施文正，陳 晴，馮 倩，姜 昕，陸佳怡

（1.上海海洋大學食品學院，上海 201306；2.國家淡水水產(chǎn)品加工技術(shù)研發(fā)分中心（上海），上海 201306）

鮐（Scomber japonicus），鱸形目鯖科鮐屬，是海洋中上層魚類[1]，屬于紅肉魚類，富含蛋白質(zhì)、脂肪、多種礦物質(zhì)（鈣、磷、鐵）、核黃素等[2]。目前，中國鮐魚的消費依舊以直接銷售為主，但鮐魚體內(nèi)含有大量的組氨酸，極易被酶催化為組胺，引起中毒。因此，鮐魚產(chǎn)業(yè)需加強精深加工制品的開發(fā)，提高魚肉保藏期，促進魚肉制品的多樣化。魚松是以魚為原料，經(jīng)預處理、蒸、炒松等工序加工而成的一種精深加工魚制品[3]，是一種傳統(tǒng)休閑食品，其營養(yǎng)豐富、風味獨特、口感怡人，深受中國和東南亞消費者的喜愛。目前，對于魚松的研究多關(guān)注其生產(chǎn)工藝的優(yōu)化，但對魚松在人體內(nèi)消化吸收等方面的研究較少。

糖基化作用主要基于美拉德反應(yīng)，利用蛋白質(zhì)和糖反應(yīng)生成糖蛋白[4]。目前，有關(guān)美拉德反應(yīng)中蛋白的消化率不盡一致。MAJID 等[5]用乳果糖糖基化修飾乳清分離蛋白發(fā)現(xiàn)，糖基化后的接枝產(chǎn)物胃消化率更高，在模擬胃液中被全部水解。而趙謀明等[6]研究添加葡萄糖對花生分離蛋白體外消化的影響時，發(fā)現(xiàn)發(fā)生美拉德反應(yīng)的糖蛋白胃蛋白消化率提高，而胃蛋白酶-胰酶體外消化率降低。魚松制作過程中，糖是必要的輔料，添加糖的質(zhì)量分數(shù)一般為4%～12%，加工過程中糖與蛋白質(zhì)的美拉德反應(yīng)對魚松產(chǎn)品風味、色澤等品質(zhì)的形成有重要影響，但是關(guān)于美拉德反應(yīng)對魚松消化的影響研究較少。

本研究以添加不同糖進行美拉德反應(yīng)的鮐魚魚松為研究對象，通過體外模擬消化，測定魚松的蛋白消化率以及消化產(chǎn)物的抗氧化性和氨基酸組成，探究魚松對人體的營養(yǎng)價值，為開發(fā)營養(yǎng)性、功能性魚松提供理論參數(shù)。

1 材料和方法

1.1 材料和試劑

鮐魚體長（25.0±2.0）cm，購自上海市浦東新區(qū)臨港新城農(nóng)工商超市，于-20 ℃凍藏，隨機選取20尾用于實驗。碳酸氫鈉、六水合氯化鎂、碳酸銨、氯化鈣、體積分數(shù)30%過氧化氫、鐵氰化鉀、三氯化鐵、乙二胺四乙酸二鈉、硫酸亞鐵、檸檬酸鈉、磺基水楊酸、胃蛋白酶（2 000 U）、豬胰酶（1∶250）購于國藥集團化學試劑有限公司；二苯基苦基苯肼（DPPH）購于上海安譜有限公司。

1.2 主要儀器和設(shè)備

馬爾文激光粒度儀3000，美國馬爾文儀器有限公司；ELx800酶標儀，美國Biotek公司；L-8800全自動氨基酸分析儀，日本Hitachi 公司。FiveEasy Plus pH 計，METTLER TOLEDO 儀器有限公司；Mini-PROTEAN Tetra Cell電泳槽，美國伯樂公司。

