陳秀紅，趙丹萍，李欣昱，何 晶，呂瑞琳，張建軍，趙忠鵬，王林元*

（1.北京中醫(yī)藥大學中藥學院，北京 100029；2.安徽醫(yī)科大學基礎(chǔ)醫(yī)學院，合肥 230032；3.北京中醫(yī)藥大學中醫(yī)學院，北京 100029）

流感是一種危害人類健康的常見傳染性疾病，目前接種疫苗是預(yù)防流感的最有效方式，但目前已批準的人用流感疫苗，如裂解疫苗等，保護效果并不是十分理想[1]。佐劑的應(yīng)用將有助于增強流感疫苗的免疫效果。已批準上市流感疫苗佐劑主要有鋁鹽佐劑、MF59、AS03 及類病毒顆粒等[2]，但存在免疫效果不理想、不良反應(yīng)大、種類少、產(chǎn)率低、造價高等問題[3]，因此開發(fā)出安全、有效、經(jīng)濟易得的佐劑是流感疫苗的重要研究方向。

中藥多糖可通過增強體液免疫、細胞免疫和黏膜免疫應(yīng)答，發(fā)揮免疫促進作用，且在動物疫苗佐劑中已有應(yīng)用，具有免疫調(diào)節(jié)、生物相容性、可生物降解、低毒、安全等特點[4-6]。前期課題組研究發(fā)現(xiàn)靈芝孢子作為流感疫苗的口服免疫佐劑可顯著提高小鼠的抗體水平，增強了機體的細胞和體液免疫水平。靈芝孢子多糖（ganoderma lucidum spore polysaccharide，GLSP）是靈芝孢子中的主要活性成分，具有較強的免疫作用[7]。因此，靈芝孢子多糖開發(fā)人用流感免疫佐劑具有較大潛力。本研究以靈芝孢子多糖聯(lián)合流感疫苗共同免疫小鼠，并以氫氧化鋁佐劑作為陽性對照，通過檢測血清特異性抗體水平、脾臟T、B 淋巴細胞增殖分化、骨髓樹突細胞共刺激分子表達、血清細胞因子含量等指標，研究靈芝孢子多糖對流感疫苗免疫小鼠的免疫效果及作用機制，為靈芝孢子多糖作為疫苗佐劑的研究和應(yīng)用提供了研究基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 動物 SPF 級BALB/c 小鼠，雌性，6 ～8 周齡，體質(zhì)量16 ～18 g，購自斯貝福（北京）生物技術(shù)有限公司，所有動物實驗均經(jīng)北京中醫(yī)藥大學動物福利與倫理委員會批準（倫理號：BUCM-4-2021072302-3034），飼養(yǎng)條件：溫度22 ～26℃，相對濕度60%～70%。

1.1.2 免疫原及藥物 甲型H1N1 流感病毒裂解疫苗原液（HA：291 μg/mL；Pr：421 μg/mL）由長春?；鶃喩锛夹g(shù)股份有限公司提供。靈芝孢子多糖由本課題組制備，其提取原料去壁的靈芝孢子粉由浙江壽仙谷公司提供，提取工藝采用水提醇沉法，按照2020 版中國藥典“靈芝”項下多糖含量測定方法檢測的靈芝孢子多糖含量為91%。

1.1.3 試劑 H1N1（A/PR/8/1934）流感病毒毒株由中國軍事醫(yī)學科學院提供，凝血滴度均為1:256。注射用氫氧化鋁/明礬佐劑（40 mg/mL），購自Bioss 生物技術(shù)有限公司。RDE（受體破壞酶）購自Denka Seiken（日本）。1%雞紅細胞（廣州宏泉生物科技有限公司）

