王 鈺，褚福浩，程思怡，柯凱樂，鄭 直，丁 霞

（北京中醫(yī)藥大學(xué)，北京 102488）

我國慢性胃炎、胃癌均呈高發(fā)態(tài)勢[1]。CORREA P[2]提出的腸型胃癌的級聯(lián)反應(yīng)模式中胃癌前病變是降低胃癌發(fā)生率的關(guān)鍵階段[3]。國醫(yī)大師路志正提出調(diào)氣養(yǎng)陰、活血解毒的核心治法，根據(jù)其臨床經(jīng)驗研發(fā)的慢痞消有效阻斷慢性胃炎炎癌轉(zhuǎn)化，緩解患者臨床癥狀[4-5]。前期研究證實慢痞消能有效改善大鼠胃黏膜病理損傷，改善胃黏膜炎癥狀態(tài)，恢復(fù)胃酸分泌功能，降低其血清中炎癥因子水平[6]。

胃癌及胃癌前疾病與腸道菌群關(guān)系密切，致病菌和益生菌失調(diào)能影響宿主遠端器官機能。胃癌患者糞便菌群和腸黏膜菌群的組成與健康個體存在顯著差異，益生菌比例降低[7]。前期研究發(fā)現(xiàn)慢性胃炎炎癌轉(zhuǎn)化不同階段模型大鼠的腸道菌群的豐度、多樣性和組成存在顯著差異[8]。其中特征性菌群中的糞腸球菌（enterococcus faecalis，E.fa）可誘導(dǎo)胃上皮細胞產(chǎn)生活性氧 ，引起胃癌相關(guān)的DNA 損傷和炎癥反應(yīng)[9]；大腸桿菌（escherichia coli，E.coli）可產(chǎn)生大腸桿菌素和細胞致死性膨脹毒素，損傷細胞DNA，引起基因組不穩(wěn)定，促進胃癌前病變的形成[10]；“新一代益生菌”嗜黏蛋白阿克曼菌（akkermansia muciniphila，Akk）可分解黏蛋白，會釋放營養(yǎng)物質(zhì)，影響腸道菌群結(jié)構(gòu)及代謝功能，抑制炎癥反應(yīng)[11]。

本研究通過比濁法探究慢痞消組方中各味中藥對益生菌Akk 和條件致病菌E.coli 和E.fa 的增殖影響，通過聚類分析各味中藥調(diào)控菌群的藥效作用特點，為從調(diào)節(jié)腸道菌群平衡的角度探究慢痞消治療胃癌前病變的藥效物質(zhì)基礎(chǔ)及作用機制研究提供參考。

1 材料與試劑

1.1 儀器與設(shè)備 旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀，迪圖生物科技有限公司，型號：N-1300V-W。多功能酶標儀，帝肯貿(mào)易有限公司，型號：Infinite 200 pro。測序儀，Applied Biosystems，型號SeqStudio。梯度 PCR 儀，BIO-RAD，型號：T100?；驍U增儀，美國Bio-Rad，型號：TC-96/G/H（b）B。多功能成像系統(tǒng)，美國GE，型號：AI680。

1.2 試劑與耗材 試劑：革蘭氏染色液試劑盒，海博，型號：HB8278；腦心浸出液肉湯（BHI），海博，型號：HB8297-1，均購自北京拜爾迪生物技術(shù)有限公司。細菌基因組DNA 提取試劑盒，天根生化科技有限公司，型號：DP302。TaKaRaTaq?Vers，Takara，型號：R004A，均購自河南省工業(yè)微生物菌種工程技術(shù)研究中心。中藥飲片：香櫞購自亳州市永剛飲片廠。丹參、炙甘草均購自北京市雙橋燕京中藥飲片廠。生白術(shù)、玫瑰花、玉竹、醋延胡索、砂仁、烏梅、白花蛇舌草、太子參、紫蘇梗均購自北京本草方源藥業(yè)集團有限公司。菌株：Akk 菌株、E.coli 菌株、E.fa 菌株均購自北納生物科技有限公司。