1.3 方法

1.3.1 魚松樣品制備 根據(jù)Chen 等[3]的方法，以鮐魚為原料制作魚松。冷凍鮐魚用流水解凍，去頭、尾、內(nèi)臟，切成寬2.5 cm 魚塊；將鮐魚塊于60 g/L NaCl 中浸泡15 min，用流水清洗（全程控制在10 ℃以下）；將魚塊放入15 g/Lβ-環(huán)狀糊精溶液中，70 ℃下浸泡10 min，腌制后的魚肉經(jīng)100 ℃蒸制20 min，去魚皮、紅肉和魚刺，用絞肉機低速搓開，用電磁爐炒制。炒制過程中分別添加質(zhì)量分數(shù)9.0%的蔗糖（Suc）、葡萄糖（Glu）、木糖（Xyl）、果糖（Fru）和半乳糖（Gal），炒制45 min，魚肉呈較細纖維狀。以不加糖魚松（Non）作為對照組，共重復3個批次。

1.3.2 體外模擬消化 按INFOGEST 體外模擬消化系統(tǒng)[7]對魚松進行消化，并制備唾液模擬液（SSF）、胃液模擬液（SGF）和腸液模擬液（SIF）。

提前預熱SSF、SGF、SIF 緩沖溶液至37 ℃。魚松、SSF按質(zhì)量（g）體積（mL）比1∶3混勻，在37 ℃搖床條件下反應(yīng)2 min。將口腔反應(yīng)物與SGF 以體積比1∶1混合，用6 mol/L HCl調(diào)pH至2.0。置于37 ℃搖床反應(yīng)2 h。用3 mol/L NaOH 調(diào)pH 至7.0，終止反應(yīng)。將胃反應(yīng)物與SIF 以體積比1∶1 混合，用1 mol/L NaOH 調(diào)pH 至7.5，置37 ℃搖床反應(yīng)2 h。消化結(jié)束后在100 ℃沸水中加熱10 min。

1.3.3 消化率的測定 將胃蛋白酶和胰蛋白酶水解產(chǎn)物離心（12 000 r/min，20 min），取沉淀在105 ℃下烘干至恒重，記錄烘干樣品質(zhì)量。消化率（%）計算：

其中：m0，消化前魚松質(zhì)量；m1，烘干后沉淀的質(zhì)量；w，魚松的水分質(zhì)量分數(shù)。

1.3.4 消化產(chǎn)物粒徑的測定 參考張澤等[8]方法，取

1.3.2 胃蛋白酶消化液、胃蛋白酶和胰蛋白酶消化液，采用激光粒度儀測定粒度，D10、D50和D90分別表示微粒的積聚體積占顆?？傮w積的10%、50%和90%時的粒徑。

1.3.5 十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDSPAGE）分析 將消化產(chǎn)物與2×上樣緩沖液按照體積比1∶1混合，進行SDS-PAGE凝膠電泳分析。

1.3.6 抗氧化性的測定

1.3.6.1 DPPH 自由基清除測定 參考王樂等[9]的方法，分別將模擬胃、腸消化后所提取的不同糖魚松消化產(chǎn)物配制成質(zhì)量濃度分別為1、2、3、4、5 mg/mL的多肽液。取不同質(zhì)量濃度的多肽液與0.2 mmol/L DPPH 自由基溶液按體積比1∶1 混勻，避光反應(yīng)30 min，在517 nm 處測光密度（D）。DPPH 自由基清除率（%）計算：

式中，D樣品，樣品組光密度值；D對照，用去離子水代替樣品的光密度值；D空白，用體積分數(shù)95%乙醇代替DPPH溶液的光密度值。

1.3.6.2 羥自由基清除測定 參考Chen 等[10]方法，將0.4 mL 磷酸鹽緩沖液（0.2 mol/L，pH 7.0）與0.6 mL 5 mmol/L 的鄰二氮菲溶液充分混合，加入0.6 mL 的樣品溶液、0.6 mL 15 mmol/L 乙二胺四乙酸二鈉溶液和0.6 mL 5 mmol/L FeSO4溶液。最后加入0.8 mL 體積分數(shù)30%的H2O2溶液，徹底混勻，37 ℃下培養(yǎng)60 min，在536 nm 下測光密度。計算羥自由基清除率（%）。

