劉萬路

威海海洋職業(yè)學院，山東 威海 264300

染料木素又稱染料木黃酮，屬于異黃酮類化合物，可從葛根、三葉草、槐角、山豆根等植物中提取得到[1]，該成分具有抗腫瘤、降血糖、抗菌、抗動脈粥樣硬化等活性[2-4]。研究表明[5]，口服染料木素基本無毒副作用，安全性高，具備開發(fā)及臨床使用價值[1]。染料木素溶解度僅為（3.07±0.01）mg/L[6]，油水分配系數(shù)（lgP）為1.45[7]，屬于生物藥劑學分類系統(tǒng)中II 類藥物[6]。染料木素胃腸道內(nèi)易被代謝[8]，穩(wěn)定性差，絕對生物利用度僅為6.8%[9]，嚴重影響藥效及臨床應用。目前染料木素制劑研究報道有包合物[10]、固體分散體[11]、自微乳[12]等，但包合物或固體分散體在改善藥物生物利用度或藥效等方面低于納米制劑[13]，而染料木素納米自微乳處方中存在大量表面活性劑，安全性存疑，故需要開發(fā)一種安全性好、生物利用度高的染料木素納米制劑。

普通脂質(zhì)體是一種具有磷脂雙層分子層結(jié)構(gòu)、類生物膜的納米囊泡，可在一定程度上提高生物利用度[14-17]。但普通脂質(zhì)體易受胃腸道pH 值、各種酶及膽鹽破壞[18]，從而發(fā)生乳化、水解等，導致藥物泄露，因此對脂質(zhì)體表面修飾是提高體內(nèi)穩(wěn)定性及儲存穩(wěn)定性的有效方法[18-19]。殼聚糖具有良好生物可降解性和生物相容性，其正電荷可與帶負電荷的脂質(zhì)體表面相互作用，進而實現(xiàn)有效包覆[20]。但殼聚糖的酸膨脹性和堿不溶性容易導致殼聚糖包覆脂質(zhì)體結(jié)構(gòu)不穩(wěn)定[21]，為解決殼聚糖修飾脂質(zhì)體的缺陷，本研究利用白蛋白負電荷性質(zhì)與殼聚糖正電性進行靜電組裝[22]，進一步修飾脂質(zhì)體，進而實現(xiàn)雙層修飾，賦予脂質(zhì)體更好的生物相容性、結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性及緩釋效果。

Box-Behnken 設計-響應面法（Box Behnken design-response surface method，BBD-RSM）作為一種工藝優(yōu)化工具，具有精確、高效等特點。本研究采用BBD-RSM 優(yōu)化染料木素脂質(zhì)體（genistein liposomes，Gen-Lip）處方，并進一步制備成殼聚糖包覆染料木素脂質(zhì)體（chitosan-coated genistein liposomes，CS-Gen-Lip）和牛血清白蛋白/殼聚糖雙層包覆染料木素脂質(zhì)體（bovine serum albumin/chitosan-coated genistein liposomes，BSA/CS-Gen-Lip），示意圖見圖1。對BSA/CS-Gen-Lip 凍干粉中藥物晶型、體外釋藥行為、儲存穩(wěn)定性等進行考察，并以染料木素原料藥為參考，比較BSA/CS-Gen-Lip相對口服生物利用度，為下一步研究工作奠定基礎。

圖1 BSA/CS-Gen-Lip 制備工藝示意圖Fig. 1 Schematic diagram of BSA/CS-Gen-Lip preparation

1 儀器與材料

1.1 儀器

1200 型高效液相色譜儀（HPLC），美國Agilent公司；RE-52AA 型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀，紹興上虞艾科儀器設備有限公司；MS205DU 型電子分析天平，美國Mettler Toledo 公司；RC12A 型溶出試驗儀，上海滬粵明科學儀器有限公司；Mastersizer 3000E 型動態(tài)光散射粒度儀，英國馬爾文公司；CU-600 型電熱恒溫水浴鍋，上海福瑪實驗設備有限公司；SH-2 型磁力攪拌器，常州市億能實驗儀器廠；JEM-2010F 型透射電鏡（TEM），日本日立株式會社；D8 Advance型X 射線粉末衍射儀，瑞士布魯克公司；NEC160-2A 型氮氣吹掃儀，山東星辰科技有限公司；DWFL450 型超低溫冰箱，上海沛升儀器設備有限公司；FD-1D-80 型冷凍干燥機，上海賀帆儀器有限公司。

1.2 材料與動物

染料木素對照品，批號K18642，質(zhì)量分數(shù)98.9%，西安開來生物工程有限公司；磺胺甲噁唑，批號100025-200904，質(zhì)量分數(shù)99.6%，中國食品藥品檢定研究院；磷脂，批號20200811，上海輔必成醫(yī)藥科技有限公司；膽固醇，批號20200719，克拉瑪爾公司；殼聚糖，批號20210714，相對分子質(zhì)量100 000，上海阿拉丁生化科技股份有限公司；染料木素原料藥（批號200528，質(zhì)量分數(shù)97.1%）、牛血清白蛋白（批號20221106），湖北帝柏化工有限公司；乳糖，批號20191105，國藥集團化學試劑有限公司。

清潔級SD 大鼠，雌雄各半，河南省動物實驗中心［SCXK（豫）2020-0001］，體質(zhì)量為180～220 g。所有動物實驗遵循威海海洋職業(yè)學院有關實驗動物管理和使用的規(guī)定，均符合3R 原則。