2 方法

2.1 慢痞消各味中藥提取液的制備 稱量12 味中藥各100 g，分別加入1 000 mL蒸餾水浸泡30 min，煎煮1.5 h，用200目濾布過濾，藥渣重復(fù)煎煮過濾，合并2次濾液，5 000 rpm 離心10 min，取上清液減壓濃縮冷凍干燥。

2.2 菌株培養(yǎng)、鏡檢并繪制生長曲線 用平板四區(qū)劃線法將3 種菌培養(yǎng)，次日接種于液體培養(yǎng)基，250 rpm 37℃恒溫搖床過夜。再取菌液接種于液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)3 d。取菌液和50%甘油按照1:1 混合凍存。將三株菌液分別接種于6 孔板中，設(shè)置實驗組和培養(yǎng)基對照組，從0 h 開始每隔2 h 測定2 組OD 600 nm 值，繪制生長曲線。按照革蘭氏染色試劑盒說明書步驟對菌株進行染色觀察。

2.3 細菌基因測序鑒定 按照天根細菌基因組提取試劑盒說明書步驟提取3 種菌基因組。DNA 片段用瓊脂糖凝膠電泳檢測純度，120 V 恒壓于電泳液30 min，紫外成像觀察。用PCR 擴增試劑盒進行目的基因擴增，細菌16 s rRNA 基因的前/后引物由通用生物進行合成，序列5’to3’：27F 和1492R，產(chǎn)物大小1 500 bp。將提取的DNA 放入PCR 擴增儀中擴增反應(yīng)，預(yù)熱98℃2 min；循環(huán)98 ℃10 s；49 ℃30 s；72 ℃60 s 共30 個；最終延伸72℃5 min 并測序分析。PCR 產(chǎn)物電泳檢測，100 V 恒壓于電泳液40 min，紫外成像觀察。PCR 擴增產(chǎn)物進行雙向測序并拼接結(jié)果，登錄NCBI進行BLAST-N 比對序列相似度。

2.4 比濁法檢測慢痞消各味中藥對三株菌的增殖影響 將各濃度中藥藥液、菌液和液體培養(yǎng)基混合均勻接種于96 孔板中，12 味中藥凍干粉稀釋成2.5、1.25、0.625、0.313、0.156、0.078、0.039 mg/mL 共7 個濃度。設(shè)置實驗組、菌液對照組（無藥液）和培養(yǎng)基空白對照組。培養(yǎng)后600 nm 下測定各組OD 值。

2.5 數(shù)據(jù)分析及慢痞消各味中藥對三株菌調(diào)節(jié)作用的藥效規(guī)律分析 實驗數(shù)據(jù)均用Graph Pad Prism 9.5.1 統(tǒng)計分析，數(shù)據(jù)均為3 次獨立實驗結(jié)果，各組統(tǒng)計結(jié)果用均數(shù)±標準差（±s）描述表示。P＜0.05 為差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。選擇1.25、0.625、0.313、0.156、0.078 mg/mL 各味中藥對三株菌的增殖結(jié)果進行聚類分析。

3 結(jié)果

3.1 鏡檢結(jié)果 Akk復(fù)活4 d平板菌層明顯，菌落典型，菌落0.5 ～1 mm，圓形邊緣不整齊，不透明，灰白色，中間凸起，表面光滑；E.coli 復(fù)活18 ～24 h 平板菌層明顯，菌落典型，菌落2 ～4 mm，圓形邊緣整齊，不透明，淡黃色，中間凸起，表面明亮光滑；E.fa 復(fù)活24 h 平板菌層明顯，菌落典型，菌落1 ～2 mm，圓形邊緣整齊，不透明，灰白色，中間凸起，表面明亮光滑。三株菌質(zhì)地濕潤易挑起，復(fù)活性均良好。染色后Akk和E.coli 呈紅色，為革蘭氏陰性菌，E.fa 呈藍色，為革蘭氏陽性菌。

