姚 瑤，于鵬程，宋孝文，趙 楷，關(guān) 瑜，孟祥才

（黑龍江中醫(yī)藥大學(xué) 藥學(xué)院,黑龍江 哈爾濱 150040）

防風(fēng)為傘形科植物防風(fēng)Saposhnikovia divaricata(Turcz.) Schischk.的干燥根，具有祛風(fēng)解表、勝濕止痛、止痙的功效，用于治療感冒頭痛、風(fēng)濕痹痛、風(fēng)疹瘙癢、破傷風(fēng)等[1]。防風(fēng)喜光、耐旱、耐寒，適應(yīng)性很強(qiáng)[2]，分布區(qū)域廣，不同產(chǎn)地藥材質(zhì)量相差較大。2020 年版《中國藥典》規(guī)定，防風(fēng)中的升麻素苷和5-O- 甲基維斯阿米醇苷兩種色原酮的總量不得少于0.24%[1]，對(duì)不同產(chǎn)地防風(fēng)質(zhì)量分析表明升麻素苷和5-O- 甲基維斯阿米醇苷含量差異較大。種質(zhì)和環(huán)境是影響藥材質(zhì)量的最主要因素[3]。防風(fēng)依據(jù)種質(zhì)可分為水防風(fēng)與關(guān)防風(fēng)，水防風(fēng)指的是河北及內(nèi)蒙古赤峰種子所種植的防風(fēng)，而關(guān)防風(fēng)指的是黑龍江及內(nèi)蒙古種子所種植的防風(fēng)，兩者為防風(fēng)植物的不同生態(tài)型，其中關(guān)防風(fēng)質(zhì)量較佳，但產(chǎn)量較低。干旱是影響藥材質(zhì)量的主要生態(tài)因子[4]，防風(fēng)主要生長在干旱地區(qū)，為典型的陽性植物，主產(chǎn)于我國東北地區(qū)和華北地區(qū)，黑龍江種植面積占全國種植面積的50%以上，以黑龍江和內(nèi)蒙古產(chǎn)量最大[5]。為此，本文對(duì)防風(fēng)藥材質(zhì)量進(jìn)行調(diào)查研究，分析藥材質(zhì)量形成因素，以期為優(yōu)質(zhì)藥材生產(chǎn)提供指導(dǎo)。

1 材料、儀器與試劑

1.1 材料

42 批防風(fēng)樣品來源信息見表1，經(jīng)黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)孟祥才教授鑒定為傘形科植物防風(fēng)Saposhnikovia divaricata(Turcz.) Schischk.的干燥根。

表1 防風(fēng)樣品信息Tab.1 Radix Saposhnikoviae sample information

1.2 儀器

Waters e2695 型高效液相色譜儀（美國 Waters 公司）；CPA225D 型精密分析電子天平（德國賽多利斯公司）。

1.3 試劑

升麻素苷（批號(hào)：111522-202214，純度：95.7%）、升麻素（批號(hào)：111710-200602，純度≥98.0%）、5-O-甲基維斯阿米醇苷（批號(hào)：111523-202212，純度：97.8%）、亥茅酚苷（批號(hào)：111714-200501，純度≥98.0%），均購自中國食品藥品檢定研究院；甲醇（色譜純，美國迪馬公司）、娃哈哈純凈水、甲醇（分析純，天津市天力化學(xué)試劑有限公司）。

2 方法

2.1 溶液的制備

2.1.1 對(duì)照品溶液的制備 精密稱取升麻素苷、升麻素、5-O- 甲基維斯阿米醇苷及亥茅酚苷對(duì)照品適量，分別加甲醇溶解并定容制成含量為3.784 mg/mL、0.424 mg/mL、3.488 mg/mL、0.208 mg/mL 的對(duì)照品貯備液，精密量取上述各對(duì)照品貯備液1 mL 置10 mL容量瓶中，加甲醇稀釋至刻度，制成混合對(duì)照品溶液。

2.1.2 供試品溶液的制備 取防風(fēng)粉末（過60 目篩）0.25 g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，精密加入甲醇10 mL，稱定重量，水浴回流2 h，放冷，再稱定重量，用甲醇補(bǔ)足失重，搖勻，濾過，取續(xù)濾液，過0.45 μm 微孔濾膜，即得。