2 方法與結(jié)果

2.1 Gen-Lip、CS-Gen-Lip 和BSA/CS-Gen-Lip 制備過程

薄膜分散法制備Gen-Lip[16-17]。精密取染料木素20 mg 和處方量脂質(zhì)載體（磷脂和膽固醇）置于圓底燒瓶中，加入50 mL 的無水乙醇-三氯甲烷（6∶4）溶劑，于50 ℃下磁力攪拌（800 r/min）至溶解澄清，置于45 ℃旋蒸儀中（30 r/min）緩慢除去有機溶劑，即在圓底燒瓶壁上形成均勻薄膜。加入一定pH 值水相溶液50 mL，于一定溫度下磁力攪拌（800 r/min），使之充分水化，超聲15 min（功率為200 W），使用0.45 μm 水膜濾過，即得Gen-Lip 混懸液。加入一定質(zhì)量濃度殼聚糖溶液制備CS-Gen-Lip 混懸液[20]，加入一定質(zhì)量濃度的牛血清白蛋白制備BSA/CS-Gen-Lip 混懸液[22]。空白脂質(zhì)體同法制備（不含染料木素）。

2.2 染料木素含量的測定

2.2.1 色譜條件 色譜柱為Waters C18柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）；柱溫為30 ℃；流動相為甲醇-水（30∶70）；檢測波長為260 nm；體積流量為1.0 mL/min；進樣量為10 μL；理論塔板數(shù)以染料木素計不低于6000。

2.2.2 線性關系考察 精密稱取染料木素對照品20 mg，置于100 mL 量瓶中，加入80 mL 甲醇超聲溶解，靜置10 min，用甲醇稀釋至刻度得200 μg/mL染料木素對照品儲備液。用流動相稀釋配制10.00、5.00、2.00、1.00、0.50、0.02 μg/mL 一系列染料木素對照品溶液，按“2.2.1”項下色譜條件進樣測定染料木素各個質(zhì)量濃度（X）的峰面積（Y），以峰面積對質(zhì)量濃度進行線性回歸，得線性回歸方程Y＝13.682 7X＋0.824 3，r＝0.999 9，結(jié)果表明染料木素在0.02～10.00 μg/mL 線性關系良好。

2.2.3 Gen-Lip、CS-Gen-Lip 和BSA/CS-Gen-Lip 供試品溶液的制備 精密量取Gen-Lip 混懸液1 mL，加至50 mL 容量瓶中，加入40 mL 甲醇超聲5 min后定容，過0.45μm 微孔濾膜（前3 滴棄去）。取5 mL 續(xù)濾液置于10 mL 量瓶中，加入流動相稀釋定容，即得Gen-Lip 供試品溶液。CS-Gen-Lip 和BSA/CS-Gen-Lip 供試品溶液同法制備。

2.2.4 專屬性考察 按“2.2.3”項下方法制備陰性供試品溶液。另取染料木素對照品溶液、Gen-Lip、CS-Gen-Lip、BSA/CS-Gen-Lip 供試品溶液，按“2.2.1”項下色譜條件進樣分析，色譜圖見圖1。發(fā)現(xiàn)該色譜條件專屬性較高。

圖1 空白輔料 (A)、染料木素對照品 (B)、Gen-Lip (C)、CS-Gen-Lip (D)、BSA/CS-Gen-Lip (E) 供試品溶液的HPLC 圖Fig. 1 HPLC of blank excipients (A), genistein reference substance (B), Gen-Lip (C), CS-Gen-Lip (D), BSA/CS-Gen-Lip (E) sample solution

2.2.5 精密度考察 取低、中、高質(zhì)量濃度（0.02、2.00、10.00 μg/mL）染料木素對照品溶液各6 份，按“2.2.1”項下色譜條件進樣分析，測得染料木素峰面積的RSD 分別為0.36%、0.28%、0.20%，表明該儀器精密度良好。

2.2.6 穩(wěn)定性考察 取Gen-Lip、CS-Gen-Lip、BSA/CS-Gen-Lip 供試品溶液，分別于制備后0、2、4、6、12、24 h 進樣測定，計算得染料木素峰面積的RSD 分別為0.92%、1.17%、1.24%，結(jié)果表明3 種供試品溶液穩(wěn)定性均良好。

2.2.7 重復性考察 按照“2.2.3”項下方法分別制備6 份Gen-Lip、CS-Gen-Lip、BSA/CS-Gen-Lip 供試品溶液，按“2.2.1”項下色譜條件進樣分析，測得Gen-Lip、CS-Gen-Lip 和BSA/CS-Gen-Lip 中染料木素質(zhì)量分數(shù)的RSD 分別為1.72%、1.34%、0.96%，表明該方法重復性良好。

2.2.8 加樣回收率考察 精密取9 份體積為0.5 mL的Gen-Lip 混懸液，分別加入染料木素儲備液（質(zhì)量濃度為200 μg/mL）0.5、1.0、1.5 mL 制備供試品溶液，分別平行3 份。CS-Gen-Lip 和BSA/CS-Gen-Lip 同法操作，按“2.2.1”項下色譜條件進樣分析，測得Gen-Lip、CS-Gen-Lip 和BSA/CS-Gen-Lip 中染料木素的平均加樣回收率分別為 99.40%、100.89%、99.79%，RSD 分別為1.47%、0.94%、1.11%，結(jié)果表明該實驗準確度較高。

2.3 包封率、載藥量、粒徑及ζ 電位的測定

精密取Gen-Lip 混懸液2 mL，離心機溫度為4 ℃，于12 500 r/min 離心（離心半徑6.8 cm）30 min。取上清液測定游離染料木素量（記作W1）。按照“2.2.3”項下方法處理樣品，進HPLC 測定染料木素總量（W0）。CS-Gen-Lip 和BSA/CS-Gen-Lip 的W1和W0同法測定，按下式計算包封率和載藥量。

W代表染料木素、脂質(zhì)材料和修飾材料總量

取Gen-Lip、CS-Gen-Lip 和BSA/CS-Gen-Lip 混懸液各0.1 mL，蒸餾水稀釋50 倍，取適量置于比色皿中，于粒徑分析儀上分別測定粒徑、多分散指數(shù)（polydispersity index，PDI）及ζ 電位。

