覃川嫻，何澤源，黃清霞，韋建華，馮 旭

（1.廣西中醫(yī)藥大學(xué) 藥學(xué)院，廣西 南寧530200；2.廣西高校中藥提取純化與質(zhì)量分析重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣西 南寧530200）

斜葉黃檀Dalbergia pinnata(Lour.) Prain 為豆科黃檀屬植物，又名羽葉檀、羅望子葉黃檀、斜葉檀，主產(chǎn)于海南、廣西、云南及西藏等地區(qū)。最早收錄于《云南藥用植物名錄》，記載其根可消炎解毒、截瘧、治瘧疾[1]?！吨袊参镏尽分杏涊d其“全株藥用，治風(fēng)濕、跌打、扭挫傷，有消腫止痛之效”[2]。我國海南、云南等民間將其外用于跌打損傷、刀傷、燙傷等，亦可內(nèi)服用于治療心血管疾病和糖尿病等疾病，具有悠久的民間藥用歷史[3]。現(xiàn)代研究表明，斜葉黃檀中主要含有黃酮類、揮發(fā)油類、甾醇類及三萜類等成分[4-6]，具有抗炎、抗氧化、抗菌、褪黑等作用[7-8]。

目前有關(guān)斜葉黃檀的研究報(bào)道較少，主要集中在品種鑒定、化學(xué)成分分析以及藥理作用等方面。在質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)研究方面，有學(xué)者對(duì)斜葉黃檀進(jìn)行性狀、顯微鑒別，并利用薄層色譜法、氣相色譜法等對(duì)斜葉黃檀中的揮發(fā)油進(jìn)行檢測(cè)分析，但未對(duì)其他成分進(jìn)行研究[9]。本研究采用HPLC 法建立斜葉黃檀指紋圖譜并同時(shí)測(cè)定原兒茶酸、桂皮鞣質(zhì)B1、芒柄花素-7-O-β-D-呋喃芹糖基-(1 →6)-β-D-吡喃葡萄糖苷和芒柄花素4 種成分的含量，以期為斜葉黃檀的質(zhì)量控制提供一定的參考依據(jù)。

1 儀器與材料

1.1 儀器

Agilent 1260 型高效液相色譜儀（VWD 檢測(cè)器，美國安捷倫科技公司）；Agilent 1100 Series 型高效液相色譜儀（DAD 檢測(cè)器，美國安捷倫科技公司）；XSR205 型電子天平[梅特勒-托利多儀器（上海）有限公司]。

1.2 試藥與試劑

原 兒 茶 酸（ 純 度＞98%， 批 號(hào)：GR-138-011006）、芒柄花素（純度＞98%，批號(hào)：GR-138-024504）均購于南京廣潤生物制品有限公司；桂皮鞣質(zhì)B1（純度＞98%，批號(hào)：20221013）購于成都草源康生物科技有限公司；芒柄花素-7-O-β-D-呋喃芹糖基-(1 →6)-β-D-吡喃葡萄糖苷（歸一化法計(jì)算純度＞98%）為實(shí)驗(yàn)室自制。乙腈、甲醇均為色譜純，其他試劑為分析純，水為超純水。10 批斜葉黃檀藥材經(jīng)廣西中醫(yī)藥大學(xué)中藥鑒定教研室廖月葵高級(jí)實(shí)驗(yàn)師鑒定，均為豆科黃檀屬植物斜葉黃檀Dalbergia pinnata(Lour.) Prain 的根莖。陰干，打粉，過二號(hào)篩。藥材來源見表1。

表1 斜葉黃檀藥材來源Tab.1 Source of Dalbergia pinnata (Lour.) Prain medicine

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件

Inertsil ODS-3 色譜柱（4.6 mm×250 mm，5 μm）；流動(dòng)相為乙腈（A）-0.1%磷酸水溶液（B），梯度洗脫（0 ～ 18 min，10% → 13%A；18 ～ 23 min，13% →15%A；23 ～ 43 min，15% →19%A；43 ～ 67 min，19% →25%A；67 ～ 112 min，25% →45%A）；流速為1.0 mL/min；檢測(cè)波長為254 nm；柱溫為25℃；進(jìn)樣量為10 μL。

