楊新河 王文鐸 許文婕 徐梅珍 譚志豪 呂幫玉

摘要：曲霉型豆豉作為我國的傳統(tǒng)豆豉之一，是一種藥食同源的調(diào)味副食品，同時(shí)是我國南方銷售量最大和食用范圍最廣的一類豆豉。文章綜述了曲霉型豆豉微生物、風(fēng)味成分及二者關(guān)聯(lián)性等方面的研究進(jìn)展，并對曲霉型豆豉未來研究進(jìn)行了展望。

關(guān)鍵詞：曲霉型豆豉；微生物；風(fēng)味成分

中圖分類號：TS214.2????? 文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A???? 文章編號：1000-9973（2023）12-0193-07

Research Progress of Microorganisms and Flavor Components

of Aspergillus-Type Fermented Soybeans

YANG Xin-he， WANG Wen-duo， XU Wen-jie， XU Mei-zhen， TAN Zhi-hao， LYU Bang-yu

（School of Food Science and Engineering， Guangdong Ocean University， Yangjiang 529500， China）

Abstract： Aspergillus-type fermented soybeans， as one of the traditional fermented soybeans in China， are a kind of medicinal and edible seasoning subsidiary food. They are also the best-selling and most widely consumed type of fermented soybeans in southern China. In this paper， the research progress of microorganisms and flavor components of Aspergillus-type fermented soybeans as well as the relevance between them are reviewed， and the prospect of future research on Aspergillus-type fermented soybeans is put forward.

Key words： Aspergillus-type fermented soybeans; microorganisms; flavor components

豆豉屬于中國傳統(tǒng)的發(fā)酵食品，生產(chǎn)歷史悠久，因其具有獨(dú)特風(fēng)味和高營養(yǎng)價(jià)值，與醬油、腐乳和豆醬一同被譽(yù)為中國四大傳統(tǒng)大豆發(fā)酵制品[1—3]。豆豉的原料黑豆或黃豆在自然發(fā)酵過程中受到了多種微生物的協(xié)同作用，經(jīng)過極其復(fù)雜的生物化學(xué)變化后形成特有的色、香、味。古人使用豆豉作為美食和入藥?，F(xiàn)代藥理研究表明，豆豉的功能特性包括良好的抗氧化性[4—7]、抗糖尿病[8—9]、降血壓[10—11]、預(yù)防乳腺癌和前列腺癌 [12—13]等。隨著《“健康中國2030”規(guī)劃綱要》的逐步實(shí)施，營養(yǎng)健康食品日漸受到人們的青睞，食品行業(yè)也進(jìn)入了健康與營養(yǎng)升級轉(zhuǎn)型加速期，食品科技創(chuàng)新更重視高品質(zhì)健康食品制造的基礎(chǔ)研究，因而具有營養(yǎng)健康屬性的豆豉也越來越受到消費(fèi)者及研究者的高度關(guān)注。

豆豉依據(jù)發(fā)酵主體微生物的不同，分為曲霉型豆豉、毛霉型豆豉、根霉型豆豉和細(xì)菌型豆豉，它們的品質(zhì)風(fēng)味特征之間的差異較大[14]。其中，曲霉型豆豉屬于歷史悠久的調(diào)味副食品，是中國南方銷售量最大和食用范圍最廣的一類豆豉[15]，含有多種有益于人體健康的營養(yǎng)成分[16—17］，且藥用價(jià)值較高[18—19]，代表性產(chǎn)品為廣東陽江豆豉和湖南瀏陽豆豉。近些年來，隨著發(fā)酵食品研究技術(shù)手段的不斷發(fā)展和人們對高品質(zhì)健康食品的重大需求，不同類型豆豉發(fā)酵微生物、風(fēng)味成分及生產(chǎn)工藝等方面的研究雖取得了積極進(jìn)展，但對曲霉型豆豉的研究成果缺少系統(tǒng)的疏理，不利于后續(xù)有針對性地開展研究及其成果應(yīng)用。本文綜述了近十余年來曲霉型豆豉微生物、風(fēng)味成分及二者關(guān)聯(lián)性等方面的研究進(jìn)展，并對曲霉型豆豉未來研究進(jìn)行了展望。

1 曲霉型豆豉微生物研究

豆豉主要依賴于在制曲和后發(fā)酵過程中微生物產(chǎn)生的酶系作用于發(fā)酵基質(zhì)（黑豆或黃豆）中的蛋白質(zhì)、淀粉、脂肪及次生代謝物質(zhì)等，經(jīng)過一系列復(fù)雜的生物轉(zhuǎn)化而形成其獨(dú)特風(fēng)味并提升其營養(yǎng)健康價(jià)值。因此，研究闡明曲霉型豆豉中微生物的多樣性、優(yōu)勢菌及其變化規(guī)律等對揭示其風(fēng)味品質(zhì)形成機(jī)理、優(yōu)化工藝及提升產(chǎn)品質(zhì)量等顯得尤為重要。