2.4 單因素考察Gen-Lip 處方工藝

2.4.1 脂藥比的考察 固定染料木素投藥量為20 mg，磷脂與膽固醇比例為10∶1，水相pH 值為6.5，水化溫度為40 ℃，水化時間為1.5 h 條件下考察脂藥比的影響，結(jié)果見表1。隨著脂質(zhì)用量增加，Gen-Lip 包封率呈增加后趨穩(wěn)情況，說明磷脂用量對藥物的包載程度是有限的[16]，過多脂質(zhì)用量也會影響Gen-Lip 載藥量。Gen-Lip 粒徑在200～250 nm，PDI值均小于0.3，可見脂藥比對Gen-Lip 包封率和載藥量影響較大，需繼續(xù)優(yōu)化。

表1 脂藥比的考察 (±s, n = 3)Table 1 Investigation of lipid-drug ratio (±s, n = 3)

表1 脂藥比的考察 (±s, n = 3)Table 1 Investigation of lipid-drug ratio (±s, n = 3)

脂藥比 包封率/% 載藥量/% 粒徑/nm PDI 10∶1 40.18±0.89 3.57±0.21 238.53±11.87 0.245±0.037 15∶1 52.84±1.04 3.17±0.15 209.40±10.65 0.214±0.035 20∶1 76.16±1.56 3.78±0.14 214.35±9.14 0.147±0.024 25∶1 77.87±1.33 3.01±0.19 211.17±10.50 0.143±0.020 30∶1 78.23±1.27 2.54±0.12 204.63±8.62 0.194±0.027

2.4.2 磷脂與膽固醇比例的考察 固定染料木素投藥量為20 mg，脂藥比20∶1，水相pH 值為6.5，水化溫度為40 ℃，水化時間為1.5 h 條件下考察磷脂與膽固醇比例的影響，結(jié)果見表2。隨著磷脂比例增加，Gen-Lip 包封率和載藥量均先增加后下降，可能是由于膽固醇比例過大時導致脂質(zhì)體超負荷，影響囊泡結(jié)構(gòu)的形成[17]；膽固醇比例較小時脂質(zhì)體穩(wěn)定性差，藥物易泄露。Gen-Lip 粒徑在200～250 nm，PDI 值均小于0.3，可見磷脂與膽固醇比例對Gen-Lip 包封率和載藥量有較大影響，需繼續(xù)優(yōu)化。

表2 磷脂與膽固醇比例的考察 (±s, n = 3)Table 2 Investigation of phospholipid-cholesterol ratio(±s, n = 3)

表2 磷脂與膽固醇比例的考察 (±s, n = 3)Table 2 Investigation of phospholipid-cholesterol ratio(±s, n = 3)

磷脂與膽固醇比 包封率/% 載藥量/% 粒徑/nm PDI 5∶1 54.75±1.11 2.78±0.24 229.14±13.04 0.257±0.019 7.5∶1 63.91±1.26 3.06±0.16 211.67±9.55 0.208±0.021 10∶1 78.46±1.46 3.72±0.18 207.82±10.61 0.152±0.019 12.5∶1 76.12±1.50 3.60±0.20 206.94±9.74 0.176±0.024 15∶1 70.95±1.79 3.32±0.17 210.58±10.28 0.219±0.018

2.4.3 水相pH 值的考察 固定染料木素投藥量為20 mg，脂藥比20∶1，磷脂與膽固醇比例10∶1，水化溫度為40 ℃，水化時間為1.5 h 條件下考察水相pH 值影響，結(jié)果見表3。隨著水相pH 值的增加Gen-Lip 包封率和載藥量總體呈增加趨勢，可能是由于脂質(zhì)體主要材料在低pH 值中穩(wěn)定性較差，進而影響載藥，但水相pH 值過高時會使Gen-Lip 粒徑和PDI 值增大[23]。綜合考慮，確定pH 值為6.5。

表3 水相pH 值的考察 (±s, n = 3)Table 3 Investigation of aqueous pH value (±s, n = 3)

表3 水相pH 值的考察 (±s, n = 3)Table 3 Investigation of aqueous pH value (±s, n = 3)

水相pH 值 包封率/% 載藥量/% 粒徑/nm PDI 5.5 70.77±1.70 3.38±0.14 209.23±8.95 0.277±0.017 6.0 74.54±1.26 3.56±0.21 214.75±10.24 0.201±0.023 6.5 79.12±1.14 3.80±0.16 208.80±8.46 0.147±0.015 7.0 78.99±1.27 3.74±0.13 234.64±14.15 0.186±0.014

2.4.4 水化溫度的影響 固定染料木素投藥量為20 mg，脂藥比20∶1，磷脂與膽固醇比例10∶1，水相pH 值為6.5，水化時間為1.5 h 條件下考察水化溫度的影響，結(jié)果見表4。隨著水化溫度的升高Gen-Lip 包封率和載藥量呈先增加后下降趨勢，可能是由于水化溫度較低時無法引發(fā)磷脂相變[17]，脂質(zhì)膜吸水溶脹較差，不利于Gen-Lip 載藥。水化溫度過高時可能會影響磷脂穩(wěn)定性，同時脂質(zhì)體膜通透性及流動性均易增大[20]，進而影響載藥，且粒徑和PDI 值變大。綜合考慮，確定水化溫度為40 ℃。

表4 水化溫度的考察 (±s, n = 3)Table 4 Investigation of hydration temperature (±s, n = 3)

表4 水化溫度的考察 (±s, n = 3)Table 4 Investigation of hydration temperature (±s, n = 3)

水化溫度/℃ 包封率/% 載藥量/% 粒徑/nm PDI 30 65.41±1.20 3.07±0.24 192.44±9.11 0.229±0.018 35 69.78±1.36 3.36±0.17 204.81±10.25 0.194±0.015 40 78.85±1.51 3.77±0.20 209.07±11.01 0.157±0.024 45 75.24±1.17 3.59±0.25 223.83±10.45 0.186±0.021 55 68.96±1.08 3.43±0.15 239.41±13.84 0.219±0.023

