徐瑞雯，范雨欣，朱 瑩，張曉，薛貴民，曾夢(mèng)楠,2，鄭曉珂,2，馮衛(wèi)生,2，陳 輝,2*

1. 河南中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院，河南 鄭州 450046

2. 呼吸疾病中醫(yī)藥防治省部共建協(xié)同創(chuàng)新中心，河南 鄭州 450046

海風(fēng)藤為胡椒科胡椒屬植物風(fēng)藤Piperkadsura(Choisy) Ohwi 的干燥藤莖，主產(chǎn)于浙江、福建、海南、廣東、臺(tái)灣等地。海風(fēng)藤味辛、苦，性微溫，歸肝經(jīng)，具有祛風(fēng)濕，通經(jīng)絡(luò)，止痹病等功效[1-2]?；瘜W(xué)成分研究表明海風(fēng)藤含有木脂素、生物堿、揮發(fā)油、黃酮類、環(huán)氧化合物、甾體等成分，其中新木脂素和酰胺生物堿是其主要的化學(xué)成分[3-4]。現(xiàn)代藥理研究表明海風(fēng)藤具有抗炎、抗氧化、抑制血小板活化因子和神經(jīng)保護(hù)等作用，特別是在治療阿爾茨海默癥和器官缺血再灌注等方面具有顯著的藥用價(jià)值[4-6]。文獻(xiàn)研究表明海風(fēng)藤水提物及醇提物可顯著提高Aβ 誘導(dǎo)的阿爾茨海默癥模型大鼠的學(xué)習(xí)記憶能力，有效改善其認(rèn)知功能障礙[7-8]。但目前有關(guān)海風(fēng)藤治療阿爾茨海默癥的研究多集中在總提取物或少量化合物。本課題組前期已對(duì)海風(fēng)藤二氯甲烷部位的化學(xué)成分進(jìn)行了初步研究[9-10]，為進(jìn)一步揭示海風(fēng)藤藥理活性的化學(xué)物質(zhì)基礎(chǔ)，本實(shí)驗(yàn)綜合利用各種現(xiàn)代色譜和光譜技術(shù)，對(duì)海風(fēng)藤二氯甲烷及醋酸乙酯提取物進(jìn)行系統(tǒng)的化學(xué)成分研究，共分離鑒定了22 個(gè)化合物，分別為puberulin（1）、(?)-acuminatin（2）、dihydrocarinatin（3）、海風(fēng)藤酮（kadsurenone，4）、山蒟素C（hancinone C，5）、3-羥基苯甲酸芐酯（3-hydroxybenzyl benzoate，6）、2-羥基苯甲酸芐酯（2-hydroxybenzyl benzoate，7）、cherrevenol D（8）、trans-2,3-diacetoxy-1-[(benzoy1oxy)methyl]-cyclohexa-4,6-diene（9）、(3R,4R)-4-O-acetyl-5-(benzoyloxymethyl)cyclohexa-1,5-diene-3,4-diol（10）、(?)-sootepoxide chlorohydrin A（11）、香草醛（vanillin，12）、細(xì)辛醛（asaronaldehyde，13）、β-細(xì)辛醚（β-asarone，14）、α-細(xì)辛醚（α-asarone，15）、胡椒內(nèi)酰胺D（piperolactam D，16）、焦谷氨酸甲酯（methyl pyroglutamate，17）、三羥基異黃酮（genistein，18）、去氫木香內(nèi)酯（dehydrocostus lactone，19）、木香內(nèi)酯（costuslactone，20）、spathulenol（21）、β-谷甾醇（β-sitosterol，22）。其中化合物3、6～8、19、20 為首次從胡椒屬植物中分離得到，化合物15、21 為首次從海風(fēng)藤中分離得到；化合物4 的13C-NMR 波譜數(shù)據(jù)為首次報(bào)道。Aβ25-35誘導(dǎo)PC-12 細(xì)胞損傷的神經(jīng)保護(hù)作用研究顯示，化合物2、4、19、21 對(duì)Aβ25-35誘導(dǎo)PC-12 細(xì)胞損傷具有顯著保護(hù)作用，其半數(shù)效應(yīng)濃度（median effective concentration，EC50）值分別為11.1、27.3、32.9、29.3 μmol/L。