2.2 色譜條件

DIKMA C18色譜柱(4.6 mm×250 mm，5 μm)，以甲醇（A）-水（B）為流動(dòng)相進(jìn)行梯度洗脫，0 ～8 min，30%→50%A；8 ～ 18 min，50%→70%A；18 ～30 min，70%A。柱溫：40℃；流速：1.0 mL/min；二極管陣列(PDA)檢測(cè)器檢測(cè)波長：254 nm；進(jìn)樣量：10 μL。色譜圖見圖1。

2.3 方法學(xué)考察

2.3.1 線性關(guān)系考察 分別精密量取“2.1.1”項(xiàng)下制備的各對(duì)照品貯備液0.05、0.1 、0.2、0.4 、0.6、0.8、1、1.2 mL，置于10 mL 容量瓶中，加甲醇稀釋至刻度。分別精密吸取10 μL，注入液相色譜儀，以濃度（X，μg/mL）為橫坐標(biāo)，峰面積（Y）為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，結(jié)果見表2。結(jié)果表明，升麻素苷、升麻素、5-O- 甲基維斯阿米醇苷和亥茅酚苷在各自濃度范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。

表2 色原酮成分的線性關(guān)系考察結(jié)果Tab.2 Investigation results of linear relationship of chromone components

2.3.2 精密度試驗(yàn) 精密吸取“2.1.1”項(xiàng)下制備的溶液，重復(fù)進(jìn)樣6 次，進(jìn)樣量10 μL。升麻素苷、升麻素、5-O- 甲基維斯阿米醇苷、亥茅酚苷峰面積的RSD 值分別為1.35%、1.63%、1.25%、1.67%，均小于2.0%，表明該儀器精密度良好。

2.3.3 重復(fù)性試驗(yàn) 取42 號(hào)防風(fēng)樣品粉末，按“2.1.2”項(xiàng)下方法平行制備6 份供試品溶液，并按“2.2”項(xiàng)下的進(jìn)樣條件進(jìn)行測(cè)定，升麻素苷、升麻素、5-O- 甲基維斯阿米醇苷、亥茅酚苷含量的RSD 分別為0.28%、2.75%、1.07%、2.79%，均小于3.0%，表明該方法重復(fù)性良好。

2.3.4 穩(wěn)定性試驗(yàn) 取42 號(hào)防風(fēng)樣品粉末，按“2.1.2”項(xiàng)下方法制成供試品溶液，在室溫放置12 h，分別于0、3、6、9 和12 h 進(jìn)行測(cè)定。升麻素苷、升麻素、5-O- 甲基維斯阿米醇苷、亥茅酚苷峰面積的RSD 分別為1.76%、1.78%、0.79%、1.64%，均小于3.0%，表明供試品溶液在12 h 內(nèi)穩(wěn)定。

2.3.5 加樣回收率試驗(yàn) 取9 號(hào)防風(fēng)樣品粉末，分別添加升麻苷、升麻素、5-O- 甲基維斯阿米醇苷、亥茅酚苷對(duì)照品，按“2.1.2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，按“2.2”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，記錄色譜峰面積并計(jì)算加樣回收率，結(jié)果見表3，表明該方法回收率良好。

表3 加樣回收率試驗(yàn)結(jié)果（mg，n = 6）Tab.3 Result of sample recovery tests（mg，n = 6）

2.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 26.0 軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)和分析，對(duì)其進(jìn)行聚類分析、Pearson 相關(guān)性分析。以P＜0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

3 結(jié)果

3.1 色原酮成分含量測(cè)定

3.1.1 色原酮成分含量測(cè)定結(jié)果 精密稱定防風(fēng)藥材粉末適量，按“2.1.2”項(xiàng)下制備供試品溶液，后按“2.2”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，記錄色譜峰面積并計(jì)算樣品含量。結(jié)果見表4。

表4 防風(fēng)色原酮含量測(cè)定結(jié)果（mg/g，n = 3）Tab.4 Determination results of Radix Saposhnikoviae chromone content（mg/g ，n = 3）

所收集的42 份防風(fēng)樣品中，齊齊哈爾泰來縣所產(chǎn)的4 年生防風(fēng)色原酮總含量最高，為22.29 mg/g，佳木斯市望江郊區(qū)3 年生防風(fēng)色原酮總含量最低，僅為4.10 mg/g。