PBS（sigma）；RPMI 1640（Invitrogen）；FBS（Beijing Aoqing Biotechnology Co.，LTD）；MTT（Solarbio）；ConA （Apexbio）；LPS（sigma）；DPBS（sigma）。小鼠TNF-α、IL-4 ELISA 試劑盒均購自上海酶聯(lián)生物技術(shù)有限公司；流式抗體：Brilliant Violet 605? Anti-Mouse CD45（BioLegend）、BV421 Rat anti-mouse CD25（BD）、BV510 Hamster anti-mouse CD3e（BD）、mCD8-R208-APC（sinobiological）、mCD4-R711-FITC（sinobiological）、FITC Anti-Mouse MHC-Ⅱ（I-A/I -E）（eBioscience）、BV421 Hamster Anti-Mouse CD80 （BD）、PE Rat Anti-Mouse CD86（BD）、BV786 Hamster Antimouse CD11c（BD）。

1.1.4 儀器 流式細胞儀（Nonocyte、 ACEA）、離心機（5810R、Eppendorf）、漩渦混合儀（88880018、Thermo）、酶標儀（Epoch 2、BioTeK）。

1.2 方法

1.2.1 動物分組及免疫 BALB/c 雌性小鼠隨機分為4組，每組6 只，分別為空白對照組（Control）、疫苗組（VA）、疫苗+鋁佐劑組[Al（OH）3]、疫苗+靈芝孢子多糖組（GLSP）。各組小鼠分別于實驗第0 天、第14 天進行初次免疫和加強免疫，空白組小鼠肌肉注射PBS 溶液，VA 組、Al（OH）3組和GLSP 組小鼠分別肌肉注射流感疫苗原液（15 μg 血凝素/只小鼠）、流感疫苗原液與氫氧化鋁（100 μg/只小鼠）[8]、流感疫苗原液與靈芝孢子多糖（800 μg/只小鼠）的混合溶液，免疫體積為0.2 mL/只小鼠[9]。免疫后不同時間點稱量小鼠體質(zhì)量并觀察小鼠的生長狀態(tài)，并于加強免疫后第14天、第30天眼眶取血，檢測特異性抗體水平，加強免疫后第49 天取血清，分離胸腺、脾臟、骨髓細胞等，檢測各項指標。

1.2.2 一般狀況及體質(zhì)量 每次免疫后觀察小鼠是否有過敏反應(yīng)，蜷縮、豎毛、噴嚏、抽搐及休克等；進一步觀察小鼠的精神狀態(tài)，進食、活動、注射部位有無硬結(jié)、出血或者潰爛情況，并記錄實驗第0、14、28、42 及63 天等不同時間各組小鼠體質(zhì)量。

1.2.3 血凝抑制（HI）法檢測小鼠血清中特異性抗體滴度 各組小鼠于加強免疫后14 d、28 d 眼眶采血，分離血清，采用血凝抑制法測定小鼠血清中H1N1 特異性抗體滴度[10]?？贵w滴度表示為最高抗體滴度稀釋倍數(shù)的倒數(shù)。

1.2.4 小鼠胸腺、脾臟指數(shù) 小鼠取血后，分離胸腺、脾臟，濾紙吸干殘血后，稱重，按下列方法計算胸腺指數(shù)：胸腺指數(shù)=（胸腺質(zhì)量/體質(zhì)量）×10，脾臟指數(shù)：脾臟指數(shù)=脾臟質(zhì)量/體質(zhì)量×10。

1.2.5 酶聯(lián)免疫吸附（ELISA）法檢測小鼠血清中細胞因子水平 各組小鼠加強免疫后49 d 取血并分離血清，采用ELISA 法檢測小鼠血清中IL-4、TNF-α 含量，檢測步驟按照試劑盒說明書進行，于450 nm 波長檢測吸光度（OD）值并計算細胞因子濃度。

1.2.6 MTT 法檢測脾臟淋巴細胞增殖 各組小鼠加強免疫后49 d，無菌條件下取脾，制備脾細胞懸液，按照每毫升1×106個脾細胞懸液加入96 孔板，分別加入5 μg/mL 的ConA 和5 μg/mL 的LPS，每組設(shè)置3個復(fù)孔，于37 ℃培養(yǎng)箱中孵育48 h，采用MTT 法檢測T、B 淋巴細胞的增殖活性。細胞增殖率用刺激指數(shù)SI 表示：SI =（實驗組OD -空白組OD）／（陰性對照OD -空白組OD）。