1.1 傳統(tǒng)培養(yǎng)方法

傳統(tǒng)培養(yǎng)方法指通過培養(yǎng)基對樣品中的微生物進(jìn)行分離、純化來獲得純種微生物的方法。該方法通常結(jié)合形態(tài)學(xué)觀察、生理生化檢驗(yàn)和分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)等手段來進(jìn)行菌種鑒定，獲得豆豉中的微生物多樣性信息[20]。

廖焰焰等[21]從曲霉型豆豉發(fā)酵樣品中分離純化獲得高產(chǎn)脂肪酶菌株8號，測出其脂肪酶活力為30 IU/mL，并結(jié)合形態(tài)學(xué)和分子生物學(xué)技術(shù)鑒定該菌株為米曲霉。楊林等[22]對曲霉型豆豉發(fā)酵樣品中微生物進(jìn)行了分離、初篩和復(fù)篩，得到高產(chǎn)蛋白酶的菌株1株，測定其酶活力為 2 231 U/L，并經(jīng)生理生化及16S rDNA分子鑒定該菌株為解淀粉芽孢桿菌。萬明等[23]從傳統(tǒng)曲霉型豆豉發(fā)酵階段的樣品中獲得高產(chǎn)酒精的菌株1株，用重鉻酸鉀法測定該菌株產(chǎn)乙醇的能力為2.14 mg/mL，并通過菌株形態(tài)學(xué)觀察及將其ITS序列輸入NCBI 中進(jìn)行Blast比對和構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹，鑒定出該菌株為釀酒酵母。管泳宇[24]開展了曲霉型豆豉的菌株篩選、誘變及工業(yè)化應(yīng)用研究，獲得高產(chǎn)酸發(fā)酵乳桿菌株、枯草芽孢桿菌株、高蛋白分解能力米曲霉、高蛋白降解率木糖葡萄球菌、畢赤酵母和黑曲霉菌株。此外，趙文鵬[25]利用傳統(tǒng)培養(yǎng)方法探究了曲霉型豆豉后發(fā)酵期間的微生物多樣性，結(jié)果表明真菌多樣性遠(yuǎn)小于細(xì)菌多樣性，且真菌及細(xì)菌多樣性整體呈下降趨勢，另外獲得18種菌株，其中后發(fā)酵期間的優(yōu)勢菌有雞葡萄球菌、貝萊斯芽孢桿菌和咸海鮮魏斯氏菌。

綜上可知，傳統(tǒng)培養(yǎng)法能獲得高產(chǎn)脂肪酶菌株、高產(chǎn)蛋白酶菌株、高產(chǎn)酸發(fā)酵乳桿菌等菌株，為多菌種復(fù)合發(fā)酵制作風(fēng)味良好的豆豉提供了基礎(chǔ)，同時(shí)為工業(yè)化生產(chǎn)酶提供了菌種資源，但獲得的菌種種類有限，也難以獲取曲霉型豆豉生產(chǎn)中菌種的動(dòng)態(tài)變化及菌種間的相互作用等信息。此外，由于可培養(yǎng)的微生物較少，了解的微生物信息甚至不到1%[26]，在曲霉型豆豉發(fā)酵期間所獲取的微生物多樣性信息非常有限，可能會(huì)埋沒大量極具應(yīng)用潛力的微生物資源。

1.2 現(xiàn)代分子生物學(xué)技術(shù)

現(xiàn)代分子生物學(xué)技術(shù)直接以從樣品中提取的核酸為分析對象，以特定的核酸片段為生物標(biāo)志物，理解該樣品中微生物的組成和多樣性，能夠較客觀地反映樣品中微生物信息。

趙文鵬等[27]依托高通量測序及統(tǒng)計(jì)分析揭示曲霉型豆豉發(fā)酵中細(xì)菌群落組成和演替規(guī)律，并分析了細(xì)菌群落演替與發(fā)酵環(huán)境變化之間的關(guān)聯(lián)。結(jié)果表明整個(gè)發(fā)酵過程的核心菌屬是葡萄球菌屬，相對豐度為24.16%～85.97%；細(xì)菌群落的多樣性和均勻度變化較大，不同階段群落的均勻度均具有顯著差異性（P＜0.05）；細(xì)菌群落的演替受到發(fā)酵環(huán)境因子的影響，其中主要驅(qū)動(dòng)因子為還原糖含量、pH值和溫度，而在實(shí)際生產(chǎn)中溫度可能是豆豉工業(yè)化生產(chǎn)過程中需要人為控制的重要因素。

文鶴等[28]通過Illumina 高通量測序技術(shù)分析了曲霉型豆豉發(fā)酵過程中可培養(yǎng)細(xì)菌群落的結(jié)構(gòu)組成和變化規(guī)律，結(jié)果表明在不同發(fā)酵時(shí)期細(xì)菌豐富度和多樣性呈先上升后下降的趨勢，以第5天細(xì)菌多樣性和豐富度最高；發(fā)酵前期5 d內(nèi)的優(yōu)勢菌群主要是不動(dòng)桿菌屬、克雷伯氏菌屬、變形桿菌屬和香味菌屬，發(fā)酵中后期第9～19天優(yōu)勢菌群主要是隸屬于厚壁菌門的芽孢桿菌屬；代謝的功能基因表達(dá)發(fā)酵前期顯著高于中后期，而環(huán)境信息處理和遺傳信息處理的功能基因表達(dá)則相反。