2.4.5 水化時間的影響 固定染料木素投藥量為20 mg，脂藥比20∶1，磷脂與膽固醇比例10∶1，水相pH 值為6.5，水化溫度為40 ℃條件下分別考察水化時間的影響，結(jié)果見表5。隨著水化時間的增加Gen-Lip 包封率和載藥量先增加后下降，可能是由于水化時間較短時磷脂吸水溶脹不充分，影響Gen-Lip 載藥。水化時間過長可能會影響磷脂穩(wěn)定性，進而影響載藥[17]，同時粒徑和PDI 值有變大趨勢。可見水化時間對Gen-Lip 包封率和載藥量有較大影響，故需繼續(xù)優(yōu)化。

表5 水化時間的考察 (±s, n = 3)Table 5 Investigation of hydration time (±s, n = 3)

表5 水化時間的考察 (±s, n = 3)Table 5 Investigation of hydration time (±s, n = 3)

水化時間/h 包封率/% 載藥量/% 粒徑/nm PDI 0.5 55.14±1.04 2.59±0.14 198.17±9.17 0.249±0.026 1.0 59.87±0.99 2.86±0.20 210.55±10.52 0.191±0.015 1.5 80.04±1.18 3.80±0.17 203.68±11.07 0.160±0.013 2.0 77.89±1.40 3.63±0.22 214.94±11.99 0.192±0.017 2.5 74.16±1.69 3.51±0.15 238.03±12.51 0.241±0.023

2.5 BBD-RSM 優(yōu)化Gen-Lip 處方

2.5.1 試驗方案 根據(jù)“2.4”項下考察結(jié)果，發(fā)現(xiàn)脂藥比、磷脂與膽固醇比及水化時間對Gen-Lip 包封率和載藥量影響較大，故將脂藥比、磷脂與膽固醇比及水化時間分別作為自變量X1、X2和X3，包封率和載藥量分別作為響應值Y1和Y2，設計BBDRSM 優(yōu)化Gen-Lip 處方工藝。各個自變量水平見表6，分別制備不同處方工藝下的Gen-Lip（分別平行制備3 批），測定包封率及載藥量，取平均值（RSD值大于2%時重新進行實驗），結(jié)果見表6。

表6 BBD-RSM 試驗設計與結(jié)果 (n = 3)Table 6 Experiment designs and results of Box-Behnken (n = 3)

2.5.2 模型的建立以及分析 利用Design Expert V 8.0.6 軟件進行多元回歸擬合，得Gen-Lip 包封率Y1的二次多元回歸方程為Y1＝81.900＋9.840X1＋0.710X2－0.160X3＋0.340X1X2－1.960X1X3－0.690X2X3－6.70X12－8.240X22－7.980X32，方程R2＝0.986 8，Radj2＝0.969 9；Gen-Lip 載藥量Y2的二次多元回歸方程為Y2＝3.91－0.140X1＋0.054X2－0.015X3＋2.50×10?3X1X2－0.170X1X3＋0.001X2X3－0.390X12－0.480X22－0.380X32方程R2＝0.960 9，Radj2＝0.950 7。方程擬合相關系數(shù)均高于0.9，模型P值均具極顯著性差異（P＜0.01），失擬F值均無顯著性差異（P＞0.05），故建立的包封率Y1和載藥量Y2數(shù)學模型可用來預測響應值與參數(shù)之間的關系。方程分析結(jié)果見表7，方程Y1中X1、X12、X22、X32均具顯著性差異；方程Y2中X1、X2X3、X12、X22、X32均具顯著性差異。

表7 方差分析Table 7 Analysis of variance

2.5.3 效應面優(yōu)化與最佳處方工藝確定 根據(jù)建立的數(shù)學模型繪制響應值與自變量的響應面圖，結(jié)果見圖2。當固定某一因素不變時（取中間值），隨著脂藥比（X1）、磷脂與膽固醇比（X2）及水化時間（X3）增加，染料木素脂質(zhì)體包封率Y1和載藥量Y2均呈先增大后減小趨勢。選擇Gen-Lip 包封率（區(qū)間為50%～100%）和載藥量（區(qū)間為2%～5%）最大值作為優(yōu)化目標，得到Gen-Lip 最佳處方為脂藥比20.7∶1，磷脂與膽固醇比10.13∶1，水化時間1.48 h，該數(shù)學模型預測包封率和載藥量分別為83.2%和3.9%。

圖2 自變量與響應值的三維圖Fig. 2 Three-dimensional plots of independent variables and response values

2.6 Gen-Lip 最佳工藝確認及偏差計算

為便于操作，將磷脂與膽固醇比調(diào)整為10.1∶1，水化時間調(diào)整為1.5 h，而脂藥比20.7∶1 保持不變。按調(diào)整后的處方工藝平行制備3 批Gen-Lip 樣品，按“2.3”項下測定包封率和載藥量，并計算實測值與預測值的相對偏差［相對偏差＝(實測值－預測值)/預測值］。結(jié)果見表8，實測值與預測值相對偏差絕對值均小于±5%，證明建立的包封率和載藥量數(shù)學模型對Gen-Lip 處方工藝優(yōu)化具有較高的指導意義。

表8 相對偏差結(jié)果Table 8 Results of relative deviation

2.7 CS-Gen-Lip 的制備[24]

采用1%乙酸溶液配制不同質(zhì)量濃度的殼聚糖溶液，備用。精密取Gen-Lip 混懸液50 mL，緩慢加入等體積的殼聚糖溶液，于600 r/min 磁力攪拌2 h，12 500 r/min 離心（離心半徑6.8 cm）20 min，棄去上清液，加入pH 值為6.5 磷酸鹽緩沖液（PBS）至50 mL，取適量測定CS-Gen-Lip 的ζ 電位，結(jié)果見圖3。殼聚糖溶液質(zhì)量濃度大于0.2%后CS-Gen-Lip 的ζ 電位基本恒定，故確定殼聚糖溶液質(zhì)量濃度為0.2%。

圖3 殼聚糖質(zhì)量濃度對ζ 電位的影響 (±s, n = 3)Fig. 3 Effects of chitosan concentration on ζ potential(±s, n = 3)