1 儀器與材料

Bruker AVANCE III 500 型核磁共振儀、Bruker maxis HD 型飛行時(shí)間質(zhì)譜（德國(guó)Bruker 公司）；N-1000 型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀（上海愛(ài)朗儀器有限公司）；SHB-B95A 型循環(huán)水式多用真空泵（鄭州長(zhǎng)城科工貿(mào)有限公司）；DFZ-3 型真空干燥箱（上海醫(yī)用恒溫設(shè)備廠）；Thermo Nicolet IS10 型紅外光譜儀（美國(guó)熱電公司）；LC52 型高壓制備液相色譜儀（賽譜銳思北京科技有限公司，SP-5030 型半制備型高壓輸液泵，UV200 型紫外檢測(cè)器，Easychrom 型色譜工作站；色譜柱為YMC-Pack ODS-A（250 mm×20 mm，5m）；Multiskan FC 型酶標(biāo)儀（美國(guó)Thermo公司）；薄層色譜硅膠GF254、柱色譜硅膠（200～300 目，青島海洋化工廠）；Sephadex LH-20（Pharmacia Biotech 公司）；ODS（40～60m，YMC 公司）；甲醇，色譜純（天津市四友精細(xì)化學(xué)品有限公司）；其他試劑均為分析級(jí)；薄層色譜硅膠選用10～40m 的粒徑，以0.5% CMC-Na 制板，陰干，105 ℃活化0.5 h。實(shí)時(shí)無(wú)標(biāo)記細(xì)胞動(dòng)態(tài)分析儀（安捷倫生物）；Aβ25-35（生工生物工程上海股份有限公司）；白藜蘆醇（批號(hào)A10111，上海源葉生物科技有限公司）。

PC-12 細(xì)胞購(gòu)于中國(guó)科學(xué)院上海細(xì)胞庫(kù)。海風(fēng)藤于2018 年6 月采購(gòu)于安徽亳州藥材市場(chǎng)，經(jīng)河南中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院陳隨清教授鑒定為胡椒科胡椒屬植物風(fēng)藤P.kadsura(Choisy) Ohwi 的干燥藤莖。憑證樣本（20180609I）存放于河南中醫(yī)藥大學(xué)中藥化學(xué)研究室。

2 方法

2.1 提取與分離

海風(fēng)藤藥材粗粉（40 kg），二氯甲烷冷浸提取3次，每次24 h，繼續(xù)用醋酸乙酯冷浸提取3 次，提取液經(jīng)減壓濃縮，得到二氯甲烷部位浸膏600 g，醋酸乙酯部位浸膏450 g。二氯甲烷部位總浸膏進(jìn)行硅膠柱色譜分離，依次用石油醚-丙酮（100∶0→0∶100）梯度洗脫，得到13 個(gè)組分（Fr. 1～13）。Fr. 3（76 g）進(jìn)行硅膠柱色譜分離，依次用石油醚-丙酮（100∶0→0∶100）梯度洗脫，得到2 個(gè)流分（Fr.3a～3b）。Fr. 3b 經(jīng)ODS 柱色譜分離，依次用甲醇-水（30%～100%）梯度洗脫，得到7 個(gè)亞組分（Fr.3b-1～3b-7）。Fr. 3b-2（50%甲醇洗脫部位，38.6 g）經(jīng)制備型HPLC 制備（65%甲醇-水）得化合物12（10.0 mg，tR＝38.4 min）、13（22.6 mg，tR＝42.9 min）。Fr. 3b-3 經(jīng)制備型HPLC 制備（80%甲醇-水）得化合物21（5.0 mg，tR＝31.8 min）、11（2.0 mg，tR＝21.0 min）Fr. 6（32.5 g）經(jīng)ODS 柱色譜分離，依次用甲醇-水（30%～100%）梯度洗脫，得到7個(gè)亞組分（Fr. 6-1～6-7）。Fr.6-4（70%甲醇洗脫部位，11.4 g）經(jīng)制備型HPLC 制備（85%甲醇-水）得化合物1（4.0 mg，tR＝21.4 min）、8（5.7 mg，tR＝40.3 min）、9（10.3 mg，tR＝41.0 min）。Fr. 7（30.1 g）經(jīng)ODS 柱色譜分離，依次用甲醇-水（30%～100%）梯度洗脫，得到9 個(gè)亞組分（Fr. 7-1～7-9）。Fr. 7-3（70%甲醇洗脫部位，13.5 g）經(jīng)制備型HPLC制備（70%甲醇-水）制備得化合物10（2.5 mg，tR＝20.0 min）、2（9.5 mg，tR＝39.0 min）、3（3.5 mg，tR＝41.2 min）。Fr. 7-5 經(jīng)硅膠柱色譜分離，依次用石油醚-丙酮（100∶0→0∶100）梯度洗脫，經(jīng)制備型HPLC 制備（60%甲醇-水）得化合物4（20.0 mg，tR＝44.0 min）、5（3.4 mg，tR＝42.0 min）。