3.1.2 防風(fēng)色原酮含量分布情況 2020 年版《中國藥典》（一部）中規(guī)定升麻素苷和5-O- 甲基維斯阿米醇苷的總量不得少于0.24%，即2.4 mg/g。以2.4 mg/g 為一個(gè)單位，對(duì)42 批防風(fēng)中升麻苷和5-O- 甲基維斯阿米醇苷的總量進(jìn)行統(tǒng)計(jì)，結(jié)果有36 批藥材兩種成分總量超過0.48%，是《中國藥典》限度的2倍(占檢測(cè)份數(shù)的85.7%)；30 批藥材兩種成分總量超過0.72%，是《中國藥典》限度的3 倍(占檢測(cè)份數(shù)的71.4%)；有14 批藥材兩種成分總量超過0.96%，是《中國藥典》限度的4 倍(占檢測(cè)份數(shù)的33.3%)；最高含量是《中國藥典》限度的7.8 倍；另從升麻素苷、5-O- 甲基維斯阿米醇苷、升麻素和亥茅酚苷四種成分的總量分析，也具有相同的分布趨勢(shì)，見表5。

表5 42 批防風(fēng)色原酮含量分布表Tab.5 Distribution of content of 42 batches of Radix Saposhnikoviae chromone

3.2 聚類分析結(jié)果

使用SPSS 26.0 軟件對(duì)42 批藥材測(cè)定結(jié)果通過歐式距離平方計(jì)算樣品間相似系數(shù)，用平均聯(lián)接（組間）聚類分析，結(jié)果見圖2。42 批樣品一共分為2 大類，其中，32、40 號(hào)樣品為一類，其余均屬于另一類。當(dāng)閾值λ= 5 時(shí)，每一大類又分為兩小類，其中，12 ～14、19、23、27、29、3、37、42 號(hào)防風(fēng)樣品為第二類群；32 號(hào)樣品為第三類群、40 號(hào)樣品為第四類群；其余的防風(fēng)樣品均歸屬于第一類群。

圖2 42 批不同產(chǎn)地防風(fēng)藥材中4 種色原酮成分含量聚類分析樹狀圖Fig.2 Cluster analysis dendrogram of the contents of four chromones in 42 batches of Radix Saposhnikoviae materials from different origins

3.3 土壤因素對(duì)防風(fēng)中色原酮含量的影響

根據(jù)Pearson 相關(guān)性分析得出，土壤因素與升麻素苷、5-O- 甲基維斯阿米醇苷、色原酮總含量之間的相關(guān)系數(shù)分別為0.348（Sig = 0.000）、0.241（Sig =0.007）、0.302（Sig = 0.001），均呈現(xiàn)出0.01 水平的極顯著差異，這一結(jié)果表明升麻素苷成分及5-O- 甲基維斯阿米醇苷成分及色原酮總成分與土壤因素之間具有極顯著的正相關(guān)關(guān)系，但土壤因素對(duì)于升麻素及亥茅酚苷的影響并不顯著。土壤對(duì)于色原酮總含量影響均顯示沙土（平均含量為11.417 1±4.755 5 mg/g）優(yōu)于火山灰土（平均含量為10.030 0±0.252 4 mg/g），顯著優(yōu)于黑土（平均含量為8.638 7±3.123 5 mg/g）（P＜0.05）。不同土壤類型的物理結(jié)構(gòu)影響著植物根系的生長發(fā)育，一般土壤砂性越強(qiáng)，越容易造成干旱的環(huán)境，而干旱通常是影響藥材質(zhì)量的主要因素，這可能是沙質(zhì)土壤含量高的本質(zhì)原因[6]。

3.4 生長年限對(duì)防風(fēng)中色原酮含量的影響

5-O- 甲基維斯阿米醇苷、升麻素、色原酮總含量與生長年限的相關(guān)性系數(shù)分別為0.347（Sig =0.000）、0.319（Sig = 0.001）、0.339（Sig = 0.001），結(jié)果表明不同生長年限下的防風(fēng)其5-O- 甲基維斯阿米醇苷含量、升麻素含量以及色原酮總含量存在極顯著差異（P＜0.01），且與生長年限這一因素均存在正相關(guān)性；升麻素苷含量、亥茅酚苷含量與生長年限的相關(guān)性系數(shù)為0.213（Sig = 0.034）、0.226（Sig =0.024），兩者與生長年限因素均存在0.05 水平上的弱相關(guān)關(guān)系。上述結(jié)果表明，生長年限這一因素對(duì)于防風(fēng)品質(zhì)的影響還是較為重要的，根據(jù)不同年限下防風(fēng)的色原酮總含量進(jìn)行排序?yàn)?年生＞3年生＞2年生。