式中：D樣品，樣品組光密度值；D對照，以去離子水代替樣品的光密度值；D空白，以去離子水代替H2O2的光密度值。

1.3.6.3 還原力的測定 參考蔡俊等[11]方法，測定模擬胃、腸消化后所提取的不同糖魚松消化產(chǎn)物還原力。

1.3.7 氨基酸組成分析 參考王樂等[9]方法測定消化產(chǎn)物中氨基酸。

1.3.8 數(shù)據(jù)分析 用SPSS19.0 軟件分析實驗數(shù)據(jù)，采用單因素方差分析（ANOVA）和Duncan法進行多重比較，顯著性水平α設(shè)為0.05，利用Origin 2018b軟件作圖。

2 結(jié)果與討論

2.1 添加不同糖對魚松體外胃腸消化率的影響

從圖1可見，除添加木糖的魚松樣品外，添加其他糖魚松在胃蛋白酶水解后的消化率顯著高于未加糖魚松（P＜0.05），這可能是因為糖的添加引入了更多的親水性羥基，致使魚肉蛋白溶解性提高、蛋白聚集較少，使胃蛋白酶更快地消化熱處理后的蛋白[12]。木糖是所有糖中美拉德反應(yīng)最快且程度最高的還原糖，添加木糖魚松的胃消化率在加糖魚松中最低，為32.25%，表明糖基化程度高可導致胃蛋白水解保護作用更高。蛋白質(zhì)在酸性pH 下的結(jié)構(gòu)穩(wěn)定[13]，它的胃蛋白酶裂解位點（疏水或芳香氨基酸側(cè)鏈）被埋在蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)中，形成強大的疏水核心并阻止水解，同時蛋白質(zhì)中的疏水基團大部分暴露在蛋白表面，增加了疏水相互作用程度，促進了蛋白質(zhì)聚集，這也可阻止胃蛋白酶進入酶切位點，使木糖魚松難以消化[13]。

圖1 添加不同糖的魚松體外消化率Fig.1 In vitro digestibility of fish floss with different sugars

采用胰蛋白酶對魚松的胃蛋白酶水解物進一步水解，圖1胃腸消化率結(jié)果顯示，經(jīng)胰蛋白酶水解后，木糖魚松的消化率從38.06%增加到44.81%，其消化率顯著低于不加糖樣品（49.17%），這表明加熱期間木糖的存在限制了這些蛋白質(zhì)對酶攻擊的熱誘導敏感性，蛋白質(zhì)聚集使得胰蛋白酶無法接觸酶切位點，從而限制了胰蛋白酶的作用效果[14]。其他加糖魚松的消化率均顯著高于未加糖魚松，其中加葡萄糖魚松的消化率從45.86%增加到63.02%，加半乳糖魚松的消化率從49.00%增加到60.28%，加果糖魚松的消化率從43.71%提高到60.15%（P＜0.05）。這可能是因為糖基化使魚肉中肌原纖維蛋白二級結(jié)構(gòu)改變，α-螺旋含量降低，無規(guī)則卷曲含量升高，導致蛋白質(zhì)二級結(jié)構(gòu)展開，內(nèi)部的酶切位點和氨基酸殘基暴露，更有利于胰蛋白酶水解[15-16]。

2.2 不同糖基化魚松消化產(chǎn)物的分子大小

由圖2 可見，魚松胃消化產(chǎn)物的SDS-PAGE 蛋白條帶中，木糖樣品蛋白條帶較少，僅在低分子處有條帶，這表明添加木糖魚松蛋白消化水解量更少，這一結(jié)果與前面消化率結(jié)果相一致。葡萄糖樣品的條帶較多，這可能由葡萄糖的加入使糖基化后的魚松蛋白溶解度升高[15]所致。魚松胃腸消化產(chǎn)物結(jié)果顯示，胃蛋白酶消化后出現(xiàn)的大部分條帶在胰蛋白酶水解后消失或減弱，說明胰蛋白酶將胃蛋白酶水解出的多肽和部分溶解出的蛋白質(zhì)分解成游離氨基酸或較小分子的肽。而木糖樣品在200 ku和44 ku 處有條帶，說明木糖魚松經(jīng)過胃蛋白酶和胰蛋白酶水解后，仍有小部分的肌球蛋白重鏈和肌動蛋白未被水解。