Fr. 8（38.8 g）經(jīng)MCI 柱色譜分離，依次用甲醇-水（30%～100%）梯度洗脫，得到9 個(gè)亞組分（Fr.8-1～8-9）。Fr. 8-5（60%甲醇洗脫部位，18.1 g）經(jīng)硅膠柱色譜分離，依次用石油醚：丙酮（50∶0→0∶100）梯度洗脫，得到7 個(gè)流分（Fr. 8-5a～8-5g）；Fr. 8-5e 經(jīng)制備型HPLC 制備（60%甲醇-水）得化合物6（12.0 mg，tR＝28.0 min）、7（2.0 mg，tR＝22.0 min）、19（2.6 mg，tR＝23.0 min）。

Fr. 10（31.0 g）經(jīng)硅膠柱色譜分離，依次用石油醚-丙酮（100∶0→0∶100）梯度洗脫，得到10個(gè)流分（Fr. 10-1～10-10）。Fr. 10-6（12.5 g）經(jīng)MCI柱色譜分離，依次用甲醇-水（30%～100%）梯度洗脫，得到5 個(gè)亞組分（Fr. 10-6a～10-6e）。Fr. 10-6a（30%甲醇洗脫部位，4.8 g）經(jīng)硅膠柱色譜分離，依次用石油醚-丙酮（50∶0→0∶100）梯度洗脫，經(jīng)制備型HPLC 制備（70%甲醇-水）得化合物18（6.0 mg，tR＝27.0 min）、17（7.5 mg，tR＝46.0 min）、16（20.0 mg，tR＝57.0 min）。

醋酸乙酯部位總浸膏（450 g）經(jīng)硅膠柱色譜分離，依次用石油醚-丙酮系統(tǒng)（50∶1→0∶100）梯度洗脫，得到8 個(gè)流分（Fr. A～H）。Fr. G（45.0 g）經(jīng)硅膠柱色譜分離，依次用石油醚：丙酮（50∶0→0∶100）梯度洗脫，得到6 個(gè)組分（Fr. G-1～G-6）。Fr. G-3 經(jīng)凝膠柱色譜分離得到6 個(gè)流分（Fr.G-3-1～G-3-6），F(xiàn)r. G-3-3 經(jīng)制備型HPLC 制備（30%甲醇-水）得化合物22（10.2 mg，tR＝30.0 min）。Fr.G-3-2 半制備型HPLC 制備（28%甲醇-水）得化合物20（2.0 mg，tR＝9.0 min）、14（2.6 mg，tR＝48.0 min）、15（2.3 mg，tR＝36.3 min）。

2.2 細(xì)胞培養(yǎng)

PC-12 細(xì)胞用含10%FBS 的1640 培養(yǎng)液培養(yǎng)，放置于37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，根據(jù)細(xì)胞生長(zhǎng)狀況，待細(xì)胞長(zhǎng)至布皿80%時(shí)進(jìn)行消化傳代。每48 小時(shí)更換新鮮培養(yǎng)基，取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞用于實(shí)驗(yàn)。

2.3 MTT 法檢測(cè)化合物對(duì)Aβ25-35 誘導(dǎo)PC-12 細(xì)胞的保護(hù)作用

取生長(zhǎng)狀態(tài)良好，融合度為90%的PC-12 細(xì)胞，以2×104個(gè)/mL 接種于96 孔板中。培養(yǎng)24 h 后分為對(duì)照組、模型組（20 μmol/L Aβ25-35）、陽(yáng)性藥組（20 μmol/L Aβ25-35＋10 μmol/L 白藜蘆醇）和各給藥組（20 μmol/L Aβ25-35＋10 μmol/L 待測(cè)化合物），培養(yǎng)24 h 后，每孔加入MTT 溶液（5 mg/mL）20 μL，繼續(xù)培養(yǎng)4 h，小心吸凈培養(yǎng)液，每孔加入DMSO 150 μL，振蕩10 min 使其完全溶解。酶標(biāo)儀490 nm測(cè)定各孔吸光度（A）值。

2.4 實(shí)時(shí)無(wú)標(biāo)記動(dòng)態(tài)細(xì)胞分析技術(shù)（realtime cellular analysis，RTCA）檢測(cè)化合物的EC50 值

取生長(zhǎng)狀態(tài)良好，融合度為90%的PC-12 細(xì)胞，以1×104個(gè)/mL，每孔200 μL 接種于16 孔板中。24 h 后分為對(duì)照組、模型組（20 μmol/L Aβ25-35）和不同濃度給藥組（0.01、0.1、1、10、50、100 μmol/L待測(cè)化合物），繼續(xù)培養(yǎng)72 h。細(xì)胞實(shí)時(shí)分析系統(tǒng)檢測(cè)細(xì)胞活力，計(jì)算各化合物的EC50值[11]。