3.5 種質(zhì)對(duì)防風(fēng)中色原酮含量的影響

種質(zhì)因素也是影響藥材質(zhì)量的重要原因之一[7]。本試驗(yàn)分析得出，5-O- 甲基維斯阿米醇苷、亥茅酚苷含量與種質(zhì)因素的相關(guān)性系數(shù)分別為為0.325（Sig = 0.000）和0.240（Sig = 0.007），說明種質(zhì)因素對(duì)這兩種成分含量的影響極為顯著，而且均表現(xiàn)為關(guān)防風(fēng)含量明顯高于水防風(fēng)（P＜0.01），但種質(zhì)因素對(duì)升麻素苷及升麻素成分含量的影響差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。種質(zhì)因素與色原酮總含量之間的相關(guān)系數(shù)為0.224（Sig = 0.012），表明種質(zhì)因素對(duì)色原酮總含量具有明顯影響（P＜0.05）。

3.6 生產(chǎn)方式對(duì)防風(fēng)中色原酮含量的影響

3.6.1 栽培方法對(duì)防風(fēng)色原酮含量的影響 升麻素苷含量與栽培方式的相關(guān)性系數(shù)為0.211（Sig =0.026）；5-O- 甲基維斯阿米醇苷含量與栽培方式的相關(guān)性系數(shù)為0.321（Sig = 0.001）；色原酮總含量與栽培方式的相關(guān)性系數(shù)為0.296（Sig = 0.002）。說明5-O- 甲基維斯阿米醇苷及色原酮總含量與栽培方式具有極顯著性弱相關(guān)（P＜0.01），升麻素苷、色原酮總含量與栽培方式具有顯著性弱相關(guān)（P＜0.05），均為直播方式下的成分含量較高。

有研究表明，移栽防風(fēng)中色原酮含量為直播防風(fēng)的2 倍[8]，本研究中的試驗(yàn)結(jié)果與之前文獻(xiàn)中的結(jié)論不同，分析原因可能是本試驗(yàn)中的防風(fēng)為主根，而之前研究中的防風(fēng)樣品包括了含量較高的側(cè)根。側(cè)根韌皮部比例較大，側(cè)根中的有效成分含量通常較高[9-10]，研究顯示移栽防風(fēng)側(cè)根（升麻素苷0.806%，5-O- 甲基維斯阿米醇苷0.573%）的含量顯著高于全根（升麻素苷0.453%，5-O- 甲基維斯阿米醇苷0.452%）[11]，由此可以推斷防風(fēng)側(cè)根的含量高于主根。在此次試驗(yàn)中，有4 份樣本為河北防風(fēng)，河北秧播防風(fēng)中升麻素苷含量約為直播防風(fēng)，而升麻素及亥茅酚苷的含量則是直播高于秧播，其中就升麻素含量而言直播防風(fēng)約為秧播防風(fēng)的2 倍。

3.6.2 野生與栽培防風(fēng)色原酮含量的差異 前期研究表明，野生防風(fēng)藥材較栽培品防風(fēng)質(zhì)量佳[12-13]，但本次研究中，有些野生防風(fēng)中色原酮總含量并不高于栽培品，甚至低于4 年生的栽培防風(fēng)。就升麻素苷而言，春季采收防風(fēng)中的含量(7.16 ± 0.29 )mg/g高于夏季(3.33 ± 0.34 )mg/g (P＜0.01);春季采收防風(fēng)色原酮含量（12.64 ± 0.45） mg/g 較夏季采收的防風(fēng)色原酮含量(7.25 ± 0.87) mg/g 同樣有極顯著性差異(P＜0.01)。5-O- 甲基維斯阿米醇苷是防風(fēng)藥材中含量較高的色原酮成分，目前仍作為防風(fēng)質(zhì)量的評(píng)價(jià)指標(biāo)，但研究顯示該成分在腸道和血液中極不穩(wěn)定，很快分解[14]，因此，5-O- 甲基維斯阿米醇苷并不適合作為防風(fēng)藥材質(zhì)量的指標(biāo)。以往研究顯示，升麻素苷具有較強(qiáng)的藥理作用，野生防風(fēng)化學(xué)成分特征是升麻素苷比例較高，升麻素苷與5-O- 甲基維斯阿米醇苷二者的比值為1.29 : 1，而栽培防風(fēng)的比值為0.29 :1[12]。如果去除5-O- 甲基維斯阿米醇苷成分含量，春季采收防風(fēng)色原酮含量（8.753 3 ± 0.442 6 mg/g）顯著高于夏季(3.898 3 ± 0.509 4) mg/g（P＜0.01），特別是活性更高的升麻素和亥茅酚苷尤為顯著。黑龍江省防風(fēng)主產(chǎn)區(qū)春季氣候干旱，夏季多雨，而且傳統(tǒng)上野生防風(fēng)的采收季節(jié)主要是春季，這可能是野生防風(fēng)質(zhì)量佳的主要因素。