1.2.7 流式細胞術(shù)檢測脾臟CD4+、CD8+、CD25+T 細胞亞型 各組小鼠脾細胞懸液分裝至96 孔板中，每孔50 μL，37℃培養(yǎng)4 h，離心棄上清，加入Brilliant Violet605? Anti-Mouse CD45（BioLegend）、BV421 Rat antimouse CD25（BD）、BV510 Hamster anti-mouse CD3e（BD）、mCD8-R208-APC（sinobiological）、mCD4-R711-FITC（sinobiological）抗體混合液，4℃避光孵育30 min，離心洗細胞2 次，重懸，采用流式細胞儀進行上機檢測。

1.2.8 流式細胞術(shù)檢測小鼠骨髓樹突細胞（DC）中MHC II+、CD80+、CD86+水平 各組小鼠無菌條件下取小鼠股骨和脛骨，并進行無菌處理制備骨髓細胞懸液，骨髓細胞分裝至U 底96 孔板中，每管75 μL，加入FITC Anti-Mouse MHC-Ⅱ（I-A/I -E）（eBioscience）、BV421 Hamster Anti-Mouse CD80 （BD）、PE Rat Anti-Mouse CD86（BD）、BV786 Hamster Anti-mouse CD11c（BD）抗體混合液，4℃避光孵育20 min，洗液為含BSA 的PBS 溶液，重懸，采用流式細胞儀進行上機檢測。

2 結(jié)果

2.1 各組小鼠體質(zhì)量變化情況比較 分別于實驗第0、14、28、42 及63 天不同時間點稱量小鼠體質(zhì)量并觀察小鼠的生長狀態(tài)，結(jié)果見表1。免疫期間小鼠無過敏反應(yīng)，進食活動正常，狀態(tài)良好，各組小鼠體質(zhì)量隨時間推移呈增長趨勢，各組間無差異，符合小鼠正常生長特性，表明靈芝孢子多糖對小鼠無不良反應(yīng)。

表1 各組小鼠體質(zhì)量變化情況比較（± s，n = 6） g

表1 各組小鼠體質(zhì)量變化情況比較（± s，n = 6） g

組別 第0 天 第14 天 第28 天 第42 天 第63 天空白對照組 17.46±1.63 20.11±1.99 20.99±2.13 21.66±2.78 22.60±2.76疫苗組 17.44±1.45 20.49±1.40 21.32±1.49 23.01±1.47 24.21±2.13疫苗+鋁佐劑組 17.44±1.45 20.18±0.99 20.28±1.73 22.66±1.09 23.23±1.03疫苗+靈芝孢子多糖組 17.44±1.45 20.18±0.99 21.36±1.48 22.87±1.60 23.68±1.69

2.2 各組小鼠血清中HI 抗體滴度比較 見表2。

表2 各組小鼠血清中HI 抗體滴度比較（± s，n = 5） log2

表2 各組小鼠血清中HI 抗體滴度比較（± s，n = 5） log2

注：與疫苗組比較，# P ＜0.05

組別 二免后14 d 二免后30 d疫苗組 6.67±0.82 6.50±0.55疫苗+鋁佐劑組 8.6±2.30 6.8±1.10疫苗+靈芝孢子多糖組 10.17±1.17# 7.67±1.75

2.3 各組小鼠臟器指數(shù)變化比較 見表3。

表3 各組小鼠臟器指數(shù)變化比較（± s，n = 6）

表3 各組小鼠臟器指數(shù)變化比較（± s，n = 6）

組別 脾臟指數(shù) 胸腺指數(shù)空白對照組 45.75±3.33 16.93±3.43疫苗組 45.63±3.30 15.22±3.20疫苗+鋁佐劑組 42.65±4.48 16.57±1.95疫苗+靈芝孢子多糖組 41.72±2.66 16.07±1.78