3 結(jié)構(gòu)鑒定

化合物1：無(wú)色油狀物，易溶于氯仿。ESI-MSm/z: 407 [M＋Na]+。1H-NMR (500 MHz, CDCl3)δ:6.89 (2H, d,J= 12.0 Hz, H-5′, 6′), 6.73 (2H, s, H-2,2′), 5.96 (2H, s, OCH2O), 5.85 (1H, ddd,J= 13.5, 6.5,1.0 Hz, H-10), 5.32 (1H, s, H-8), 5.16 (2H, dd,J=13.5, 1.0 Hz, H-11), 3.38 (3H, s, 1-OCH3), 3.05 (2H,d,J= 6.5 Hz, H-9), 2.98 (1H, s, H-5), 2.72 (1H, dt,J=8.5, 7.0 Hz, H-7), 2.42 (1H, d,J= 8.5 Hz, H-6), 2.21(3H, s, 8-OAc), 1.02 (3H, d,J= 7.0 Hz, 7-CH3)；13C-NMR (125 MHz, CDCl3)δ: 197.5 (C-4), 169.2(8-OAc), 148.8 (C-3′, 4′), 146.4 (C-2), 140.0 (C-1′),135.1 (C-3), 134.3 (C-10), 121.5 (C-6′), 117.6 (C-11),108.3 (C-5′), 108.1 (C-2′), 101.0 (OCH2O), 88.4(C-1), 75.1 (C-8), 60.7 (C-5), 54.0 (1-OCH3), 51.5(C-6), 46.6 (C-7), 32.4 (C-9), 21.2 (8-OAc), 13.1(7-CH3)。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)報(bào)道一致[12]，故鑒定化合物1 為puberulin。

化合物4：無(wú)色油狀物，易溶于氯仿。ESI-MSm/z: 379 [M＋Na]+。1H-NMR (500 MHz, CDCl3)δ:7.03 (1H, d,J= 1.7 Hz, H-2), 6.88 (2H, overlapped,H-5, 6), 6.22 (1H, d,J= 1.3 Hz, H-6′), 5.90 (1H, s,H-3′), 5.85 (1H, m, H-8′), 5.24 (1H, s, H-7), 5.13 (2H,m, H-9′), 3.91 (6H, s, 3, 4-OCH3), 3.14 (2H, m, H-7′),3.05 (3H, s, 5′-OCH3), 2.71 (1H, m, H-8), 1.14 (3H, d,J= 7.0 Hz, H-9)；13C-NMR (125 MHz, CDCl3) 顯示了21 個(gè)碳信號(hào)，結(jié)合1H-NMR、HMBC 及HSQC首次歸屬了碳譜數(shù)據(jù)，結(jié)果如下：δ: 187.3 (C-2′),173.1 (C-4′), 148.8 (C-5), 148.6 (C-4), 142.7 (C-1′),135.1 (C-8′), 132.7 (C-6′), 132.0 (C-1), 118.2 (C-9′),117.2 (C-2), 110.7 (C-3), 109.0 (C-6), 104.7 (C-3′),94.7 (C-7), 81.2 (C-5′), 55.9 (3, 4-OCH3), 50.5(5′-OCH3), 46.8 (C-8), 33.3 (C-7′), 16.2 (C-9)。其理化性質(zhì)及1H-NMR 波譜數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)報(bào)道一致[15]，故鑒定化合物4 為海風(fēng)藤酮。

化合物5：白色結(jié)晶（氯仿）。ESI-MSm/z: 411[M＋Na]+。1H-NMR (500 MHz, CDCl3)δ: 6.98 (1H,s, H-7), 6.51 (1H, s, H-2), 6.51 (1H, s, H-5), 6.17 (1H,s, H-6′), 5.89 (1H, m, H-8′), 5.85 (1H, s, H-3′), 5.12(2H, t,J= 15.6 Hz, H-9′), 3.86 (9H, s, 3, 4, 5-OCH3),3.80 (3H, s, 4′-OCH3), 3.28 (3H, s, 5′-OCH3), 3.16(2H, m, H-7′), 1.70 (3H, d,J= 1.1 Hz, H-9)；13C-NMR (125 MHz, CDCl3)δ: 187.6 (C-2′), 173.4(C-4′), 152.8 (C-5), 141.9 (C-3, 1′), 139.5 (C-4), 136.7(C-1, 6′), 133.4 (C-7, 8′), 127.3 (C-8), 115.9 (C-9′),106.2 (C-6, 3′), 104.9 (C-2), 79.7 (C-5′),59.7(4′-OCH3), 55.4 (3, 4, 5-OCH3), 51.4 (5′-OCH3), 32.4(C-7′), 12.9 (C-9)。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)報(bào)道一致[15]，故鑒定化合物5 為山蒟素C。