2.2 供試品溶液的制備

取斜葉黃檀藥材1 g，精密稱定，精密加入55%乙醇10 mL，超聲處理70 min，用55%乙醇補(bǔ)重，搖勻，取續(xù)濾液，即得。

2.3 混合對(duì)照品溶液的制備

精密稱取各對(duì)照品適量，用甲醇溶解并定容，制成每毫升含原兒茶酸3.94 μg、桂皮鞣質(zhì)B1 1 108.29 μg、芒柄花素-7-O-β-D-呋喃芹糖基-(1 →6)-β-D-吡喃葡萄糖苷223.85 μg、芒柄花素8.56 μg的溶液。

2.4 斜葉黃檀指紋圖譜研究

2.4.1 精密度試驗(yàn) 取同一批斜葉黃檀藥材粉末（S1），制成供試品溶液，按“2.1”項(xiàng)下條件連續(xù)進(jìn)樣6 次，以5 號(hào)峰（桂皮鞣質(zhì)B1）為參照峰，計(jì)算得各共有峰相對(duì)保留時(shí)間和相對(duì)峰面積RSD 分別小于0.33%和2.2%，表明儀器精密度良好。

2.4.2 穩(wěn)定性試驗(yàn) 取同一批斜葉黃檀藥材粉末（S1），制成供試品溶液，分別于0、2、4、8、12、24 h，按“2.1”項(xiàng)下條件進(jìn)樣測(cè)定，以5 號(hào)峰（桂皮鞣質(zhì)B1）為參照峰，計(jì)算得各共有峰相對(duì)保留時(shí)間和相對(duì)峰面積RSD 分別小于0.99%和2.8%，表明供試品溶液在24 h 內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.4.3 重復(fù)性試驗(yàn) 取同一批斜葉黃檀藥材粉末（S1）6 份，制成供試品溶液，按“2.1”項(xiàng)下條件進(jìn)樣測(cè)定，以5 號(hào)峰（桂皮鞣質(zhì)B1）為參照峰，計(jì)算得各共有峰相對(duì)保留時(shí)間和相對(duì)峰面積RSD 分別小于0.28%和2.8%，表明該方法重復(fù)性良好。

2.4.4 指紋圖譜的建立 取10 批斜葉黃檀藥材，制成供試品溶液，按“2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，將10 批斜葉黃檀藥材所得圖譜導(dǎo)入“中藥色譜指紋圖譜相似度評(píng)價(jià)系統(tǒng)（2012 版）”，以S1 斜葉黃檀藥材圖譜為參照?qǐng)D譜，生成10 批斜葉黃檀藥材的疊加圖譜，確定了13 個(gè)共有峰，并通過對(duì)照品保留時(shí)間和紫外光譜對(duì)比，確認(rèn)了1、5、10、13 號(hào)峰分別為原兒茶酸、桂皮鞣質(zhì)B1 、芒柄花素-7-O-β-D-呋喃芹糖基-(1→6)-β-D-吡喃葡萄糖苷和芒柄花素，見圖1、2。

圖1 10 批斜葉黃檀供試品疊加色譜圖Fig.1 Superimposed chromatograms of 10 batches of Dalbergia pinnata (Lour.) Prain samples

圖2 混合對(duì)照品(A)和斜葉黃檀供試品(B)色譜圖Fig.2 HPLC of mixed reference substance(A) and Dalbergia pinnata (Lour.) Prain sample(B)

2.4.5 相似度評(píng)價(jià) 以5 號(hào)峰（桂皮鞣質(zhì)B1）為參照峰，計(jì)算得各共有峰相對(duì)保留時(shí)間見表2，相對(duì)峰面積見表3。10 批斜葉黃檀藥材的相似度分別為0.990、0.990、0.993、0.967、0.983、0.990、0.994、0.997、0.995、0.990。

表2 共有峰相對(duì)保留時(shí)間Tab.2 Relative retention time of common peaks

表3 共有峰相對(duì)峰面積Tab.3 Relative peak area of common peaks

2.4.6 聚類分析 將10 批次斜葉黃檀藥材13 個(gè)共有峰的峰面積從中藥相似度軟件導(dǎo)出，整理后導(dǎo)入SPSS（21 版）軟件進(jìn)行聚類分析，結(jié)果見圖3。10批斜葉黃檀藥材以10 平方歐氏距離為準(zhǔn)可細(xì)分至三類：S6 單獨(dú)為第一類；S5、S9 為第二類；S1 ～ S4、S7、S8、S10 為第三類。表明不同產(chǎn)地的斜葉黃檀共有峰含量之間存在一定的差異。