圖2 添加不同糖魚松胃腸消化后蛋白凝膠電泳變化Fig.2 Changes in SDS-PAGE of protein after gastrointestinal digestion of fish floss with different sugars

2.3 不同糖基化對魚松胃腸消化后粒徑的影響

在相同條件下，添加不同糖制作的魚松粒徑有顯著差異（P＜0.05）。表1 可見，隨著糖的加入，除木糖外的其他糖魚松樣品在胃蛋白酶消化后粒徑均有所下降，其中葡萄糖和半乳糖樣品的粒徑較小，可能是因為糖的加入改變了蛋白質(zhì)的二級結(jié)構(gòu)，使得胃蛋白酶更易接觸酶切位點[15-16]，這也間接表明添加葡萄糖和半乳糖的魚松更易被胃消化。從D10、D50和D90數(shù)值變化可見，經(jīng)過胰酶的進一步消化，所有組的粒徑值相比于胃蛋白酶消化更小，其中果糖的D10和D50顯著低于其他組，而木糖的D90顯著高于其他組，這說明木糖魚松更不易被胃蛋白酶和胰酶水解成更小顆粒，這一結(jié)果與消化率結(jié)果相一致。

2.4 不同糖基化對魚松體外模擬胃腸道消化產(chǎn)物抗氧化活性的影響

2.4.1 DPPH·清除能力 魚松消化產(chǎn)物的抗氧化性可用DPPH·清除能力來表示。DPPH·是一種穩(wěn)定的自由基，其中心結(jié)構(gòu)中的氮原子可接受多肽中的氫原子而被還原成DPPH-H 非自由基分子，表現(xiàn)為紫色到黃色的顏色變化，以此來判斷其清除能力[17]。從圖3 可見，6 種樣品的DPPH·清除能力均隨著消化產(chǎn)物濃度的增加而升高，其中胃腸消化后樣品的清除能力均低于胃消化后的。胃消化后，在5 mg/mL 質(zhì)量濃度下，木糖的DPPH·清除能力最大，為63.23%，這可能是因為木糖與魚肉中的蛋白質(zhì)分子發(fā)生美拉德反應(yīng)，生成了較多的揮發(fā)性雜環(huán)化合物，這些具有芳香特性的五元、六元雜環(huán)化合物中π電子非定域分布于環(huán)上，碳原子上電子過剩，使碳原子上π 電子云密度提高，更易與自由基的親核加成[16]。本研究中，DPPH·清除能力從大到小依次為木糖、半乳糖、葡萄糖、果糖、蔗糖、不加糖，說明魚松消化產(chǎn)物的DPPH 自由基清除能力主要與美拉德反應(yīng)程度有關(guān)，反應(yīng)程度越高，生成的具有抗氧化性的雜環(huán)化合物越多，從而抗氧化性越強。推測在胃蛋白酶的作用下魚松蛋白質(zhì)可釋放出更多的抗氧化活性肽，或酶水解后更多具有抗氧化性的疏水氨基酸殘基暴露出來，使其自由基清除能力增強。胃腸消化后，6 種樣品的抗氧化性均有不同程度的下降，這是因為在胰蛋白酶的作用下，具有DPPH·清除能力的活性肽被水解，以及特定的疏水性氨基酸從肽鏈中釋放，導致抗氧化性降低。但是木糖樣品仍表現(xiàn)出較高的DPPH·清除能力，再一次說明美拉德反應(yīng)產(chǎn)物有很強的抗氧化性。

圖3 添加不同糖魚松體外消化后的DPPH自由基清除能力Fig.3 DPPH radical scavenging ability of fish floss with different sugars digested in vitro