化合物6：淡黃色油狀物，易溶于氯仿。ESI-MSm/z: 251 [M＋Na]+。1H-NMR (500 MHz, CDCl3)δ:8.11 (2H, d,J= 7.8 Hz, H-2′, 6′), 7.59 (1H, t,J= 7.3 Hz, H-4′), 7.47 (2H, t,J= 7.7 Hz, H-3′, 5′), 7.28 (1H,overlapped, H-5), 7.03 (1H, d,J= 7.5 Hz, H-6), 6.96(1H, s, H-2), 6.84 (1H, dd,J= 8.1, 2.5 Hz, H-4), 5.35(2H, s, H-7)；13C-NMR (125 MHz, CDCl3)δ: 166.5(C-7′), 155.8 (C-3), 137.7 (C-1), 133.1 (C-4′), 130.0(C-5), 129.9 (C-1′), 129.7 (C-2′, 6′), 128.4 (C-3′, 5′),120.2 (C-6), 115.2 (C-2), 114.9 (C-4), 66.3 (C-7)。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)報(bào)道一致[16]，故鑒定化合物6 為3-羥基苯甲酸芐酯。

化合物7：淡黃色油狀物，易溶于氯仿。ESI-MSm/z: 251 [M＋Na]+。1H-NMR (500 MHz, CDCl3)δ:8.09 (2H, d,J= 7.6 Hz, H-2′, 6′), 7.59 (1H, t,J= 7.4 Hz, H-4′), 7.46 (2H, t,J= 7.4 Hz, H-3′, 5′), 7.39 (1H,d,J= 7.4 Hz, H-6), 7.32 (1H, t,J= 7.7 Hz, H-4), 7.00(1H, d,J= 8.0 Hz, H-3), 6.95 (1H, t,J= 7.4 Hz, H-5),5.40 (2H, s, H-7)；13C-NMR (125 MHz, CDCl3)δ:168.7 (C-7′), 155.7 (C-2), 133.7 (C-4′), 132.2 (C-6),131.1 (C-4), 130.0 (C-2′, 6′), 129.2 (C-1), 128.5 (C-3′,5′), 121.7.(C-1′), 120.6 (C-5), 117.6 (C-3), 63.8 (C-7)。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)報(bào)道一致[17]，故鑒定化合物7 為2-羥基苯甲酸芐酯。

化合物8：淡黃色油狀物，易溶于氯仿。ESI-MSm/z: 311 [M＋Na]+。1H-NMR (500 MHz, CDCl3)δ:8.08 (2H, dd,J= 8.0, 1.3 Hz, H-2′, 6′), 7.58 (1H, t,J=8.0 Hz, H-4′), 7.47 (2H, t,J= 8.0 Hz, H-3′, 5′), 6.12(1H, d,J= 5.6 Hz, H-6), 6.08 (1H, dd,J= 9.4, 5.6 Hz,H-5), 5.88 (1H, dd,J= 9.4, 3.9 Hz, H-4), 5.54 (1H,dd,J= 7.6, 3.9 Hz, H-3), 5.09 (1H, d,J= 13.4 Hz,H-7a), 4.98 (1H, d,J= 13.4 Hz, H-7b), 4.55 (1H, d,J= 7.6 Hz, H-2), 2.09 (3H, s, H-2′′)；13C-NMR (125 MHz, CDCl3)δ: 171.1 (C-1′′), 166.4 (C-7′), 135.1(C-1), 133.2 (C-4′), 129.7 (C-2′, 6′), 129.7 (C-1′),128.5 (C-3′, 5′), 125.5 (C-5), 125.1 (C-6), 122.8 (C-4),75.1 (C-3), 70.2 (C-2), 64.7 (C-7), 21.3 (C-2′′)。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)報(bào)道一致[18]，故鑒定化合物 8 為cherrevenol D。

化合物12：無(wú)色油狀物，易溶于氯仿。ESI-MSm/z: 175 [M＋Na]+。1H-NMR (500 MHz, CDCl3)δ:9.85 (1H, s, H-7), 7.45 (1H, dd,J= 8.5, 1.5 Hz, H-6),7.44 (1H, d,J= 1.5 Hz, H-2), 7.07 (1H, d,J= 8.5 Hz,H-5), 3.99 (3H, s, 3-OCH3)；13C-NMR (125 MHz,CDCl3)δ: 190.9 (C-7), 151.7 (C-4), 147.1 (C-3), 129.8(C-1), 127.5 (C-6), 114.4 (C-5), 108.7 (C-2), 56.1(3-OCH3)。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)報(bào)道一致[21]，故鑒定化合物12 為香草醛。