圖3 聚類分析圖Fig.3 Cluster analysis diagram

2.4.7 主成分分析 以10 批次斜葉黃檀藥材的13個(gè)共有峰峰面積為變量，使用SPSS（21 版）軟件進(jìn)行主成分分析，提取得到3 個(gè)主成分，累積方差貢獻(xiàn)率為89.943%，見表4。載荷矩陣結(jié)果顯示，色譜峰5（桂皮鞣質(zhì)B1）、色譜峰8、色譜峰9 在主成分1 上有較高載荷；色譜峰2 在主成分2 上有較高載荷；色譜峰10（芒柄花素-7-O-β-D-呋喃芹糖基-(1 →6)-β-D-吡喃葡萄糖苷）、色譜峰13（芒柄花素）在主成分3 上有較高載荷。建立以主成分1、2、3 的空間散點(diǎn)坐標(biāo)系得PCA 得分圖，其結(jié)果與聚類分析（以10 平方歐氏距離）相一致，見圖4。

圖4 PCA 得分圖Fig.4 PCA score chart

表4 主成分的初始特征值和貢獻(xiàn)率Tab.4 Principal component analysis of eigenvalue and variance contribution rate of samples

2.5 斜葉黃檀含量測(cè)定研究

2.5.1 線性關(guān)系考察及檢測(cè)限、定量限 取不同體積的混合對(duì)照品溶液，用甲醇配制成不同的濃度，按“2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，以對(duì)照品濃度作為橫坐標(biāo)，峰面積作為縱坐標(biāo)建立各成分的線性回歸方程；逐級(jí)稀釋標(biāo)準(zhǔn)品溶液，按信噪比（S/N=3）計(jì)算各成分的檢測(cè)限；按信噪比（S/N=10）計(jì)算各成分的定量限。結(jié)果見表5。

表5 4 種成分的線性關(guān)系及檢測(cè)限、定量限Tab.5 Linearity of 4 components and LOD， LOQ

2.5.2 精密度試驗(yàn) 取“2.3”項(xiàng)下混合對(duì)照品溶液連續(xù)6 次進(jìn)樣，計(jì)算得到原兒茶酸、桂皮鞣質(zhì)B1、芒柄花素-7-O-β-D-呋喃芹糖基-(1 →6)-β-D-吡喃葡萄糖苷、芒柄花素各成分峰面積RSD分別為0.96%、0.18%、0.68%、0.48%，表明儀器精密度良好。

2.5.3 穩(wěn)定性試驗(yàn) 同“2.4.2”項(xiàng)下方法，計(jì)算得到原兒茶酸、桂皮鞣質(zhì)B1、芒柄花素-7-O-β-D-呋喃芹糖基-(1 →6)-β-D-吡喃葡萄糖苷、芒柄花素各成分峰面積RSD 分別為1.10%、0.40%、0.51%、0.44%，表明該方法在24 h 內(nèi)基本穩(wěn)定。

2.5.4 重復(fù)性試驗(yàn) 同“2.4.3”項(xiàng)下方法，計(jì)算得到原兒茶酸、桂皮鞣質(zhì)B1、芒柄花素-7-O-β-D-呋喃芹糖基-(1 →6)-β-D-吡喃葡萄糖苷、芒柄花素各成分含量RSD 分別為1.60%、1.20%、0.75%、0.46%，表明該方法重復(fù)性良好。

2.5.5 加樣回收率試驗(yàn) 取已知各成分含量的斜葉黃檀粉末（S1）6 份，每份約0.5 g，精密稱定，大約按1 : 1 比例加入混合對(duì)照品溶液，按“2.2”項(xiàng)下方法制備，按“2.1”項(xiàng)下條件測(cè)定，計(jì)算得到原兒茶酸、桂皮鞣質(zhì)B1、芒柄花素-7-O-β-D-呋喃芹糖基-(1 →6)-β-D-吡喃葡萄糖苷、芒柄花素各成分平均加樣回收率分別為103.79%、103.26%、96.22%、104.06%，RSD 分別為1.2%、1.3%、2.8%、1.2%，結(jié)果表明方法準(zhǔn)確可行。結(jié)果見表6。

表6 斜葉黃檀中4 種成分加樣回收試驗(yàn)結(jié)果（n = 6）Tab.6 Recovery experiment of 4 components in Dalbergia pinnata (Lour.) Prain by sample addition(n = 6)

