王彥尊 王文浩 何麗芬 閆玉星 張 紅 劉文俊 鄭洪元 王彥雯

（1 山西農(nóng)業(yè)大學經(jīng)濟作物研究所，汾陽032300；2 山西省文水縣農(nóng)業(yè)農(nóng)村局，文水032100）

由 核 盤 菌（Sclerotinia sclerotiorum（Lib.）de Bary）侵染引起的向日葵菌核病會使向日葵空籽率上升，產(chǎn)量降低，籽仁蛋白質(zhì)及含油量等營養(yǎng)物質(zhì)含量下降，影響籽粒的食用價值與商品價值，最終影響經(jīng)濟效益。核盤菌子囊孢子可以通過風力傳播，導致植株整個生育期均有染病可能性，防治時期難以掌握[1]。目前采用的防控措施主要包括農(nóng)藝措施、化學防治、生物防治和篩選抗病資源選育抗病品種。向日葵抗（耐）菌核病鑒定方法主要分為室內(nèi)與室外兩種條件下，其中室內(nèi)鑒定方法主要包括皮殼鑒定法、草酸鑒定法、菌土法鑒定和莖部或根頸部抗性鑒定等方法[2-6]，室外鑒定方法主要是使用牙簽法或打孔法將核盤菌接種在向日葵花盤背面[7]。向日葵菌核病主要在東北、華北、西北等種植區(qū)發(fā)生，發(fā)病率在10%～30%之間[8]，由此造成的減產(chǎn)嚴重的高達60%。培育和篩選對菌核病有抗性的向日葵育種材料仍然是未來向日葵育種家的首要任務[9]，也是防治該病害最經(jīng)濟有效的途徑之一[10-13]。

1 材料與方法

1.1 試驗材料供試品系：材料均來源于山西農(nóng)業(yè)大學經(jīng)濟作物研究所向日葵課題組自主收集、選育的種質(zhì)資源，具體見表1。供試菌株：核盤菌菌株。供試培養(yǎng)基：馬鈴薯葡萄糖培養(yǎng)基（PDA 培養(yǎng)基）、基本培養(yǎng)基。

表1 供試向日葵品系資源信息

1.2 試驗方法

1.2.1 病原菌的分離與純化核盤菌菌核取自山西農(nóng)業(yè)大學經(jīng)濟作物研究所食用向日葵試驗地中的發(fā)病植株。將收集到的菌核置于75%的酒精中消毒3～5s，用無菌水漂洗2 次，再用5%次氯酸鈉溶液消毒1～3min，75%的酒精中再次消毒3～5s 后，再用無菌水漂洗3 次，用滅菌過的濾紙吸干菌核周圍水分后，接種在PDA 培養(yǎng)基中，25℃恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)。

1.2.2 室內(nèi)抗菌核病能力鑒定當向日葵幼苗生長至3～4 對真葉時，取其葉片進行清洗并使用滅菌濾紙擦拭多余水分后，將試驗材料均勻地放在直徑15cm 的培養(yǎng)皿濾紙上，葉片背面朝上備用。將純化好的菌株，接種在PDA 培養(yǎng)基上，待菌落生長至培養(yǎng)皿3/4 時，取邊緣菌絲塊（直徑4mm），接種在基本培養(yǎng)基上培養(yǎng)，當菌落鋪滿培養(yǎng)皿的80%時，使用直徑4mm 的打孔器沿著菌落邊緣打取菌絲瓊脂塊，將其接種在待測葉片葉脈兩側(cè)，使核盤菌菌絲與葉片充分接觸，以未接菌的培養(yǎng)基瓊脂塊作為對照，每個材料重復3 次，定時觀察發(fā)病情況并拍照，用十字交叉法量取病斑直徑。

1.2.3 田間抗菌核病能力鑒定將核盤菌菌核接種在PDA 培養(yǎng)基中，置于24℃的恒溫培養(yǎng)箱進行生長繁殖14d 后，將培養(yǎng)基表面的菌核去除后稱重，將含菌絲的培養(yǎng)基粉碎后，加入無菌水配制成20g/L的菌絲懸浮液。待向日葵進入始花期，進行田間菌絲侵染花盤試驗，具體試驗方法為：將配制好的溶液均勻噴施在花盤正面的小花上，用牛皮紙袋包裹花盤做保濕處理并隔絕外部環(huán)境影響，每盤噴施量為5mL，每個品種接種10 盤，試驗重復3 次。接種30d 后進行病害調(diào)查與數(shù)據(jù)統(tǒng)計。

1.2.4 抗性篩選方法

1.2.4.1 室內(nèi)鑒定試驗 待葉片接種菌絲塊48h后，用十字交叉法量取病斑直徑，并根據(jù)表2 對菌核病抗性水平進行劃分。

表2 向日葵品系對菌核病抗性水平的劃分標準

1.2.4.2 室外鑒定試驗 向日葵花盤接種PDA 菌絲懸浮液30d 后，觀察花盤背面感病面積，統(tǒng)計感病植株數(shù)量及感病等級（表3），計算病情指數(shù)（病情指數(shù)=[∑（各級別花盤數(shù)×相對級數(shù)值）/調(diào)查總花盤數(shù)×4]×100）進而對被鑒定材料進行抗性評價。發(fā)病率（%）=發(fā)病花盤數(shù)/處理總花盤數(shù)×100。