化合物13：白色粉末，易溶于氯仿。ESI-MSm/z:219 [M＋Na]+。1H-NMR (500 MHz, CDCl3)δ: 10.34(1H, s, H-7), 7.35 (1H, s, H-6), 6.51 (1H, s, H-3), 3.97(3H, s, 8-OCH3), 3.96 (3H, s, 9-OCH3), 3.88 (3H, s,10-OCH3)；13C-NMR (125 MHz, CDCl3)δ: 188.0(C-7), 158.7 (C-4), 156.8 (C-5), 143.5 (C-2), 117.4(C-1), 109.0 (C-6), 96.0 (C-3), 56.3 (10-OCH3),56.2 (8-OCH3), 56.2 (9-OCH3)。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)報(bào)道一致[22]，故鑒定化合物13 為細(xì)辛醛。

化合物14：黃色油狀物，易溶于氯仿。ESI-MSm/z: 231 [M＋Na]+。1H-NMR (500 MHz, CDCl3)δ:6.72 (1H, s, H-2), 6.56 (1H, s, H-5), 5.99 (1H, ddt,J=16.8, 10.4, 6.4 Hz, H-2′), 5.04 (2H, m, H-3′), 3.90(3H, s, 4-OCH3), 3.85 (3H, s, 3-OCH3), 3.83 (3H, s,6-OCH3), 3.35 (2H, d,J= 6.4 Hz, H-1′)；13C-NMR(125 MHz, CDCl3)δ: 151.4 (C-2), 147.9 (C-4), 143.0(C-3), 137.3 (C-2′), 120.1 (C-1), 114.0 (C-2), 98.1(C-5), 115.2 (C-3′), 56.6 (6-OCH3), 56.6 (4-OCH3),56.3 (3-OCH3), 33.7 (C-1′)。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)報(bào)道一致[23]，故鑒定化合物14 為β-細(xì)辛醚。

化合物15：白色粉末，易溶于氯仿。ESI-MSm/z:231 [M＋Na]+。1H-NMR (500 MHz, CDCl3)δ: 6.96(1H, s, H-2), 6.67 (1H, dd,J= 15.8, 1.6 Hz, H-1′),6.51 (1H, s, H-5), 6.12 (1H, dq,J= 15.8, 6.6 Hz,H-2′), 3.83 (3H, s, 6-OCH3), 3.79 (3H, s, 3-OCH3),3.77 (3H, s, 4-OCH3), 1.91 (3H, d,J= 6.6 Hz, H-3′)；13C-NMR (125 MHz, CDCl3)δ: 150.7 (C-6), 148.7(C-4), 143.4 (C-3), 125.1 (C-1′), 124.4 (C-2′), 119.0(C-1), 109.8 (C-2), 98.0 (C-5), 56,7 (6-OCH3), 56.3(4-OCH3), 56.1 (3-OCH3), 18.8 (C-3′)。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)報(bào)道一致[23]，故鑒定化合物15 為α-細(xì)辛醚。

化合物16：黃色晶體（甲醇）。ESI-MSm/z: 318[M＋Na]+。1H-NMR (500 MHz, CD3OD)δ: 9.36 (1H,m, H-5), 7.85 (1H, m, H-8), 7.48 (2H, m, H-6), 7.23(1H, s, H-9), 4.42 (3H, s, 4-OCH3), 3.95 (3H, s,3-OCH3)；13C-NMR (125 MHz, CD3OD)δ: 168.3(C-11), 153.1 (C-2, 4), 139.5 (C-3), 134.1 (C-10),133.2 (C-9a), 128.1 (C-8), 127.1 (C-5), 126.9 (C-5a),126.2 (C-4a), 125.5 (C-6), 124.8 (C-7), 111.7 (C-10a),105.9 (C-1, 9), 61.6 (4-OCH3), 60.6 (3-OCH3)。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)報(bào)道一致[24]，故鑒定化合物16 為胡椒內(nèi)酰胺D。

化合物17：無(wú)色晶體（甲醇）。ESI-MSm/z:144[M＋Na]+。1H-NMR (500 MHz, CD3OD)δ: 4.29 (1H,dd,J= 9.0, 4.4 Hz, H-5), 3.75 (3H, s, H-1′), 2.47 (1H,m, H-4), 2.33 (2H, m, H-3), 2.15 (1H, m, H-4)；13C-NMR (125 MHz, CD3OD)δ: 181.1 (C-2), 174.5(C-6), 57.1 (C-5), 52.9 (C-1′), 30.3 (C-3), 25.3 (C-4)。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)報(bào)道一致[25]，故鑒定化合物17 為焦谷氨酸甲酯。