2.4 各組小鼠血清中細胞因子的水平比較 見表4。

表4 各組小鼠血清中細胞因子的水平比較（± s，n = 6）pg/mL

表4 各組小鼠血清中細胞因子的水平比較（± s，n = 6）pg/mL

注：與空白對照組比較，# P ＜0.05，## P ＜0.01；與疫苗+鋁佐劑組比較，△P ＜0.05

組別 IL-4 TNF空白對照組 62.56±12.97 352.01±17.36疫苗組 63.99±8.19 517.61±70.43#疫苗+鋁佐劑組 71.45±9.41 416.24±49.36疫苗+靈芝孢子多糖組 84.54±14.81##△ 493.70±48.30##

2.5 ConA 和LPS 刺激的脾淋巴細胞增殖變化比較 見表5。

表5 ConA 和LPS 刺激的脾淋巴細胞增殖變化比較（± s，n = 3）

表5 ConA 和LPS 刺激的脾淋巴細胞增殖變化比較（± s，n = 3）

注：與空白對照組比較，# P ＜0.05，## P ＜0.01，### P ＜0.001；與疫苗組比較，△△P ＜0.01；與疫苗+鋁佐劑組比較，▲P ＜0.05

組別 ConA LPS空白對照組 0.81±0.53 2.28±0.85疫苗組 1.43±0.87 2.72±2.01疫苗+鋁佐劑組 2.68±0.42## 2.47±0.90疫苗+靈芝孢子多糖組 3.36±1.51###△△ 5.17±1.53#▲

2.6 流式細胞術(shù)檢測各組脾T 淋巴細胞免疫表型的表達比較 采用流式細胞術(shù)檢測脾臟T 淋巴細胞亞群中CD3+，CD3+CD4+，CD3+CD8+和CD3+CD4+CD25+的表達水平，結(jié)果見表6，如圖1。靈芝孢子多糖組中CD4+細胞含量升高，CD8+細胞含量下降，但無差異，CD25+含量顯著升高（P＜0.01）。結(jié)果表明在免疫過程中，靈芝孢子多糖可能誘導(dǎo)產(chǎn)生了較強的免疫反應(yīng)，為維持機體自身穩(wěn)定，誘導(dǎo)Treg 細胞增殖活化，從而抑制了CTL 細胞的活化和增殖，提示GLSP 具有較強的免疫調(diào)節(jié)作用。

圖1 流式細胞術(shù)檢測各組脾T 淋巴細胞免疫表型表達的變化

表6 流式細胞術(shù)檢測各組脾T 淋巴細胞免疫表型的表達比較（± s，n = 3）

表6 流式細胞術(shù)檢測各組脾T 淋巴細胞免疫表型的表達比較（± s，n = 3）

注：與空白對照組比較，## P ＜0.01

組別 CD3+/% CD3+CD4+/% CD3+CD8+/% CD4+/CD8+ CD25+/%空白對照組 41.00±1.82 77.92±3.59 15.85±2.40 5.02±1.05 7.55±1.13疫苗組 38.40±2.82 75.51±1.28 16.61±1.00 4.56±0.34 8.45±1.01疫苗+鋁佐劑組 40.24±5.26 75.85±1.70 16.72±1.83 4.58±0.64 8.73±0.10疫苗+靈芝孢子多糖組 38.99±3.54 78.39±0.25 14.36±0.48 5.46±0.19 9.79±0.58##

2.7 各組小鼠骨髓樹突細胞表面刺激分子含量比較 采用流式細胞術(shù)檢測小鼠骨髓樹突細胞中MHC II類分子以及共刺激分子CD80、CD86，結(jié)果見表7，如圖2。與空白對照組比較，靈芝孢子多糖能顯著增強MHC II分子表達（P＜0.001），且顯著優(yōu)于疫苗組（P＜0.001）及鋁佐劑組（P＜0.05）；靈芝孢子多糖組共刺激分子CD86+表達顯著增強，優(yōu)于疫苗組及鋁佐劑組（P＜0.05）；CD80+分子水平有升高，但無顯著差異，表明靈芝孢子多糖可促進DC 細胞成熟并提高了DC的抗原提呈能力，進而加強了激活初始T 細胞的能力，在免疫應(yīng)答中發(fā)揮了重要作用。