李世瑞等[29]采用454高通量焦磷酸測序技術(shù)研究了曲霉型豆豉發(fā)酵周期8個(gè)不同階段樣品細(xì)菌多樣性變化，結(jié)果表明細(xì)菌在門、綱兩個(gè)水平不同樣品主要微生物類別相似度很高，變形菌門、放線菌門和厚壁菌門三者占90%以上，但目、科、屬水平差別較大，魏斯氏菌屬、腸球菌屬、葡萄球菌屬、假單胞菌屬、乳球菌屬和芽孢桿菌屬出現(xiàn)在發(fā)酵不同階段且豐度差異較大。

總的來說，通過采用高通量測序技術(shù)研究來自不同廠家或不同發(fā)酵時(shí)期的曲霉型豆豉微生物，一定程度上明確了曲霉型豆豉發(fā)酵過程中微生物群落結(jié)構(gòu)的復(fù)雜性和相關(guān)樣品中的核心菌屬等信息，為后續(xù)挖掘與曲霉型豆豉品質(zhì)密切相關(guān)的微生物、闡述曲霉型豆豉生產(chǎn)機(jī)理和改進(jìn)生產(chǎn)工藝等方面的研究奠定了理論基礎(chǔ)。

1.3 傳統(tǒng)培養(yǎng)方法與現(xiàn)代分子生物學(xué)技術(shù)相結(jié)合

Zhang等[30]結(jié)合培養(yǎng)方法、高通量測序技術(shù)和發(fā)酵過程中理化性質(zhì)測定研究了豆豉的理化參數(shù)、微生物數(shù)量和細(xì)菌群落多樣性，結(jié)果表明豆豉發(fā)酵溫度呈先升后降變化，大多在45 ℃左右，但pH值持續(xù)下降至4.86；鹽含量維持在約6%；氨基酸態(tài)氮和總酸含量穩(wěn)步上升，而還原糖和總糖含量持續(xù)下降；細(xì)菌和真菌數(shù)量減少；曲霉型豆豉發(fā)酵前期細(xì)菌組成以葡萄球菌屬和乳酸桿菌屬為主，在中后期優(yōu)勢菌由乳酸桿菌和葡萄球菌向芽孢桿菌轉(zhuǎn)移，冗余分析表明pH和溫度是促進(jìn)菌群結(jié)構(gòu)轉(zhuǎn)變和影響菌群多樣性分布的重要環(huán)境參數(shù)。

李浩等[31]采用可培養(yǎng)法及高通量測序技術(shù)研究了曲霉型豆豉快速工藝及傳統(tǒng)工藝下的細(xì)菌演替，結(jié)果表明兩種工藝下可培養(yǎng)微生物的總量均持續(xù)減少，且細(xì)菌均占據(jù)絕對優(yōu)勢，主要含芽孢桿菌、葡萄球菌及乳桿菌；兩者優(yōu)勢門均為厚壁菌門，芽孢桿菌屬、賴氨酸芽孢桿菌屬、類芽孢桿菌屬為快速工藝下的主要優(yōu)勢屬，而葡萄球菌屬、棒狀桿菌屬、乳桿菌屬和魏斯氏菌屬為傳統(tǒng)工藝下的優(yōu)勢屬；兩種工藝特有屬的占比均低于5%；兩種工藝的菌群結(jié)構(gòu)波動(dòng)都較大，而快速工藝的菌群物種豐度更低，且基因功能注釋為增殖相關(guān)通路的占比更少（P＜0.05），說明該工藝的菌群或更多地維持低活性狀態(tài)。

Chen等[32]采用Illumina HiSeq測序揭示了瀏陽豆豉發(fā)酵過程中微生物多樣性的波動(dòng)特征，結(jié)果表明優(yōu)勢真菌為巖霉菌屬（74.57%）、根霉屬（10.93%）和青霉屬（2.68%），且Petromyces與Alternaria、Saccharomyces和Saccharomycetales_unclassified呈負(fù)相關(guān)，此外，首次分離獲得的4株非產(chǎn)毒黃曲霉菌株均表現(xiàn)出產(chǎn)高活性纖維素酶和蛋白酶及弱活性脂肪酶。

從理論上講，采用傳統(tǒng)培養(yǎng)方法與現(xiàn)代分子生物學(xué)技術(shù)相結(jié)合研究曲霉型豆豉微生物兼具二者優(yōu)點(diǎn)，但上述文獻(xiàn)報(bào)道大多停留在微生物的屬水平上進(jìn)行研究。此外，曲霉型豆豉微生物群落結(jié)構(gòu)、發(fā)酵環(huán)境及風(fēng)味成分三者之間的內(nèi)在關(guān)聯(lián)性缺乏同步研究，不能從根本上闡明曲霉型豆豉風(fēng)味品質(zhì)形成機(jī)理，也難為豆豉技術(shù)創(chuàng)新提供強(qiáng)有力的理論依據(jù)。