化合物18：黃色粉末，易溶于甲醇。ESI-MSm/z:293 [M＋Na]+。1H-NMR (500 MHz, CDCl3)δ: 8.04(1H, s, H-2), 7.37 (2H, d,J= 8.3 Hz, H-2′, 6′), 6.84(2H, t,J= 8.3 Hz, H-3′, 5′), 6.32 (1H, d,J= 2.0 Hz,H-8), 6.21 (1H, t,J= 2.0 Hz, H-6)；13C-NMR (125 MHz, CDCl3)δ: 180.8 (C-4), 165.2 (C-7), 162.2(C-5), 158.4 (C-4′), 157.4 (C-9), 153.3 (C-2), 130.0(C-2′, 6′), 122.0 (C-3), 123.3 (C-1′), 114.9 (C-3′, 5′),104.7 (C-10), 99.0 (C-6), 93.5 (C-8)。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)報(bào)道一致[26]，故鑒定化合物18 為三羥基異黃酮。

化合物19：黃色油狀物，易溶于氯仿。ESI-MSm/z: 255 [M＋Na]+。1H-NMR (500 MHz, CDCl3)δ:6.23 (1H, d,J= 3.4 Hz, H-13a), 5.51 (1H, d,J= 2.9 Hz, H-13b), 5.29 (1H, brs, H-15a), 5.09 (1H, brs,H-15b), 4.92 (1H, brs, H-14a), 4.84 (1H, brs, H-14b),3.98 (1H, t,J= 9.3 Hz, H-6), 2.94 (1H, overlapped,H-1), 2.90 (1H, overlapped, H-7), 2.88 (1H,overlapped, H-5), 2.53(1H, m, H-3b), 2.50 (1H,overlapped, H-9a), 2.50 (1H, overlapped, H-9b), 2.26(1H, m, H-8a), 2.18 (1H, m, H-8b), 2.23 (1H, m,H-3a), 1.97 (1H, m, H-2a), 1.89 (1H, m, H-2b)；13C-NMR (125 MHz, CDCl3)δ: 170.0 (C-12), 151.2(C-4), 149.2 (C-10), 139.8 (C-11), 120.2 (C-13), 112.6(C-14), 109.6 (C-15), 85.2 (C-6), 52.0 (C-5), 47.7(C-1), 45.1 (C-7), 36.3 (C-9), 32.6 (C-3), 30.9 (C-8),30.3 (C-2)。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)報(bào)道一致[27]，故鑒定化合物19 為去氫木香內(nèi)酯。

化合物20：黃色油狀物，易溶于氯仿。ESI-MSm/z: 255 [M＋Na]+。1H-NMR (500 MHz, CDCl3)δ:6.25 (1H, d,J= 3.4 Hz, H-13b), 5.50 (1H, d,J= 3.0 Hz, H-13a), 4.83 (1H, d,J= 10.5 Hz, H-1), 4.72 (1H,d,J= 9.7 Hz, H-5), 4.55 (1H, t,J= 9.3 Hz, H-6), 2.55(1H, t,J= 9.3 Hz, H-7), 2.44 (1H, overlapped, H-9a),2.43 (1H, m, H-3b), 2.43 (1H, overlapped, H-9b), 2.31(1H, m, H-8a) , 2.29 (1H, m, H-3a), 2.27 (1H, m,H-8b), 2.02 (1H, m, H-2a), 1.99 (1H, m, H-2b), 1.66(3H, s, H-15), 1.40 (3H, s, H-14)；13C-NMR (125 MHz, CDCl3)δ: 170.4 (C-12), 141.4 (C-11), 140.1(C-4), 136.6 (C-10), 127.1 (C-5), 127.0 (C-1), 119.6(C-13), 81.9 (C-6), 50.4 (C-5), 41.3 (C-3), 39.5 (C-9),28.0 (C-2), 26.2 (C-8), 17.3 (C-15), 16.1 (C-14)。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)報(bào)道一致[28]，故鑒定化合物20 為木香內(nèi)酯。