3.2 生長曲線 Akk、E.coli 和E.fa 分別在48、4 和2 h 進入對數(shù)期，96、8 和8 h 達到平臺期，故后續(xù)實驗分別培養(yǎng)48、6 和4 h，見表1。

3.3 鑒定結(jié)果 三株菌分別經(jīng)DNA提取、凝膠電泳（圖1A）、基因擴增、凝膠電泳（圖1B）和測序分析，序列比對一致性分別達99.14%、100%、99.58%，分別鑒定為Akk、E.coli 和E.fa 菌株無誤。

3.4 慢痞消各味中藥促進Akk 的增殖、抑制E.coli 和E.fa 的增殖 選0.625、0.313、0.156 mg/mL 中藥對各菌增殖OD值進行分析發(fā)現(xiàn)，白術(shù)、丹參、炙甘草、玫瑰花、砂仁、太子參、玉竹等中藥能明顯促進Akk增殖（表2）；白術(shù)、丹參、玫瑰花、烏梅、香櫞、玉竹、紫蘇梗等中藥能明顯抑制E.coli 增殖（表3）；炙甘草、玫瑰花、砂仁、太子參、烏梅、香櫞、玉竹、紫蘇梗等中藥能明顯抑制E.fa 增殖（表4），并呈現(xiàn)一定的劑量依賴性。3.5 聚類分析結(jié)果 慢痞消各味中藥對三株菌的調(diào)節(jié)作用被聚為三類（如圖2）：1）紫蘇梗、香櫞、醋延胡索、白花蛇舌草、玫瑰花、丹參、砂仁，有理氣活血、祛瘀解毒的祛邪作用；2）玉竹、太子參、甘草、烏梅，有益氣和中、養(yǎng)陰生津的扶正作用；3）白術(shù)有補氣燥濕和中，即扶正祛邪作用。

圖2 慢痞消各味中藥對三株菌的增殖水平聚類分析

注：A.細菌基因提取電泳檢測圖；B.PCR 產(chǎn)物電泳圖，1-10.菌株

表2 慢痞消各味中藥作用嗜黏蛋白阿克曼菌的增殖OD600 nm 值 mg/mL

表3 慢痞消各味中藥作用大腸桿菌的增殖OD600 nm 值 mg/mL

表4 慢痞消各味中藥作用糞腸球菌的增殖OD600 nm 值 mg/mL

4 討論

慢痞消中太子參水煎液可通過提高有益菌豐度、顯著降低有害菌豐度治療脾虛型大鼠[12]。丹參提取物通過影響擬桿菌酶、厚壁菌門豐度緩解小鼠E.coli 感染[13]。玉竹多糖促進乳桿菌生長，抑制E.coli 生長[14]。白術(shù)多糖能緩解腹瀉，增加大鼠有益菌豐度，降低有害菌豐度[15]。中、低劑量烏梅水煎液顯著上調(diào)因抗生素而失調(diào)的菌群中乳桿菌屬和糞桿菌屬的相對豐度[16]。砂仁水煎液亦能恢復(fù)腸道菌群失調(diào)[17]。甘草水提物能增加BALB/c 小鼠糞便菌群中厚壁菌門豐度，降低擬桿菌門和變形菌門豐度[18]。本研究結(jié)果進一步顯示：慢痞消中白術(shù)等能明顯促進Akk 增殖。烏梅等能明顯抑制E.coli 和E.fa 增殖，經(jīng)聚類分析發(fā)現(xiàn)與其扶正祛邪藥效之間存在一定相關(guān)性。

中藥及復(fù)方口服后經(jīng)消化道腸道菌群的生物轉(zhuǎn)化，吸收入血發(fā)揮藥效作用。基于中醫(yī)整體觀思想調(diào)控腸道菌群平衡探究中藥及復(fù)方的藥效物質(zhì)基礎(chǔ)，值得深入研究以揭示其科學(xué)內(nèi)涵。