2.8 BSA/CS-Gen-Lip 的制備

精密稱取一定量的牛血清白蛋白至CS-Gen-Lip 混懸液中，于600 r/min 磁力攪拌2 h，取適量測定BSA/CS-Gen-Lip 的ζ 電位，結(jié)果見圖4。隨著牛血清白蛋白質(zhì)量濃度的逐漸增加，ζ 電位由正轉(zhuǎn)負，當其質(zhì)量濃度大于0.5%時ζ 電位基本保持不變，為減少輔料用量，故確定牛血清白蛋白質(zhì)量濃度為0.5%。

圖4 牛血清白蛋白質(zhì)量濃度對ζ 電位的影響 (±s, n = 3)Fig. 4 Effects of bovine serum albumin concentration on ζ potential (±s, n = 3)

2.9 Gen-Lip、CS-Gen-Lip 和BSA/CS-Gen-Lip 表征

2.9.1 質(zhì)量指標的測定 取Gen-Lip、CS-Gen-Lip和BSA/CS-Gen-Lip 混懸液，分別按照“2.3”項下方法測定包封率、載藥量、粒徑、PDI、ζ 電位，結(jié)果見表9。CS-Gen-Lip 和BSA/CS-Gen-Lip 的包封率顯著增加（P＜0.01），可能是由于殼聚糖和牛血清白蛋白的包覆作用，減少了表層或淺表層藥物泄露，同時由于輔料用量的增加導致CS-Gen-Lip 和BSA/CS-Gen-Lip 載藥量下降（P＜0.05、0.01）。CS-Gen-Lip 和BSA/CS-Gen-Lip 粒徑極顯著性增大（P＜0.01），結(jié)果見圖5-A，這與殼聚糖和牛血清白蛋白包覆在Gen-Lip 表面有關，同時PDI 值也出現(xiàn)顯著性增大（P＜0.05）。CS-Gen-Lip ζ 電位轉(zhuǎn)變?yōu)檎娦裕≒＜0.01），結(jié)果見圖5-B，這是由于殼聚糖本身帶正電荷，包覆于Gen-Lip 表面后改變了ζ 電位的電性。BSA/CS-Gen-Lip 又轉(zhuǎn)變?yōu)樨撾娦裕≒＜0.01），這與牛血清白蛋白本身帶負電荷有關[18]。

表9 質(zhì)量指標的測定結(jié)果 (±s, n = 3)Table 9 Determination results of quality indicators (±s, n = 3)

表9 質(zhì)量指標的測定結(jié)果 (±s, n = 3)Table 9 Determination results of quality indicators (±s, n = 3)

與Gen-Lip 比較：*P＜0.05**P＜0.01*P < 0.05**P < 0.01 vs Gen-Lip

組別 包封率/% 載藥量/% 粒徑/nm PDI ζ 電位/mV Gen-Lip 82.84±1.37 3.82±0.21 196.12±10.64 0.165±0.015 ?20.14±0.92 CS-Gen-Lip 89.21±1.45** 3.37±0.23* 265.36±13.80** 0.238±0.024** 12.94±1.13**BSA/CS-Gen-Lip 89.53±1.60** 1.87±1.41** 303.84±23.67** 0.246±0.021** ?13.27±0.89**

圖5 Gen-Lip、CS-Gen-Lip 和BSA/CS-Gen-Lip 的粒徑分布 (A) 和ζ 電位 (B)Fig. 5 Particle size distributions (A) and ζ potentials (B) of Gen-Lip, CS-Gen-Lip and BSA/CS-Gen-Lip

2.9.2 TEM觀察3種脂質(zhì)體微觀形態(tài) 取Gen-Lip、CS-Gen-Lip 和BSA/CS-Gen-Lip 混懸液采用蒸餾水稀釋50 倍，分別滴至碳膜涂覆的銅網(wǎng)，靜置10 min，滴加濃度為1.5%磷鎢酸鈉溶液進行染色。置于TEM下觀察微觀形貌，結(jié)果見圖6，Gen-Lip、CS-Gen-Lip 和BSA/CS-Gen-Lip 均無黏連現(xiàn)象。

圖6 Gen-Lip (A)、CS-Gen-Lip (B) 和BSA/CS-Gen-Lip (C) 的TEM 圖Fig. 6 TEM image of Gen-Lip (A), CS-Gen-Lip (B) and BSA/CS-Gen-Lip (C)

2.10 凍干粉的制備

精密量取Gen-Lip、CS-Gen-Lip和BSA/CS-Gen-Lip 混懸液50 mL，分別加入2 g 乳糖，震蕩溶解，混勻后分裝至西林瓶中。置于?45 ℃超低溫冰箱中冷凍2 d，立即置于冷阱溫度為?25 ℃的凍干機中，抽真空至0.1 mPa，冷凍2 d 即得凍干粉末，外觀見圖7，制得的凍干粉外形均飽滿，色澤均一。

圖7 Gen-Lip (A)、CS-Gen-Lip (B) 和BSA/CS-Gen-Lip 凍干粉 (C) 外觀Fig. 7 Appearance of Gen-Lip (A), CS-Gen-Lip (B) and BSA/CS-Gen-Lip lyophilized powder (C)

Gen-Lip、CS-Gen-Lip 和BSA/CS-Gen-Lip 凍干粉復溶后平均包封率分別為（80.04±1.62）%、（87.13±1.84）%和（87.02±0.96）；粒徑分別為（223.89±12.15）、（289.13±27.36）、（294.35±24.16）nm；ζ 電位分別為（?17.68±1.01）、（10.77±0.95）、（?9.90±0.86）mV。測得Gen-Lip、CS-Gen-Lip 和BSA/CS-Gen-Lip 凍干粉中染料木素質(zhì)量分數(shù)分別為（0.82±0.03）%、（0.78±0.02）%和（0.68±0.02）%。