1.4 菌株產(chǎn)酶發(fā)酵條件優(yōu)化

研究發(fā)酵過程中溫度、環(huán)境pH值、氯化鈉濃度等條件對源自曲霉型豆豉中的相關(guān)菌株產(chǎn)酶活力的影響，獲得菌株適宜的作用條件，可為進(jìn)一步研究菌株在曲霉型豆豉色、香、味形成中的作用奠定基礎(chǔ)，對從根本上指導(dǎo)曲霉型豆豉改進(jìn)其生產(chǎn)模式或生產(chǎn)工藝，進(jìn)一步提高產(chǎn)品質(zhì)量等具有重要意義。

曲直等[33]對源自廣東陽江豆豉曲醅中的米曲霉菌株進(jìn)行培養(yǎng)基和發(fā)酵條件優(yōu)化的研究表明，該菌產(chǎn)酶最適培養(yǎng)基的組成為添加3%酵母粉、3%硝酸鈉、1%葡萄糖和0.50%氯化鈣于基礎(chǔ)PDA培養(yǎng)基中；該菌株產(chǎn)酶最優(yōu)發(fā)酵條件為pH值7～8，溫度30 ℃，250 mL三角瓶中裝瓶量為120 mL，綜合菌量和蛋白酶活力以培養(yǎng)48 h為最適發(fā)酵時(shí)間。

梁源等[34]對曲霉型豆豉釀造用米曲霉滬釀3.042產(chǎn)淀粉酶的研究表明，該淀粉酶最適作用pH值為4.5，最適作用溫度為55 ℃，酶活力為18.0 mg/h，在pH 4.0～6.0、30～50 ℃范圍內(nèi)其酶活力較穩(wěn)定，另外，氯化鈉對淀粉酶酶促反應(yīng)有明顯的抑制作用，其抑制效果隨著氯化鈉濃度的升高越發(fā)明顯。

上述研究分別獲得了1株米曲霉菌株產(chǎn)酶最適發(fā)酵條件和1株米曲霉滬釀3.042產(chǎn)淀粉酶最適作用條件，但需要進(jìn)一步探究菌株產(chǎn)酶對豆豉品質(zhì)形成的作用機(jī)理及產(chǎn)業(yè)化應(yīng)用。目前，從曲霉型豆豉中分離得到的菌株種類和數(shù)量少，開展菌株產(chǎn)酶發(fā)酵條件優(yōu)化在曲霉型豆豉生產(chǎn)中對其產(chǎn)品品質(zhì)的影響尚未引起業(yè)界的高度關(guān)注。

2 曲霉型豆豉風(fēng)味成分研究

消費(fèi)者更易接受風(fēng)味特征為滋味醇香、鮮美可口、醬香濃郁的豆豉，但豆豉風(fēng)味成分十分復(fù)雜，一直難以明確其關(guān)鍵風(fēng)味成分。近年來，隨著風(fēng)味成分研究技術(shù)包括固相微萃?。╯olid-phase microextraction， SPME）技術(shù)、氣相色譜-質(zhì)譜（gas chromatography-mass spectrometry，GC-MS）技術(shù)、氣相色譜-聞香法（gas chromatography-olfactometry，GC-O）等的普及與發(fā)展，曲霉型豆豉作為起源最早及分布最廣的豆豉，其風(fēng)味成分研究也取得了積極進(jìn)展。

2.1 揮發(fā)性風(fēng)味成分

湯啟成等[35]采用GC-MS在曲霉型豆豉中檢測出揮發(fā)性成分68 種，主體香氣物質(zhì)是冰乙酸、2-甲基丁醛、2-亞甲基-甲基環(huán)丙烷羧酸、2，5-二甲基吡嗪、苯甲酸、甲基麥芽酚、2，3，5-三甲基吡嗪、2-氨基-5-甲基苯甲酸、（R，R）-2，3-丁二醇和苯乙醛。謝艷華等[36]采用甲酯化處理正己烷提取所得的曲霉型豆豉中的粗脂肪，然后通過GC-MS分析脂肪酸組成及外標(biāo)法定量脂肪酸，結(jié)果表明曲霉型豆豉中均含有12 種脂肪酸，其中7種飽和脂肪酸、3種單不飽和脂肪酸、2種多不飽和脂肪酸，以亞油酸含量最高，飽和脂肪酸含量低于不飽和脂肪酸含量。

