人員和臨床醫(yī)生的重視,存在假陽(yáng)性概率比較大,建議孕婦進(jìn)一步做介入性產(chǎn)前診斷。