2.11 晶型研究

取染料木素原料藥、空白輔料、物理混合物（染料木素與空白輔料比例同BSA/CS-Gen-Lip 凍干粉）、Gen-Lip 凍干粉、CS-Gen-Lip 凍干粉、BSA/CSGen-Lip 凍干粉和BSA/CS-Gen-Lip 直接凍干粉（不加乳糖）適量進行XRPD 掃描，測試條件：掃描角度（2θ）為3°～45°，Cu-Kα 靶，掃描速度為3°/min，見圖8。染料木素原料藥在7.4°、11.1°、11.5°、14.0°、14.8°、15.4°、16.2°、17.7°、22.5°、24.7°等處晶型峰較強，在物理混合物XRPD 圖譜中仍可觀察到染料木素晶型衍射峰，說明仍以晶型狀態(tài)存在。在Gen-Lip 凍干粉、CS-Gen-Lip 凍干粉、BSA/CS-Gen-Lip凍干粉和BSA/CS-Gen-Lip 直接凍干粉XRPD 圖譜中，染料木素原料藥晶型衍射峰均消失，說明染料木素均以無定形狀態(tài)存在。凍干粉中乳糖在18°～22°的晶型峰強度明顯下降，可能是乳糖與脂質(zhì)體表面形成氫鍵所致[17]。

圖8 XRPD 結(jié)果Fig. 8 XRPD results

2.12 體外釋藥及釋藥機制研究

取染料木素原料藥、Gen-Lip、CS-Gen-Lip 和BSA/CS-Gen-Lip 凍干粉適量（染料木素含量均為10 mg），加入模擬胃液（pH 1.2，含胃蛋白酶）制備混懸液，轉(zhuǎn)移至活化后的透析袋中（截留相對分子質(zhì)量為10 000），扎緊。采用900 mL 模擬胃液（pH 1.2，含胃蛋白酶，含1%聚山梨酯80）作為釋藥介質(zhì)，介質(zhì)溫度為37 ℃，攪拌槳轉(zhuǎn)速為75 r/min，于0、0.5、1.0、1.5、2.0 h 取樣3 mL，取樣后及時補進3 mL 空白介質(zhì)。2 h 后立即將釋藥介質(zhì)更換為900 mL 模擬腸液（pH 6.8，含胰蛋白酶，含1%聚山梨酯80），于3、4、6、8、12、18、24 h 取樣。樣品經(jīng)12 500 r/min 離心（離心半徑6.8 cm）30 min進樣測定，結(jié)果見圖9。染料木素原料藥由于溶解度較差、顆粒較大等原因?qū)е氯艹龆群艿蚚11]。Gen-Lip凍干粉在模擬胃腸液中24 h 累積釋放度為64.17%，后期出現(xiàn)累積釋放度下降情況，可能與Gen-Lip 穩(wěn)定性較差、染料木素易被降解等因素有關[8,18]。CSGen-Lip 凍干粉和BSA/CS-Gen-Lip 凍干粉在模擬胃腸液中24 h累積釋放度分別為72.04%和68.33%，而BSA/CS-Gen-Lip 凍干粉效果更為明顯，可能與殼聚糖和牛血清白蛋白雙層修飾有關[22]。釋藥模型擬合見表10，Gen-Lip、CS-Gen-Lip 和BSA/CS-Gen-Lip 凍干粉體外釋藥均符合Weibull 模型。

圖9 體外釋放曲線的比較 (±s, n = 3)Fig. 9 Comparison of drug release profiles in vitro (±s,n = 3)

表10 Gen-Lip、CS-Gen-Lip 和BSA/CS-Gen-Lip的Weibull模型方程Table 10 Weibull model equations of Gen-Lip, CS-Gen-Lip and BSA/CS-Gen-Lip

2.13 儲存穩(wěn)定性考察

2.13.1 滲漏率的測定 采用滲漏率來評價穩(wěn)定性。取Gen-Lip、CS-Gen-Lip 和BSA/CS-Gen-Lip 凍干粉密封置于在4 ℃冰箱中，于0、5、10、15、30、45、60、90 d 取樣，加入蒸餾水復溶后測定滲漏率［滲漏率＝(新制備測得的包封率－儲存過程中測得的包封率)/新制備測得的包封率］。結(jié)果見表11，Gen-Lip 凍干粉90 d 滲漏率達（9.46±0.38）%，而CS-Gen-Lip 和BSA/CS-Gen-Lip 凍干粉滲漏率不足1%，表明兩者儲存穩(wěn)定性相對較高。

表11 滲漏率測定結(jié)果 (±s, n = 3)Table 11 Determination results of leakage rate (±s, n = 3)

t/d Gen-Lip凍干粉CS-Gen-Lip凍干粉BSA/CS-Gen-Lip 凍干粉0 0 0 0 5 0.62±0.14 0.59±0.14 0.61±0.12 10 1.32±0.21 0.64±0.12 0.62±0.08 15 3.16±0.24 0.72±0.10 0.69±0.09 30 4.95±0.29 0.85±0.19 0.74±0.11 45 5.58±0.32 0.89±0.14 0.78±0.13 60 7.37±0.34 0.92±0.15 0.80±0.09 90 9.46±0.38 0.93±0.18 0.81±0.13

2.13.2 氧化指標的測定 取4 ℃條件下放置90 d后的Gen-Lip、CS-Gen-Lip 和BSA/CS-Gen-Lip 凍干粉，分別用無水乙醇溶解，使磷脂質(zhì)量濃度約為0.5 mg/mL，分別測定在波長215 nm 和233 nm 的吸光度（A），并計算氧化指數(shù)（氧化指數(shù)＝A233/A215）。結(jié)果見表12，在該存放條件下Gen-Lip 凍干粉氧化指數(shù)大于0.2，CS-Gen-Lip 和BSA/CS-Gen-Lip 凍干粉氧化指數(shù)極顯著性低于Gen-Lip 凍干粉（P＜0.01），表明兩者穩(wěn)定性優(yōu)于Gen-Lip 凍干粉。

表12 磷脂氧化指數(shù)測定結(jié)果 (±s, n = 3)Table 12 Determination results of phospholipids oxidation index (±s, n = 3)

表12 磷脂氧化指數(shù)測定結(jié)果 (±s, n = 3)Table 12 Determination results of phospholipids oxidation index (±s, n = 3)