表3 向日葵品系抗菌核病病情分級標準及抗性評價標準

2 結(jié)果與分析

2.1 菌株的分離純化及菌絲致病力鑒定將消毒菌核接種在PDA 培養(yǎng)基上，25℃恒溫培養(yǎng)2～3d 后，菌核附近可見白色菌絲生成，3～4d 后菌絲擴散至培養(yǎng)皿60%～75%，培養(yǎng)6～7d，培養(yǎng)基邊緣可見小顆粒菌核生成（圖1）。取培養(yǎng)3～4d 的PDA 培養(yǎng)基邊緣菌絲塊，接種在基本培養(yǎng)基上培養(yǎng)4～5d 后，取基本培養(yǎng)基邊緣菌絲塊接種在葉片背面的葉脈兩側(cè)，24h可見褐色壞死組織（圖2），48h 葉面出現(xiàn)大面積壞死組織（圖3），致病力較強。

圖1 核盤菌菌核在PDA 培養(yǎng)基培養(yǎng)7d 生長情況

圖2 向日葵葉片接種PDA 菌絲塊24h 的生長狀況

圖3 向日葵葉片接種PDA 菌絲塊48h 的生長狀況

2.2 不同向日葵品系對菌核病抗性的室內(nèi)鑒定以向日葵品系對菌核病抗性水平的劃分標準為依據(jù)，將供試的38 個品系進行離體葉片室內(nèi)鑒定，結(jié)果見表4。在所有供試材料中，自交系A35×B35（圖4）對菌核病表現(xiàn)出一定的抗病性，自交系A4×B4（圖5）對菌核病表現(xiàn)出一定的耐病性，其余品系均表現(xiàn)出不同程度的感病性，且未發(fā)現(xiàn)對菌核病產(chǎn)生免疫的向日葵品系。

圖4 自交系A35×B35 接種菌絲塊48h 的生長狀況

圖5 自交系A4×B4 接種菌絲塊48h 的生長狀況

表4 不同向日葵品系對菌核病抗性的室內(nèi)鑒定結(jié)果

2.3 不同向日葵品系對菌核病抗性的田間鑒定以向日葵抗菌核病病情分級標準及抗性評價標準為依據(jù)，將供試的38 個向日葵品系進行田間菌絲體懸浮液噴施鑒定，結(jié)果見表5。在所有供試材料中，A35×B35 與A4×B4 對菌核病表現(xiàn)出一定的抗病性，且A35×B35 向日葵花盤正面（圖6）發(fā)現(xiàn)有菌落生成，但背面（圖7）未出現(xiàn)盤腐癥狀，說明該材料對菌核病有一定的抵抗力，雖然核盤菌對向日葵進行了侵染并形成菌落，但未侵入植株內(nèi)部。D9 與N17 對菌核病也表現(xiàn)出一定的抗性，達到中抗水平，其余材料均表現(xiàn)出不同程度的感病性，如N7 花盤背面已經(jīng)出現(xiàn)腐爛情況，且侵染面積已經(jīng)超過75%（圖8），C32 花盤已嚴重腐爛并脫落（圖9），在脫落處可見新生成的核盤菌菌核。

圖6 自交系A35×B35 接種PDA 懸浮液30d 的生長狀況

圖7 自交系A35×B35 接種PDA 懸浮液30d 的生長狀況

圖8 自交系N7 接種PDA 懸浮液30d 的生長狀況

圖9 不育系C32 接種PDA 懸浮液30d 的生長狀況

表5 不同向日葵品系對菌核病抗性的田間鑒定結(jié)果

通過室內(nèi)離體葉片鑒定與室外PDA 菌絲懸浮液噴施鑒定試驗，綜合病情指數(shù)與葉片病斑平均直徑2 項指標，得出試驗結(jié)果如下：A35×B35（品系07（Y）-136A）在兩種鑒定方法下，均表現(xiàn)出一定的抗性，其為抗菌核病品系；A4×B4（品系07（Y）-141A）經(jīng)室外鑒定，結(jié)果為抗性材料，但經(jīng)離體葉片鑒定試驗，結(jié)果為耐性材料，綜合得出，該品系為耐菌核病材料；通過本試驗，篩選獲得抗菌核病材料A35×B35（品系07（Y）-136A）1 個，A4×B4（品系07（Y）-141A）、D9（品系11（CX）-1）、N17（品系15（HN）-34）耐病材料3 個，D13 等中感材料9 個，B21×A21 等感病材料16 個，D14 等高感材料9 個。

3 結(jié)論與討論

在向日葵生長過程中，均存在因感染菌核病導致大面積減產(chǎn)的現(xiàn)象，尤其是北方向日葵開花期到成熟期正逢雨季，連續(xù)降水會加重菌核病現(xiàn)象的發(fā)生，嚴重影響向日葵的生產(chǎn)效益與經(jīng)濟效益。因此，選育向日葵品種不僅要注重品質(zhì)與產(chǎn)量，還應當注重對菌核病的抵抗力。

核盤菌菌核致病力的強弱會隨著實驗室繼代培養(yǎng)次數(shù)的增加呈減弱趨勢，為保證核盤菌致病力，本試驗通過采集上一年度新生菌核并進行純化，用于菌核病抗性鑒定。而在常規(guī)大田噴施套袋保濕進行菌核病鑒定的試驗中，由于多雨濕度大等自然因素，會加重菌核病的發(fā)生，從而對品種抗菌核病鑒定造成影響，故而本試驗結(jié)合室內(nèi)離體葉片鑒定，綜合判斷品種抗（耐）菌核病能力強弱，一定程度上可降低誤差。本試驗通過對38 個不同向日葵品系進行綜合鑒定，共發(fā)現(xiàn)抗菌核病材料1個，耐病材料3個，感病材料25 個，高感材料9 個，為實現(xiàn)向日葵抗菌核病的育種目標奠定了基礎。