2.4.2 羥自由基清除能力 羥基自由基可與活細胞中一些分子發(fā)生反應(yīng)，導致機體組織脂質(zhì)過氧化，從而對人體細胞造成損傷[17]。

從圖4可見，胃消化后葡萄糖、木糖和半乳糖自由基清除能力較高，在5 mg/mL 濃度下，分別為11.98%、19.84%和11.30%。李靈誠[18]研究也發(fā)現(xiàn)，木糖與蛋白質(zhì)反應(yīng)生成的糖基化接枝產(chǎn)物羥自由基清除能力提高較多。添加葡萄糖、木糖和半乳糖魚松消化產(chǎn)物的自由基清除能力相較于未加糖樣品高，這可能是因為美拉德反應(yīng)產(chǎn)物有一定的抗氧化性，同時糖的添加可作為氫供體來結(jié)合自由基[19]。但是，不加糖魚松消化產(chǎn)物的抗氧化性高于添加蔗糖和果糖的魚松，一方面可能是因為蔗糖是二糖，糖鏈長度的增加，糖基化程度趨弱，生成的糖基化產(chǎn)物少，抗氧化能力趨弱[20]；另一方面可能是因為果糖與部分具有抗氧化性的活性肽參與美拉德反應(yīng)，具有清除自由基能力的氨基基團被消耗，并且其美拉德反應(yīng)產(chǎn)物的自由基清除能力低于這些抗氧化性肽[21]。胃腸消化后，6種樣品的羥自由基清除率表現(xiàn)出與DPPH·清除率相同的降低趨勢，但不同樣品羥自由基清除能力隨樣品質(zhì)量濃度增加而變化的趨勢同胃消化后，在5 mg/mL質(zhì)量濃度下，木糖魚松樣品的羥自由基清除率最大，為14.95%，未加糖和添加蔗糖的魚松自由基清除率下降比其他樣品多。

圖4 添加不同糖魚松體外消化后的羥自由基清除能力Fig.4 Hydroxyl radical scavenging ability of fish floss with different sugars digested in vitro

2.4.3 還原力 美拉德反應(yīng)產(chǎn)物抗氧化能力與還原力密切相關(guān)。樣品供電子能力越強，其還原能力就越高。供應(yīng)的電子不僅可將Fe3+還原成Fe2+，同時還可與自由基反應(yīng)，使其變成更為穩(wěn)定的物質(zhì)，從而停止自由基的連鎖反應(yīng)。在700 nm 處光密度越大，樣品的還原力越強[22-23]。

圖5顯示，胃消化后，添加葡萄糖、木糖和半乳糖魚松的消化產(chǎn)物一直有較高的還原能力，在5 mg/mL質(zhì)量濃度下達到最大，分別為0.595、1.055 和0.637，相比于未加糖魚松有一定的提高，一方面是因為美拉德反應(yīng)迅速生成吡咯和羥基等反應(yīng)產(chǎn)物，它們可通過氧化還原電位轉(zhuǎn)移電子；另一方面美拉德反應(yīng)初級階段產(chǎn)物還原酮的供氫能力可能是提高還原能力的另一個機制[24]。胃腸消化后，6 種樣品的還原能力同DPPH·清除率和羥自由基清除率一樣有所降低，這可能是因為經(jīng)過胰蛋白酶水解后，具有抗氧化性的活性肽被水解成小分子氨基酸，從而使還原能力降低。

圖5 添加不同糖魚松體外消化后的還原力Fig.5 Reducing ability of fish floss with different sugars digested in vitro

2.5 不同糖基化對魚松胃腸消化產(chǎn)物氨基酸組成的影響

表2 可見，魚松胃消化產(chǎn)物中共檢測出16 種氨基酸?？偘被幔═AA）含量從大到小分別為添加半乳糖、蔗糖、葡萄糖、果糖、不加糖和木糖的魚松，這一結(jié)果與消化率一致，說明消化率越大，消化產(chǎn)物中氨基酸的含量越高。胃消化后，必需氨基酸（EAA）占總氨基酸的比例（下稱“占比”）較高，不加糖樣品的必需氨基酸占比最高，為41.61%。表3 可見，胃腸消化后，所有樣品的必需氨基酸占比均超過35%，說明消化產(chǎn)物仍有較高的營養(yǎng)價值。

表3 魚松胃腸消化產(chǎn)物的氨基酸組分Table 3 Amino acid composition of crude peptide after gastrointestinal digestion of fish floss