與Gen-Lip 比較：**P＜0.01**P < 0.01 vs Gen-Lip

樣品 磷脂氧化指數(shù)Gen-Lip 凍干粉 0.221±0.017 CS-Gen-Lip 凍干粉 0.084±0.008**BSA/CS-Gen-Lip 凍干粉 0.082±0.006**

2.14 藥動學研究

2.14.1 給藥及取血方案 取染料木素原料藥、Gen-Lip、CS-Gen-Lip 和BSA/CS-Gen-Lip 凍干粉，采用0.5%的CMC-Na 水溶液配制ig 液，臨用現(xiàn)配。取18 只SD 大鼠禁食12 h，禁食期間可自由飲水，隨機分為3 組，每組6 只。記錄各只SD 大鼠體質(zhì)量，按40 mg/kg 劑量ig。于0.25、0.5、1、1.5、2、3、4、6、8、12 h 采用乙醚麻醉大鼠，于眼眶后靜脈叢采血約0.25 mL 至肝素浸潤離心管中，震蕩搖勻后3000 r/min 離心（離心半徑6.8 cm）3 min，取上層淡黃色血漿至空白離心管中，冷凍保存。

2.14.2 血漿樣品的處理[25]取出血漿室溫解凍，精密量取血漿樣品100 μL 和50 μL 磺胺甲噁唑（1000 ng/mL）至5 mL 離心管中，加1 mL 乙腈渦旋3 min，8500 r/min 離心10 min。取上清液至空白離心管中，40 ℃氮氣流下緩慢吹除有機溶劑，加入100 μL 乙腈，渦旋3 min，8500 r/min 離心（離心半徑6.8 cm）10 min，取上清液進樣分析。

2.14.3 血漿對照品標準曲線 甲醇配制質(zhì)量濃度為1000 ng/mL 的磺胺甲噁唑溶液，作為內(nèi)標。取質(zhì)量濃度為2 μg/mL 的染料木素對照品溶液，甲醇稀釋至1000、500、250、100、50 ng/mL，分別取100 μL 至離心管中，40 ℃溫度下緩慢吹除有機溶劑，加入100 μL 空白血漿，渦旋3 min 即得質(zhì)量濃度為2000、1000、500、250、100、50 ng/mL 一系列染料木素血漿對照品溶液。按“2.14.2”項下方法處理后進樣分析。染料木素質(zhì)量濃度為橫坐標（X），染料木素和磺胺甲噁唑峰面積比為縱坐標（Y）作線性回歸，得血漿對照品標準曲線方程：Y＝0.015 2X＋16.994 3，相關系數(shù)r＝0.995 8，表明染料木素血漿對照品在50～2000 ng/mL 線性關系良好。

2.14.4 專屬性試驗 取空白血漿、血漿對照品（染料木素質(zhì)量濃度為50 ng/mL）和血漿樣品（Gen-Lip凍干粉ig 給藥12 h），按“2.14.2”項下方法處理，按“2.2.1”項下色譜條件進樣分析，色譜圖見圖10，血漿內(nèi)源性雜質(zhì)未對染料木素和磺胺甲噁唑產(chǎn)生干擾，專屬性較高。

圖10 空白血漿 (A)、血漿對照品 (B)、血漿樣品溶液 (C)的HPLC 圖Fig. 10 HPLC of blank plasma (A), plasma reference (B)and plasma sample solution (C)

2.14.5 精密度考察 分別取質(zhì)量濃度為50、500、2000 ng/mL 血漿對照品溶液各6 份，分別按“2.2.1”項下色譜條件進樣分析，計算得染料木素和磺胺甲噁唑峰面積比值的RSD 分別為2.12%、3.25%、2.81%，結(jié)果表明儀器精密度良好。

2.14.6 重復性考察 取質(zhì)量濃度為500 ng/mL 血漿樣品（含內(nèi)標），按“2.14.2”項下方法平行處理6 份，分別按“2.2.1”項下色譜條件進樣測定，計算得染料木素和磺胺甲噁唑峰面積比值的RSD 為8.94%，結(jié)果表明該方法重復性良好。

2.14.7 穩(wěn)定性考察 取Gen-Lip 凍干粉ig 給藥12 h 的血漿樣品溶液，分別于0、1、3、6、9、12 h 進樣測定染料木素和磺胺甲噁唑峰面積，計算得兩者峰面積比值的RSD 為7.69%，結(jié)果表明血漿樣品溶液在18 h 內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.14.8 加樣回收率考察 配制質(zhì)量濃度分別為50、500、2000 ng/mL 的染料木素對照品溶液，按“2.14.2”項下方法操作，測定染料木素和磺胺甲噁唑的峰面積，并計算染料木素加樣回收率，結(jié)果表明染料木素的平均加樣回收率為95.20%，RSD 為6.85%，表明該方法準確度較高。

2.14.9 藥動學結(jié)果 血藥濃度-時間曲線見圖11。使用DAS 3.0 軟件非房室模型計算主要藥動學參數(shù)，結(jié)果見表15。與染料木素相比，Gen-Lip 的Cmax、AUC0～t及AUC0～∞有顯著性改變（P＜0.05），Cmax和相對口服吸收生物利用度分別提高至1.42 倍和1.45 倍。CS-Gen-Lip 的藥動學參數(shù)有顯著性或極顯著性改變（P＜0.05、0.01），tmax延后至（2.09±0.60）h，t1/2延長至（5.61±1.01）h，Cmax和相對口服吸收生物利用度分別提高至2.57 倍和3.28 倍。BSA/CSGen-Lip 的藥動學參數(shù)也有顯著性或極顯著性改變（P＜0.05、0.01），tmax延后至（2.17±0.71）h，t1/2延長至（6.89±1.12）h，Cmax和相對口服吸收生物利用度分別提高至2.33 倍和4.00 倍。與CS-Gen-Lip相比，BSA/CS-Gen-Lip 的t1/2、AUC0～t、AUC0～∞存在顯著性差異（P＜0.05），說明BSA/CS-Gen-Lip 促吸收作用更大。