化合物21：無(wú)色油狀物，易溶于氯仿。ESI-MSm/z: 243 [M＋Na]+。1H-NMR (500 MHz, CDCl3)δ:4.70 (2H, d,J= 13.1 Hz, H-15), 2.44 (1H, dd,J=13.1, 6.1 Hz, H-1), 2.23 (1H, m, H-9a), 2.07 (1H, m,H-9b), 2.00 (1H, m, H-3a), 1.92 (1H, m, H-3b), 1.79(1H, m, H-5), 1.66 (1H, m, H-2a), 1.56 (1H, m, H-8a),1.55 (1H, m, H-2b), 1.34 (1H, m, H-8b), 1.30 (3H, s,H-14), 1.01 (3H, s, H-13), 0.99 (3H, s, H-12), 0.73(1H, m, H-7), 0.49 (1H, dd,J= 11.2, 9.5 Hz, H-6)；13C-NMR (125 MHz, CDCl3)δ: 153.4 (C-10), 106.3(C-15), 81.0 (C-4), 54.3 (C-5), 53.4 (C-1), 41.7 (C-3),38.9 (C-9), 30.0 (C-6), 27.5 (C-7), 26.7 (C-2), 26.1(C-14), 24.8 (C-8), 20.2 (C-12), 16.3 (C-13)。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)報(bào)道一致[29]，故鑒定化合物21 為spathulenol。

化合物22：白色粉末，易溶于氯仿。ESI-MSm/z:437 [M＋Na]+。1H-NMR (500 MHz, CDCl3)δ: 5.36(1H, m, H-6), 3.54 (3H, m, H-3), 2.29 (2H, m, H-4),2.02 (1H, m, H-8), 1.87 (1H, overlapped, H-1a), 1.86(1H, overlapped, H-2a), 1.86 (1H, overlapped, H-7a),1.60 (1H, overlapped, H-7b), 1.60 (1H, overlapped,H-2b), 1.12 (1H, overlapped, H-1b), 0.93 (3H, s,H-19), 0.83 (3H, d,J= 6.5 Hz, H-21), 0.76 (3H, t,J=7.5 Hz, H-29), 0.75 (3H, d,J= 6.8 Hz, H-26), 0.73(3H, d,J= 7.0 Hz, H-27), 0.60 (3H, s, H-18)；13C-NMR (125 MHz, CDCl3)δ: 140.9 (C-5), 121.9(C-6), 72.0 (C-3), 56.9 (C-14, 17), 50.3 (C-9), 46.3(C-24), 42.5 (C-13, 4), 40.0 (C-12), 37.4 (C-1), 36.7(C-10), 36.5 (C-20), 34.5 (C-28), 32.1 (C-8), 31.8(C-2, 7), 29.5 (C-25), 28.9 (C-16), 26.3 (C-22), 24.5(C-15), 23.2 (C-23), 21.2 (C-11), 20.2 (C-27), 20.0(C-21), 19.8 (C-19), 19.5 (C-26), 19.2 (C-29), 12.1(C-18)。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)報(bào)道一致[21]，故鑒定化合物22 為β-谷甾醇。

4 對(duì)Aβ25-35 誘導(dǎo)PC-12 細(xì)胞損傷的保護(hù)作用

體外建立Aβ25-35誘導(dǎo)PC-12 細(xì)胞損傷模型，對(duì)海風(fēng)藤中分離鑒定的部分新木脂素類化合物（1～4）和倍半萜類化合物（19、21）進(jìn)行活性篩選。結(jié)果顯示，在10 μmol/L 濃度下，與對(duì)照組相比，化合物2、4、19、21 可顯著提高PC-12 細(xì)胞活力（P＜0.05、0.01，圖1），其EC50值分別為11.1、27.3、32.9、29.3 μmol/L，陽(yáng)性對(duì)照藥白藜蘆醇的EC50值為14.3 μmol/L。

5 討論

本實(shí)驗(yàn)從海風(fēng)藤二氯甲烷和醋酸乙酯提取物中分離鑒定了22 個(gè)化合物，其中化合物1～5 為新木脂素類化合物，化合物6～15 為芳香酯、芳香醛及簡(jiǎn)單苯丙素類化合物，化合物16、17 為酰胺生物堿類化合物，化合物18 為異黃酮類化合物，化合物19～22 為倍半萜及甾體類化合物。其中，化合物3、6～8、19～20 為首次從胡椒屬中分離得到，化合物15、21 為首次從海風(fēng)藤中分離得到。其中化合物4 的13C-NMR 波譜數(shù)據(jù)為首次報(bào)道。體外神經(jīng)保護(hù)活性結(jié)果表明新木脂素類化合物（2、4）和倍半萜類化合物（19、21）對(duì)Aβ25-35誘導(dǎo)PC-12 細(xì)胞損傷具有顯著保護(hù)作用。本研究不僅進(jìn)一步豐富了海風(fēng)藤中化學(xué)成分的結(jié)構(gòu)多樣性，而且對(duì)海風(fēng)藤在治療和預(yù)防阿爾茨海默癥等神經(jīng)退行性疾病方面的研究具有一定的參考價(jià)值。

利益沖突所有作者均聲明不存在利益沖突