2.5.6 樣品含量測(cè)定 取10 批斜葉黃檀藥材制備成供試品溶液，分別測(cè)定，計(jì)算各產(chǎn)地原兒茶酸、桂皮鞣質(zhì)B1、芒柄花素-7-O-β-D-呋喃芹糖基-(1 →6)-β-D-吡喃葡萄糖苷、芒柄花素成分的含量，結(jié)果見表7。

表7 10 批斜葉黃檀中4 個(gè)成分的測(cè)定結(jié)果（μg/g, n = 3）Tab.7 Measurement results of 4 components in the 10 batches of Dalbergia pinnata (Lour.) Prain (μg/g, n = 3)

3 討論

本研究采用HPLC-DAD 進(jìn)行全波長掃描發(fā)現(xiàn)，在254 nm 波長下原兒茶酸、桂皮鞣質(zhì)B1、芒柄花素-7-O-β-D-呋喃芹糖基-(1 →6)-β-D-吡喃葡萄糖苷和芒柄花素均有較強(qiáng)的紫外吸收，色譜峰峰型較好且雜峰干擾較少，因此確定254 nm 為檢測(cè)波長。并對(duì)不同流動(dòng)相（甲醇-0.1%磷酸、乙腈-0.1%磷酸、乙腈-0.2%磷酸、乙腈-0.1%甲酸、乙腈-0.1%乙酸）、色譜柱（Inertsil 柱、Waters 柱、Phenomenex 柱、FeniGen 柱）、柱溫（20、25、30、35、40℃）、流速（0.8、1.0、1.2 mL/min）、進(jìn)樣量（5、10、15 μL）進(jìn)行考察，結(jié)果發(fā)現(xiàn)采用Inertsil ODS-3 色譜柱（4.6 mm ×250 mm，5 μm），以乙腈-0.1%磷酸水溶液為流動(dòng)相，流速：1.0 mL/min，柱溫：25℃，進(jìn)樣量：10 μL，所得色譜峰的分離效果最好。

本研究建立的10 批斜葉黃檀HPLC 指紋圖譜，相似度均大于0.900，由于本實(shí)驗(yàn)收集的斜葉黃檀藥材均來自廣西地區(qū)，表明該地區(qū)斜葉黃檀藥材質(zhì)量差異較小，藥材質(zhì)量總體較為穩(wěn)定。聚類分析和主成分分析結(jié)果顯示，10 批次斜葉黃檀以10 平方歐氏距離為準(zhǔn)可分至三類，表明不同產(chǎn)地的斜葉黃檀共有峰含量之間存在一定的差異，可能受生長環(huán)境、生長年限、采收期等影響。

根據(jù)10 批不同產(chǎn)地斜葉黃檀的含量測(cè)定結(jié)果分析，廣西區(qū)內(nèi)不同產(chǎn)地斜葉黃檀中的原兒茶酸、桂皮鞣質(zhì)B1、芒柄花素-7-O-β-D-呋喃芹糖基-(1 →6)-β-D-吡喃葡萄糖苷和芒柄花素含量存在一定的差異。其中，不同產(chǎn)地的斜葉黃檀藥材中4 種成分均以桂皮鞣質(zhì)B1 的含量最高，均占其總含量的70%以上，推測(cè)桂皮鞣質(zhì)B1 含量對(duì)斜葉黃檀藥材質(zhì)量影響較大，可考慮作為評(píng)價(jià)斜葉黃檀藥材質(zhì)量的指標(biāo)之一。

4 結(jié)論

本研究建立的斜葉黃檀HPLC 指紋圖譜以及對(duì)原兒茶酸、桂皮鞣質(zhì)B1、芒柄花素-7-O-β-D-呋喃芹糖基-(1 →6)-β-D-吡喃葡萄糖苷和芒柄花素4種成分的含量測(cè)定方法，能有效分析不同產(chǎn)地的斜葉黃檀藥材的質(zhì)量差異，為進(jìn)一步研究其藥效關(guān)系和質(zhì)量控制提供參考。但研究所用的斜葉黃檀均來源于廣西地區(qū)，存在樣品批次較少、代表性不夠等問題，后續(xù)可將其有效成分作為指標(biāo)對(duì)其他地區(qū)斜葉黃檀進(jìn)行研究，進(jìn)而為斜葉黃檀藥材的質(zhì)量控制提供依據(jù)。