魚松消化產(chǎn)物中主要為多肽，其抗氧化性與其氨基酸的組成有緊密聯(lián)系[25]。有研究發(fā)現(xiàn)，多肽中含有的堿性氨基酸（賴氨酸、精氨酸和組氨酸）和酸性氨基酸（天冬氨酸和谷氨酸）可使肽段有較高的自由基清除能力和金屬螯合能力，且堿性氨基酸對供氫及金屬螯合的貢獻高于酸性氨基酸[26]。同時，肽鏈中的疏水性氨基酸（色氨酸、苯丙氨酸、纈氨酸、亮氨酸、異亮氨酸、丙氨酸、脯氨酸和蛋氨酸）通常可使肽具有抗氧化性或抗氧化性增強。葛曉明等[25]研究發(fā)現(xiàn)，海馬（Hippocampus）酶解多肽中含酪氨酸、蛋氨酸、苯丙氨酸等疏水性氨基酸的肽對清除DPPH 自由基起關(guān)鍵作用。廖麗琴等[27]發(fā)現(xiàn)，西式發(fā)酵火腿粗肽中抗氧化性氨基酸（酸性、堿性和疏水性氨基酸）質(zhì)量分數(shù)超過87%，且粗肽的抗氧化活性較高。本研究中，魚松經(jīng)過胃和胃腸消化后，消化產(chǎn)物中的多肽含有較多的疏水氨基酸和堿性氨基酸，有利于含有疏水性氨基酸肽鏈的形成，幫助分子創(chuàng)造疏水環(huán)境，同時亮氨酸、纈氨酸和丙氨酸等疏水性氨基酸可作為芳香殘基側(cè)鏈上自由基過氧化的供氫體，增強肽的抗氧化性，因此多肽對于DPPH 自由基的清除能力較高[28]。但胃腸消化后，多肽中仍含有較高的抗氧化性氨基酸，對于自由基的清除能力卻顯著下降，這可能由緊鄰于賴氨酸和精氨酸的肽鍵是胰酶的酶切位點[29]，含堿性氨基酸的肽鏈被水解所致。多肽中的酸性氨基酸含量也相對較高，酪氨酸的酚羥基可供應(yīng)電子猝滅自由基，酸性氨基酸天冬氨酸的羧酸根有吸電子的效應(yīng)，可加強酪氨酸提供質(zhì)子的能力[30-31]。其中樣品胃、胃腸消化后酸性氨基酸占比最高，分別為31.80%（葡萄糖）、26.79%（不加糖），酸性氨基酸可供氫，使得Fe3+還原成Fe2+，同時Fe2+被氨基酸側(cè)鏈的—NH2和—COOH 結(jié)合，從而抑制自由基被金屬離子催化生成[11]。肽的抗氧化性與其氨基酸的組成、構(gòu)象、排列順序和相對分子質(zhì)量等相關(guān)[32]，因此仍需對魚松經(jīng)過胃、腸消化產(chǎn)物中多肽的氨基酸結(jié)構(gòu)進行鑒定及分析。

3 結(jié)論

采用胃蛋白酶-胰酶對添加不同種類糖炒制的魚松進行體外消化，以未加糖的魚松作為對照，除木糖魚松外，加糖魚松的消化率均顯著提高。模擬消化后，魚松消化產(chǎn)物抗氧化性隨著添加糖濃度的升高而升高，胃消化產(chǎn)物抗氧化性高于胃腸消化產(chǎn)物。木糖魚松對DPPH 自由基和羥自由基清除能力最強。氨基酸組成可知，胃腸消化產(chǎn)物總氨基酸中必需氨基酸質(zhì)量分數(shù)超過35%，具有一定的營養(yǎng)價值，同時消化產(chǎn)物的抗氧化活性與其氨基酸組成有關(guān)，亮氨酸、纈氨酸和丙氨酸等疏水性氨基酸以及酸性氨基酸天冬氨酸對于抗氧化的貢獻較高。與未加糖魚松相比，木糖魚松抗氧化性氨基酸含量占比最高。