圖2 各組小鼠骨髓樹突細胞表面刺激分子含量變化

表7 各組小鼠骨髓樹突細胞表面刺激分子含量比較（± s，n = 3）

表7 各組小鼠骨髓樹突細胞表面刺激分子含量比較（± s，n = 3）

注：與空白對照組比較，### P ＜0.001；與疫苗組比較，△P ＜0.05，△△△P ＜0.001；與疫苗+鋁佐劑組比較，▲P ＜0.05

組別 CD11C+MHCII+/% MHCII+CD86+/% MHCII+CD80+/% CD80+/CD86+空白對照組 0.59±0.13 19.06±1.51 44.51±1.23 2.34±0.16疫苗組 0.53±0.02 15.98±2.30 44.80±7.58 2.80±0.13疫苗+鋁佐劑組 0.76±0.14△ 11.54±1.23### 36.33±1.07## 3.16±0.24疫苗+靈芝孢子多糖組 1.04±0.12###△△△▲ 21.88±1.35△▲ 50.16±6.56 2.29±0.18

3 討論

中藥多糖類成分是當前作為流感疫苗佐劑研究的重點，其種類繁多，且每種多糖均具有獨特的免疫作用，可以通過激活T、B 淋巴細胞等免疫細胞，激活補體，促進干擾素生成，誘生細胞因子等方式產(chǎn)生強大的免疫調(diào)節(jié)作用，影響機體的免疫功能，很有希望開發(fā)成為新型疫苗佐劑[8,11-12]。靈芝孢子多糖是靈芝孢子中的重要活性成分，具有較強的免疫調(diào)節(jié)作用[7]。本實驗將靈芝孢子多糖和流感疫苗共同免疫小鼠，通過檢測特異性抗體滴度、細胞因子水平、脾臟T、B 淋巴細胞增殖、脾臟T 淋巴細胞亞群及骨髓樹突細胞共刺激分子等指標評價靈芝孢子多糖對小鼠體液免疫和細胞免疫的應(yīng)答能力，并深入探討其作為疫苗佐劑的免疫效果及作用機制。

本實驗結(jié)果發(fā)現(xiàn)，靈芝孢子多糖可明顯提高小鼠的抗體效價，一般來說免疫原性HI 抗體效價≥1: 40被認為是流感疫苗注冊時評價有效性的重要指標[13]，本研究結(jié)果靈芝孢子多糖組二免后抗體14 d 效價大于1 024，二免后30 d 效價大于128，且強于鋁佐劑組，具有較好的體液免疫應(yīng)答，表明靈芝孢子多糖可增強機體的體液免疫應(yīng)答，誘導(dǎo)和促進抗體的產(chǎn)生。

細胞因子對機體的免疫應(yīng)答具有重要調(diào)節(jié)作用[14]。按功能劃分為Th1 型細胞因子、Th2 型細胞因子[15]，Th1 細胞主要促進細胞介導(dǎo)的免疫，而Th2 細胞以促進抗體產(chǎn)生為主[16]。本實驗對小鼠血清中細胞因子水平進行檢測，研究結(jié)果表明靈芝孢子多糖佐劑可刺激Th2 型細胞因子IL-4、Th1 型細胞因子TNF-α 分泌，而常用的鋁佐劑只能誘導(dǎo)Th2 型免疫應(yīng)答[17]，因此，靈芝孢子可平衡Th1/Th2 型免疫應(yīng)答，誘導(dǎo)機體同時產(chǎn)生細胞免疫和體液免疫。