4 討論

本研究的聚類分析結(jié)果表明，黑龍江省所產(chǎn)防風(fēng)的質(zhì)量與產(chǎn)地存在一定關(guān)系，產(chǎn)于黑龍江省西南部的防風(fēng)藥材質(zhì)量多優(yōu)于黑龍江省東部及河北省所產(chǎn)的防風(fēng)質(zhì)量，大慶市與齊齊哈爾市產(chǎn)區(qū)在質(zhì)量上更為接近，而佳木斯市、雙鴨山市種植出的防風(fēng)質(zhì)量更為接近，黑河市防風(fēng)質(zhì)量差異不大，但是大慶市區(qū)與大慶市林甸縣所產(chǎn)防風(fēng)分屬不同類群，質(zhì)量有一定差異，分析可能是由于大慶林甸縣產(chǎn)區(qū)具有道地產(chǎn)區(qū)優(yōu)勢(shì)，其土質(zhì)等外在環(huán)境適宜防風(fēng)藥材生長。

防風(fēng)作為我國藥材市場(chǎng)流通的大宗藥材，也是東北地區(qū)的重要代表藥材之一，其中，升麻素苷和5-O-甲基維斯阿米醇苷因其含量較高故作為2020 年版《中國藥典》規(guī)定的含量測(cè)定指標(biāo)。有效成分的藥效是由化合物的主要活性基團(tuán)決定的，升麻素為升麻素苷的苷元，較升麻素苷多一個(gè)-OH，而且升麻素缺少親水性葡萄糖基，更易透過細(xì)胞膜而被吸收入血，因此生物利用度也較高，其藥理作用約是升麻素苷的4 倍左右[15]。亥茅酚苷也比升麻素苷多1 個(gè)-OH，具有顯著的抗炎、鎮(zhèn)痛療效[16]，因此在試驗(yàn)中同樣將這兩種色原酮成分作為探究對(duì)象。本研究結(jié)果表明，防風(fēng)中的升麻素含量與采收季節(jié)以及生長年限具有一定關(guān)系，而亥茅酚苷的含量與種質(zhì)、生長年限等因素相關(guān)聯(lián)。防風(fēng)藥材品質(zhì)形成過程中影響因素眾多[17]。為了獲得質(zhì)量穩(wěn)定、療效可靠的防風(fēng)藥材，有必要綜合土壤、種質(zhì)以及生產(chǎn)方式等多方面因素進(jìn)行考量，從而保證用藥的安全與療效。

5 結(jié)論

本試驗(yàn)對(duì)于42 批防風(fēng)藥材進(jìn)行含量測(cè)定，在先前的色譜條件基礎(chǔ)上作了進(jìn)一步優(yōu)化，該方法穩(wěn)定性、重復(fù)性及重現(xiàn)性均良好，在此基礎(chǔ)上結(jié)合聚類分析及多成分同時(shí)測(cè)定，協(xié)同多指標(biāo)定量評(píng)價(jià)，不僅為防風(fēng)藥材兩種不同基原(關(guān)防風(fēng)、水防風(fēng))的特異性、差異性研究提供了科學(xué)依據(jù)，同時(shí)也為防風(fēng)的質(zhì)量控制提供優(yōu)化方案，從而為今后防風(fēng)的生產(chǎn)實(shí)踐以及種質(zhì)開發(fā)提供依據(jù)。