何桂強(qiáng)等[37]應(yīng)用頂空固相微萃?。╤eadspace solid-phase microextraction，HS-SPME）和GC-MS技術(shù)研究了毛霉型和曲霉型豆豉的揮發(fā)性組分特征，結(jié)果表明曲霉型豆豉中檢出揮發(fā)性組分52種，其酯類、醇類、酮類、酚類、酸類、醛類和吡嗪類化合物含量顯著低于毛霉型豆豉，并通過香氣活性值（odor activity value，OAV）輪廓分析表明，曲霉型豆豉中9-十八碳烯酸乙酯、苯甲醛、苯乙醛、1-辛烯-3-醇、亞油酸乙酯、3-甲基丁酸和2-甲氧基苯酚的OAV低于毛霉型豆豉。

Chen等[38]利用氣相色譜-嗅聞-質(zhì)譜（gas chromatography-olfactometry-mass spectrometry，GC-O-MS）聯(lián)用法檢測成品瀏陽豆豉的揮發(fā)性成分表明，GC-MS共檢測出揮發(fā)性成分55種，而GC-O技術(shù)共嗅聞出氣味峰29種，其中被GC-MS檢測到的氣味峰有22種，依據(jù)嗅聞出的氣味強(qiáng)度明確了瀏陽豆豉的主體香氣物質(zhì)為2-甲基丁醛、乙酸苯乙烯、丁酸苯乙酯、2-甲基丁酸乙酯、1-辛烯-3-醇、2-戊基呋喃、乙酸異戊酯、2，6-二甲基吡嗪、苯乙醛和苯乙醇。

李金林等[39]利用固相微萃取-氣相色譜-質(zhì)譜（solid-phase microextraction-gas chromatography-mass spectrometry， SPME-GC-MS）分析方法對曲霉型豆豉生產(chǎn)過程中的揮發(fā)性風(fēng)味成分變化進(jìn)行研究，結(jié)果表明豆豉以醛類、醇類、酚類和酯類為主體成分，制曲、后發(fā)酵和干燥階段的揮發(fā)性風(fēng)味成分分別為24，45，50種，其中后發(fā)酵階段揮發(fā)性風(fēng)味成分的數(shù)量和含量均顯著增加，是豆豉風(fēng)味形成的主要階段，而干燥階段雖會(huì)略微改變風(fēng)味物質(zhì)含量，但對豆豉整體風(fēng)味影響小。

Chen等[40]利用GC-MS和氣相-離子遷移譜（GC-IMS）兩種技術(shù)對瀏陽豆豉發(fā)酵過程中的揮發(fā)性成分變化進(jìn)行研究，GC-IMS技術(shù)檢測出揮發(fā)性成分80種，其中明確鑒定出50種，包括醇類12種、醛類12種、酸類3種、吡嗪類3種、酯類9種、酮類9種和酚類2種，通過對指紋圖譜的差異化分析，發(fā)現(xiàn)各發(fā)酵時(shí)期之間的揮發(fā)性成分差異較大；通過GC-MS共鑒定出81種揮發(fā)性成分，包括醇類14種、酯類13種、酸類7種、醛類6種、酮類5種、吡嗪類7種、酚類4種及其他類25種；對比兩種技術(shù)發(fā)現(xiàn)GC-MS和GC-IMS對揮發(fā)性成分的識別能力不同，其中GC-MS對高濃度的吡嗪類更敏感，GC-IMS對低濃度的醛類和酮類的敏感度更強(qiáng)；另外，GC-MS顯示醇類為L1時(shí)期的主要揮發(fā)性成分，而GC-IMS顯示醛類和酮類為L1時(shí)期的主要揮發(fā)性成分。綜上可知，GC-MS和GC-IMS確實(shí)對揮發(fā)性成分的敏感度存在差異，其中GC-IMS技術(shù)對痕量物質(zhì)檢測較準(zhǔn)確，更側(cè)重于分析揮發(fā)性成分的差異化，對通過揮發(fā)性成分差異區(qū)分各發(fā)酵階段更有優(yōu)勢。

文鶴等[41]通過SPME-GC-MS對曲霉型豆豉快速發(fā)酵工藝生產(chǎn)過程中揮發(fā)性成分的變化研究表明，檢測出的揮發(fā)性成分包括酯類、醛類、酸類、吡嗪類、酮類、酚類、醇類、芳香族、呋喃9大類化合物；其中蒸煮階段67種，主要包括醇類、酚類和醛類等，以1-辛烯-3-醇、正己醇和甲基麥芽酚的含量較高，其中1-辛烯-3-醇是豆腥味的主要來源;制曲階段70種，主要包括醇類、酸類、呋喃類和芳香族等，以1-辛烯-3-醇、苯乙烯和2-正戊基呋喃的含量較高，該階段發(fā)生了輕度的美拉德反應(yīng);洗曲階段67種，主要包括酸類、醇類、芳香族和呋喃等，大量1-辛烯-3-醇被水洗掉;后酵階段81種，主要包括醛類、酸類、酚類和吡嗪類等，該階段美拉德反應(yīng)劇烈，苯甲醛、2，5-二甲基吡嗪、2-甲基吡嗪、可卡醛、愈創(chuàng)木酚等揮發(fā)性成分大量形成，該階段是豆豉揮發(fā)性風(fēng)味成分形成的主要階段。