T 淋巴細胞和B 淋巴細胞分別執(zhí)行不同的免疫功能，T 淋巴細胞主要參與人體的細胞免疫功能，病原微生物侵入人體后，可以直接發(fā)揮免疫作用；B 淋巴細胞會增殖變成漿細胞，然后產(chǎn)生抗體，通過抗體結(jié)合抗原而發(fā)揮免疫作用[18]。本實驗研究結(jié)果表明靈芝孢子多糖可顯著提高LPS 誘導(dǎo)的B 細胞及ConA 誘導(dǎo)的T 細胞的增殖活性。因此，靈芝孢子多糖可在機體接觸抗原后刺激T 淋巴細胞直接發(fā)揮細胞免疫作用，刺激B 淋巴細胞增殖分化，促進產(chǎn)生抗體。

T 淋巴細胞對機體免疫性能的穩(wěn)定具有重要的調(diào)節(jié)作用，CD4+T 細胞具有輔助細胞免疫和體液免疫的功能；CD8+T 細胞主要是殺死感染了病原體的宿主細胞和破壞腫瘤細胞；在細胞免疫中，T 淋巴細胞中CD4+和CD8+淋巴細胞數(shù)量及比值的變化直接反映機體的免疫應(yīng)答水平。當CD4+和CD8+比值增大時，表明機體具有較強的免疫功能[19]。Treg 細胞具有負向免疫調(diào)節(jié)能力，CD25+是其標志性表面分子[20]。本實驗發(fā)現(xiàn)，靈芝孢子多糖作為流感疫苗佐劑免疫小鼠，增加了CD4+細胞表達，降低了CD8+細胞的表達，CD4+/CD8+比值升高，在免疫過程中靈芝孢子多糖誘導(dǎo)產(chǎn)生了較強的免疫反應(yīng)。同時為維持機體自身穩(wěn)定，靈芝孢子多糖組小鼠調(diào)節(jié)T 細胞標志性表面分子CD25+表達水平顯著升高，誘導(dǎo)Treg 細胞增殖活化，從而抑制了CTL 細胞的活化和增殖，因此CD8+細胞水平降低，抑制性細胞因子IL-4 含量升高，提示靈芝孢子多糖不僅有免疫增強作用，同時也可表現(xiàn)出免疫抑制，具有較強的免疫調(diào)節(jié)作用。

樹突狀細胞是機體功能最強的專職抗原遞呈細胞，樹突狀細胞的成熟和分化是獲得性免疫應(yīng)答重要的一步[21]。MHC Ⅱ作為其表面的抗原提呈分子，與外源性抗原結(jié)合成復(fù)合物形式提呈給CD4+T 細胞，是T 細胞活化的第一啟動信號[22]，進而可激活細胞免疫應(yīng)答。DC 在成熟過程中細胞表面表達的共刺激分子CD80 和CD86 與T 細胞表面表達的CD28 分子相互作用，共同促進T 細胞向Th2 分化[23]，從而誘導(dǎo)體液免疫。本實驗結(jié)果表明，靈芝孢子多糖能顯著增強小鼠骨髓樹突細胞表面MHC II 分子水平、共刺激分子CD86 和CD80 分子水平，表明GLSP 可促進DC 細胞成熟并提高了DC 的抗原提呈能力，進而加強了激活初始T 細胞的能力，且促進T 細胞向Th2 分化，從而誘導(dǎo)體液免疫。

綜上所述，靈芝孢子多糖作為流感疫苗新型佐劑，可提升機體的免疫應(yīng)答水平，促進Th1/Th2型免疫應(yīng)答，促進T、B 淋巴細胞增殖分化誘導(dǎo)機體同時產(chǎn)生細胞免疫和體液免疫；調(diào)節(jié)T 淋巴細胞亞群水平產(chǎn)生免疫調(diào)節(jié)；通過促進DC 細胞成熟并提高DC 的抗原提呈能力提高機體對抗原的免疫應(yīng)答。本研究結(jié)果提示靈芝孢子多糖可作為一種新型免疫佐劑值得進行深入研究。