圖11 血藥濃度-時間曲線 (±s, n = 6)Fig. 11 Drug concentration-time curves (±s, n = 6)

表15 藥動學結(jié)果 (±s, n = 6)Table 15 Pharmacokinetic results (±s, n = 6)

表15 藥動學結(jié)果 (±s, n = 6)Table 15 Pharmacokinetic results (±s, n = 6)

與染料木素比較：*P＜0.05**P＜0.01；與Gen-Lip 比較：#P＜0.05##P＜0.01；與CS-Gen-Lip 比較：△P＜0.05*P < 0.05**P < 0.01 vs genistein;#P < 0.05## P < 0.01 vs Gen-Lip; △P < 0.05 vs CS-Gen-Lip

參數(shù) 單位 染料木素 Gen-Lip CS-Gen-Lip BSA/CS-Gen-Lip tmax h 1.47±0.37 1.41±0.43 2.09±0.60*# 2.17±0.71*#t1/2 h 3.15±0.68 3.34±0.75 5.61±1.01*# 6.89±1.12*##Cmax ng?mL?1 568.11±108.43 806.47±197.61* 1 459.88±412.86**## 1 325.71±457.06**##AUC0～t ng?h?mL?1 2 023.06±361.94 2 940.12±452.70* 6 642.83±813.71**## 8 098.47±926.52**##AUC0～∞ ng?h?mL?1 2 094.75±392.71 3 058.06±490.38* 6 768.02±846.79**## 8 309.76±958.18**##

3 討論

殼聚糖是一種帶正電荷的天然陽離子多糖，包覆在Gen-Lip 表面后會使電荷性質(zhì)發(fā)生改變，因而本研究通過測定ζ 電位來篩選殼聚糖溶液的質(zhì)量濃度。殼聚糖與脂質(zhì)體的結(jié)合除了靜電作用外，還存在疏水作用[26-27]，疏水作用促進了殼聚糖材料在脂質(zhì)體表面的吸附及沉積，因而兩者結(jié)合較為緊密。在CS-Gen-Lip 表面繼續(xù)包覆牛血清白蛋白制備成BSA/CS-Gen-Lip，白蛋白可利用自身多個疏水性位點及二硫鍵形成共價交聯(lián)[28]，從而在脂質(zhì)體表面形成穩(wěn)定的白蛋白修飾層，利于抵抗胃腸道pH 值、胃蛋白酶、胰蛋白酶等對脂質(zhì)體的破壞[29]，進一步增加穩(wěn)定性、提高緩釋效果。

前期試驗結(jié)果顯示，采用蔗糖制備凍干粉時粒徑較大，而甘露醇可能由于自身具有結(jié)晶型針狀結(jié)構(gòu)[30]，導致凍干粉包封率下降幅度遠大于乳糖，故最終選擇乳糖作為凍干保護劑。染料木素在BSA/CS-Gen-Lip 凍干粉以無定型狀態(tài)存在，利于改善藥物的溶解度及生物利用度。BSA/CS-Gen-Lip 凍干粉在各個時間點累積釋放度略低于Gen-Lip 和CSGen-Lip 凍干粉，這可能是由于Gen-Lip 磷脂雙分子層處于液晶相[27]，藥物釋放相對容易，而殼聚糖包覆的CS-Gen-Lip 可以減緩藥物釋放，表現(xiàn)出一定的緩釋特征。BSA/CS-Gen-Lip 由于牛血清和殼聚糖雙層包覆作用從而使藥物的緩釋特征更為明顯。穩(wěn)定性結(jié)果顯示，CS-Gen-Lip 和BSA/CS-Gen-Lip 凍干粉滲漏率和氧化指標均明顯低于Gen-Lip 凍干粉，說明兩者穩(wěn)定性優(yōu)于Gen-Lip 凍干粉?？赡苁怯捎谖葱揎椀腉en-Lip 在儲存過程中易發(fā)生氧化、聚集、融合等現(xiàn)象而導致藥物泄露，修飾后的CSGen-Lip 和BSA/CS-Gen-Lip 通過增加機械穩(wěn)定性、降低雙分子層膜流動相、阻止磷脂雙分子層向流體液晶相的轉(zhuǎn)變、增加雙分子層膜致密性等機制[26]，從而提高了儲存穩(wěn)定性。

與染料木素原料藥相比，BSA/CS-Gen-Lip 的Cmax及口服生物利用度顯著性提高，可能是由于BSA/CS-Gen-Lip 改善了染料木素溶解度及溶出度，解決了藥物體內(nèi)吸收瓶頸；染料木素由晶態(tài)轉(zhuǎn)變?yōu)闊o定型態(tài)，更易于體內(nèi)吸收[13,17]；染料木素胃腸道穩(wěn)定性較差，制備成BSA/CS-Gen-Lip 后提高了胃腸道穩(wěn)定性，更能發(fā)揮納米粒子特殊的吸收機制，增加了藥物吸收量；BSA/CS-Gen-Lip 粒徑較小，與胃腸道接觸面較大，促進了藥物體內(nèi)吸收[31-33]；BSA/CS-Gen-Lip 處方中的殼聚糖、牛血清白蛋白等輔料本身具有促吸收作用[26,34-35]。另外，BSA/CSGen-Lip 的t1/2和口服吸收生物利用度均高于Gen-Lip 和CS-Gen-Lip，可能是由于白蛋白包覆后降低胃腸道各種酶、pH 值等因素對脂質(zhì)體結(jié)構(gòu)的破壞幾率，更利于跨膜遞送[35]，說明BSA/CS-Gen-Lip 更具有開發(fā)研究價值。

綜上，本研究完成了BSA/CS-Gen-Lip 及其凍干粉處方工藝研究，染料木素在BSA/CS-Gen-Lip 凍干粉中以無定型形式存在，且緩釋作用明顯，儲存穩(wěn)定性較高，促吸收作用較大，后續(xù)可對BSA/CSGen-Lip 凍干粉藥效、毒性評價等進一步研究，為染料木素制劑開發(fā)提供有價值的參考資料。

利益沖突所有作者均聲明不存在利益沖突