上述研究表明，采用GC-MS、GC-O-MS和GC-IMS等技術(shù)能檢測出曲霉型豆豉成品或其不同生產(chǎn)階段樣品中一定數(shù)量的揮發(fā)性成分，但成品中有益于品質(zhì)的關(guān)鍵揮發(fā)性成分、形成機(jī)理及其在生產(chǎn)過程中的變化規(guī)律等有待深入研究。

2.2 非揮發(fā)性風(fēng)味成分

王迪等[42]研究表明，在45～65 ℃的后發(fā)酵溫度內(nèi)，經(jīng)過修正的 Gompertz 方程可以很好地?cái)M合4種曲霉型豆豉的氨基酸態(tài)氮（amino acid nitrogen，AN） 生成動(dòng)力學(xué)（R2＞0.94），并且溫度越高，AN的最大值和生成速率越低，但不同大豆品種的豆豉間AN最大值和生成速率無明顯差異。相關(guān)性分析顯示，4種豆豉呈現(xiàn)一致的趨勢：溫度與總酸、AN呈負(fù)相關(guān)（P＜0.01），與褐變指數(shù)呈正相關(guān)（P＜0.01），并且4種豆豉中的游離氨基酸含量隨著溫度的升高而降低，這為研究曲霉型豆豉的后發(fā)酵工藝提供了理論支持。

2.3 接菌發(fā)酵對曲霉型豆豉風(fēng)味成分的影響

管泳宇[24]研究發(fā)現(xiàn)，整個(gè)發(fā)酵過程中接菌發(fā)酵豆豉蛋白酶活力、酸度和氨基酸態(tài)氮含量均高于自然發(fā)酵豆豉，脂肪含量低于自然發(fā)酵豆豉，接菌發(fā)酵豆豉的風(fēng)味較自然發(fā)酵豆豉的復(fù)合風(fēng)味表現(xiàn)出高醇高酯香特點(diǎn)；質(zhì)構(gòu)、感官評價(jià)均顯著（P<0.05）高于自然發(fā)酵豆豉。

于華等[43] 研究表明，在曲霉型豆豉生產(chǎn)過程中添加異常威克漢姆酵母對AN、醇類風(fēng)味物質(zhì)的形成貢獻(xiàn)巨大，其量超出空白0.188 g/100 g，醇類相對含量高達(dá)35%；添加乳酸片球菌對總酸、有機(jī)酸和酮類風(fēng)味物質(zhì)的形成貢獻(xiàn)較大，總酸含量超出空白0.392 g/100 g，使檸檬酸和琥珀酸分別增加了約8.6倍和23.5倍，并且生成2，3-丁二酮和乙偶姻風(fēng)味物質(zhì)；產(chǎn)酸芽孢桿菌單獨(dú)添加與乳酸片球菌、異常威克漢姆酵母2種菌復(fù)配以及3種功能菌復(fù)配對總酸和有機(jī)酸的形成均無太大促進(jìn)作用。

劉敏等[44]以大豆為原料，用總狀毛霉、米曲霉滬釀3.042分別純種制曲，研究豆豉在“傳統(tǒng)后發(fā)酵”中有關(guān)成分變化及其與生物胺的相關(guān)性表明，“傳統(tǒng)后發(fā)酵”中豆豉水分基本穩(wěn)定，總酸、AN和游離氨基酸先增加后穩(wěn)定，pH 先下降后穩(wěn)定，并且曲霉組有鳥氨酸與苯丙氨酸的脫羧酶活力，生物胺種類由腐胺、2-苯乙胺、亞精胺和精胺減少為腐胺和 2-苯乙胺，此外，后發(fā)酵期間總生物胺增加3.05倍。

由上述研究可知，添加外源性微生物對曲霉型豆豉的風(fēng)味品質(zhì)會(huì)產(chǎn)生一定的影響，不過有待深入研究精準(zhǔn)添加外源微生物提升曲霉型豆豉風(fēng)味品質(zhì)、優(yōu)良發(fā)酵劑制備及產(chǎn)業(yè)化應(yīng)用。

3 曲霉型豆豉微生物與風(fēng)味成分關(guān)聯(lián)性研究

Yang等[45]采用Illumina MiSeq測序和色譜法研究了曲霉型豆豉發(fā)酵過程中的細(xì)菌群落和揮發(fā)性成分，利用雙向正交偏最小二乘建模，并整合了7個(gè)發(fā)酵階段的曲霉型豆豉中微生物群落結(jié)構(gòu)與風(fēng)味化合物的數(shù)據(jù)，鑒定出參與風(fēng)味的核心功能微生物有16個(gè)細(xì)菌屬，揭示細(xì)菌為豆豉風(fēng)味的主要貢獻(xiàn)者。另外，豆豉的純菌發(fā)酵試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)魏斯氏菌與乳酸桿菌發(fā)酵后主體風(fēng)味為乳香，而芽孢桿菌及葡萄球菌發(fā)酵豆豉分別為豉香與醬香味[25]，還發(fā)現(xiàn)酯類、酮類、醇類中的多數(shù)風(fēng)味化合物是由乳酸菌和芽孢桿菌生成的，酸類主要由乳酸菌產(chǎn)生[46]。

李浩[47]將傳統(tǒng)曲霉型豆豉中的揮發(fā)性物質(zhì)與參與發(fā)酵的細(xì)菌群落進(jìn)行關(guān)聯(lián)性研究表明，14個(gè)關(guān)鍵菌屬中以葡萄球菌屬、乳酸桿菌屬、魏斯氏菌屬和片球菌屬最為重要，其中葡萄球菌屬與醛類、酮類和酸類的產(chǎn)生有關(guān)，乳酸桿菌屬、魏斯氏菌屬和片球菌屬與酸類和醛類的生成有重要關(guān)系，而芽孢桿菌屬與酮類和吡嗪類的生成有關(guān)。

上述研究從豆豉中篩選出了相關(guān)的核心菌群，也初步探明了部分核心菌屬與風(fēng)味成分生成的關(guān)聯(lián)性，這為深入研究豆豉風(fēng)味的形成規(guī)律提供了思路，也為下一步篩選適合工業(yè)發(fā)酵的菌株進(jìn)行復(fù)配發(fā)酵打下了實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。

4 展望

4.1 結(jié)合多種方法開展曲霉型豆豉微生物研究

采用傳統(tǒng)培養(yǎng)方法與現(xiàn)代分子生物學(xué)方法研究樣品中包含的微生物信息各有所長，同時(shí)運(yùn)用多種技術(shù)手段有助于更加全面地獲取樣品中的群落組成、優(yōu)勢菌株及其變化規(guī)律等方面的信息。其中，傳統(tǒng)培養(yǎng)方法具有操作簡便、鑒別較準(zhǔn)確、能夠直接獲得優(yōu)勢發(fā)酵菌株，從而進(jìn)一步開展相關(guān)菌株最適發(fā)酵條件優(yōu)化、所產(chǎn)蛋白酶結(jié)構(gòu)及作用條件、菌株在曲霉型豆豉中的復(fù)配實(shí)驗(yàn)等方面的研究，為改善曲霉型豆豉的風(fēng)味和對其深度開發(fā)利用提供了科學(xué)理論依據(jù)。近幾年來，采用高通量測序、擴(kuò)增子分析和宏基因組學(xué)等現(xiàn)代分子生物學(xué)方法探索傳統(tǒng)發(fā)酵食品微生物群落動(dòng)態(tài)和功能表征方面的應(yīng)用飛速發(fā)展[48]，對發(fā)酵食品繁復(fù)多變的微生物群落演替數(shù)據(jù)進(jìn)行整合，并從代謝通路和功能基因的視角更全面、深入、精準(zhǔn)地探討微生物對風(fēng)味形成的作用。目前，現(xiàn)代分子生物學(xué)方法中大多運(yùn)用高通量測序研究曲霉型豆豉微生物，而其他技術(shù)手段研究曲霉型豆豉微生物如何參與其風(fēng)味形成基本處于空白狀態(tài)。因此，后續(xù)應(yīng)加強(qiáng)傳統(tǒng)培養(yǎng)方法和眾多分子生物學(xué)方法相結(jié)合來進(jìn)行曲霉型豆豉中微生物組成、參與風(fēng)味形成及調(diào)控等方面的研究。

4.2 開展曲霉型豆豉中關(guān)鍵風(fēng)味成分挖掘研究

目前，曲霉型豆豉揮發(fā)性風(fēng)味成分主要采用GC-MS， 其次是GC-O/GC-IMS等技術(shù)研究其生產(chǎn)過程中樣品或成品揮發(fā)性風(fēng)味成分的種類和含量。實(shí)際上，檢測出的揮發(fā)性化合物中僅有少部分對曲霉型豆豉的香氣具有貢獻(xiàn)，稱之為香氣活性化合物[49]，因而不能簡單地僅采用揮發(fā)性物質(zhì)對曲霉型豆豉風(fēng)味進(jìn)行表征。而分子感官科學(xué)是將芳香提取物稀釋分析、GC-O和GC-MS等技術(shù)與感官分析相結(jié)合來準(zhǔn)確地定性和定量分析食品中關(guān)鍵風(fēng)味物質(zhì)，借助風(fēng)味物質(zhì)閾值計(jì)算香氣活性值并確定它們的重要性及重要性排序，依據(jù)食品中各風(fēng)味物質(zhì) “自然”的濃度構(gòu)建風(fēng)味重組物，然后通過風(fēng)味物質(zhì)缺失實(shí)驗(yàn)，以最少數(shù)量的物質(zhì)和最精準(zhǔn)的含量篩選出與食品香氣輪廓非常接近的香氣重組物，進(jìn)而從分子層面揭示食品風(fēng)味物質(zhì)組成的目的[50—51]。因此，后續(xù)應(yīng)加強(qiáng)運(yùn)用分子感官科學(xué)技術(shù)在分子水平上定性、定量地研究曲霉型豆豉的感官質(zhì)量，精確構(gòu)建風(fēng)味重組模型，精準(zhǔn)獲得曲霉型豆豉中關(guān)鍵性揮發(fā)性風(fēng)味成分，為探明關(guān)鍵性揮發(fā)性風(fēng)味成分在曲霉型豆豉加工中的變化規(guī)律提供研究基礎(chǔ)。另外，目前對曲霉型豆豉的非揮發(fā)性風(fēng)味成分研究不多，為了制造高品質(zhì)健康曲霉型豆豉，也應(yīng)加強(qiáng)其非揮發(fā)性風(fēng)味成分的研究。

4.3 開展曲霉型豆豉微生物組成、關(guān)鍵風(fēng)味成分及環(huán)境因子三者變化規(guī)律同步研究

從微生物與風(fēng)味角度分析，曲霉型豆豉發(fā)酵過程中的微生物是其風(fēng)味形成的生物學(xué)基礎(chǔ)。豆豉中已被檢測到的風(fēng)味成分有上百種，而微生物有上百種甚至千種，這意味著豆豉風(fēng)味形成與微生物組成變化緊密相關(guān)。在研究曲霉型豆豉微生物多樣性和風(fēng)味成分變化的基礎(chǔ)上，利用相關(guān)性分析進(jìn)一步揭示曲霉型豆豉發(fā)酵過程中核心微生物與產(chǎn)生的風(fēng)味成分之間的聯(lián)系，這不僅有助于闡明風(fēng)味形成機(jī)制，而且能為探索優(yōu)良發(fā)酵劑提供理論基礎(chǔ)。然而，近十年來研究者的視野傾向于單一層面的曲霉型豆豉微生物或風(fēng)味成分，沒有構(gòu)建風(fēng)味和微生物的系統(tǒng)研究方法。此外，曲霉型豆豉發(fā)酵過程中微生物和風(fēng)味成分二者的變化受到環(huán)境因子包括溫度、濕度和pH等的變化影響，也就是微生物、風(fēng)味成分和環(huán)境因子3個(gè)維度共同影響曲霉型豆豉品質(zhì)特征的形成?；诖?，一方面，采用高通量測序技術(shù)與多元統(tǒng)計(jì)相結(jié)合來研究曲霉型豆豉的微生物與風(fēng)味成分，建立二者之間真正的聯(lián)系，規(guī)避僅依據(jù)微生物豐度來評價(jià)微生物對風(fēng)味形成的貢獻(xiàn)。另一方面，運(yùn)用微生物學(xué)技術(shù)、現(xiàn)代分子生物學(xué)技術(shù)和現(xiàn)代分離分析技術(shù)等多學(xué)科技術(shù)融合同步開展曲霉型豆豉微生物組成、關(guān)鍵風(fēng)味成分及環(huán)境因子3個(gè)維度的變化，將更有助于理解曲霉型豆豉發(fā)酵過程中微生物的演替規(guī)律及其對關(guān)鍵風(fēng)味成分的形成機(jī)理，也可為研究曲霉型豆豉品質(zhì)提升與風(fēng)味定向調(diào)控技術(shù)提供理論基礎(chǔ)。

4.4 開展曲霉型豆豉安全與健康相關(guān)研究

除了上述三個(gè)方面的研究之外，還應(yīng)重視曲霉型豆豉安全與健康相關(guān)研究。曲霉型豆豉自然發(fā)酵過程中極易受到外界微生物、溫度及pH等因素的影響，其風(fēng)味、品質(zhì)不穩(wěn)定，不符合消費(fèi)者對食品安全及衛(wèi)生的要求[14]。而豆豉發(fā)酵過程中某些微生物代謝參與生成如生物胺和氨基甲酸乙酯等有害物質(zhì)，因此研究探明曲霉型豆豉發(fā)酵過程中有害物質(zhì)及其產(chǎn)生菌，進(jìn)而通過技術(shù)調(diào)控減少發(fā)酵中產(chǎn)生相應(yīng)有害物質(zhì)的微生物種類和數(shù)量，消除曲霉型豆豉自然發(fā)酵中存在的“質(zhì)量安全難以控制”的風(fēng)險(xiǎn)。此外，基于新時(shí)代營養(yǎng)健康食品越來越受到市場歡迎，曲霉型豆豉作為一種藥食同源的調(diào)味副食品，應(yīng)加強(qiáng)研究其功能成分、藥理作用及產(chǎn)生菌種等，為探明功能成分形成機(jī)理、研制營養(yǎng)功能曲霉型豆豉及工業(yè)化應(yīng)用功能成分產(chǎn)生菌種等提供理論支撐。

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收稿日期：2023-06-02

基金項(xiàng)目：廣東海洋大學(xué)科研啟動(dòng)經(jīng)費(fèi)資助項(xiàng)目（360302062204）

作者簡介：楊新河（1974—），男，教授，博士，研究方向：食品營養(yǎng)與健康。