郭新軍,孟長軍,封 婧

西安文理學院生物與環(huán)境工程學院,西安市秦嶺天然產物開發(fā)與抗癌類創(chuàng)新藥物研究重點實驗室,西安 710065

中華蜜蜂(Apiscerana)善于應用零星蜜源,能較好地適應山區(qū)環(huán)境[1—2],是我國分布最廣的本土蜂種之一。近年來,隨著棲息地喪失、氣候變化等[3—5],多地野生中華蜜蜂資源已明顯下降,在一些地區(qū)甚至已經完全消失[6—8]。作為重要的傳粉昆蟲之一,中華蜜蜂獨特的形態(tài)結構和生物學特性在植物傳粉方面具有很大的優(yōu)勢[9—10],對維持生物多樣性和維護生態(tài)系統(tǒng)的穩(wěn)定等起到重要的作用[11—13]。中華蜜蜂種群數(shù)量減少意味著植物的授粉率下降、繁殖效率降低、遺傳多樣性降低等,進而影響生態(tài)系統(tǒng)穩(wěn)定。因此,有必要進一步提升對中華蜜蜂傳粉多樣性的認知水平,增強對其傳粉功能與生態(tài)服務價值重要性的認識。

利用孢粉學方法可通過對花粉形態(tài)的鑒定、分類來確定蜜蜂傳粉植物的組成特點[14],但需要專業(yè)的花粉分類知識與技巧。新興的DNA條形碼和高通量測序等技術可用來快速而準確地鑒定花粉混合物的物種組成[15—18],在一定程度上能克服以往研究中植物分類知識及花粉鑒定基礎的欠缺對研究者造成的瓶頸。利用該類技術,研究者對不同地區(qū)藍彩帶蜂、意大利蜜蜂、白斑切葉蜂等傳粉蜜蜂訪問的蜜粉源植物進行了分析[18—20],為傳粉昆蟲訪花植物種類的鑒定提供了新的思路。

為進一步了解中華蜜蜂訪問蜜粉源植物的組成及特點,增強人們對中華蜜蜂的傳粉服務功能重要性的認識,本研究利用聚合酶鏈式反應(PCR)、DNA條形碼和高通量測序等技術,通過分析蜂巢蜜花粉的來源,明確研究區(qū)域蜜粉源植物的組成及其特點,為了解中華蜜蜂對蜜粉源植物選擇的偏好性及中華蜜蜂與蜜粉源植物間的進化關系提供理論基礎,為中華蜜蜂資源的保護提供一定依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 樣品采集

樣地分別選擇在陜西省寶雞市(BJ)、貴州省望謨縣(WM)、廣西壯族自治區(qū)鳳山縣(FS),于2021年9月—11月在每地隨機選擇3個蜂箱(相距50 m以內,各箱內蜂蜜積累時間均達1年以上)各收集1份蜂巢蜜樣品作為1個重復,每地共3個重復。蜂蜜樣本來源地點信息如表1所示。

表1 蜂巢蜜來源地信息

1.2 實驗方法

1.2.1樣品花粉分離、DNA提取、PCR及高通量測序

稱取蜂巢蜜樣品各50 g,分別置于燒杯中,各加入100 mL蒸餾水,充分攪拌得到樣液。分別取10 mL樣液置于離心管中,3000 r/min離心10 min,去除上清液后分別加入蒸餾水至10 mL,再進行第二次離心。去除上清液后保留底部殘留物,鏡檢后作為花粉樣本。

利用E.Z.N.ATMMag-Bind Soil DNA Kit試劑盒提取花粉樣本DNA,采用Qubit試劑盒定量檢測DNA濃度以確定PCR反應中其用量。PCR擴增rbcL基因目的片段的引物為rbcL-F(CTTACCAGYCTTGATCG TTACAAAGG)和rbcL-R(GTAAAATCAAGTCCACCRCG)[21—22]。采用2×Hieff? Robust PCR Master Mix PCR預混液進行兩輪PCR反應,并在第二輪擴增中引入Illumina橋式PCR兼容引物,構建文庫。

文庫大小通過瓊脂糖凝膠電泳檢測,擴增產物委托生工生物工程(上海)股份有限公司進行高通量測序。

1.2.2數(shù)據(jù)處理

利用Usearch軟件將獲得的序列進行聚類[23],得到具有代表性的可操作分類單元(OTU)序列。計算各樣本OTU水平上蜜粉源植物Alpha多樣性數(shù),并利用SparCC計算樣本間的相關系數(shù)和P值,使用R語言的gplots包繪制樣本相關性熱圖。通過核酸序列比對工具(BLASTN)與基因庫(GenBank)中的數(shù)據(jù)進行比較(https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi),篩選最佳比對結果并獲得相應的植物名稱,植物分類系統(tǒng)參考中國植物物種信息(http://db.kib.ac.cn/)和中國科學院植物科學數(shù)據(jù)中心(https://www.plantplus.cn/cn)等。對蜜粉源植物的分布及生物地理特點、花序類型信息進行統(tǒng)計、分析。各蜜粉源植物屬的區(qū)系特征參考吳征鎰等[24—25]。

1.2.3各地樣本蜜粉源植物優(yōu)勢種分析

根據(jù)樣本中各OTU的序列數(shù),計算各種蜜粉源植物在樣本中的相對豐度,統(tǒng)計樣本中的優(yōu)勢物種,比較樣本間物種豐度的差異。

1.2.4蜜粉源植物系統(tǒng)進化關系分析

使用MEGA11對獲得的各種蜜粉源植物rbcL基因部分序列進行比對,并采用鄰接法(NJ)構建系統(tǒng)樹[26—27],對蜜粉源植物的系統(tǒng)發(fā)育關系進行分析,并與被子植物系統(tǒng)發(fā)育研究組(APG)建立的被子植物分類系統(tǒng)第四版(APG Ⅳ)進行比較[28]。

2 結果與分析

2.1 蜜粉源植物Alpha多樣性與地理相關性

各樣本文庫的覆蓋率為1.00±0.00,說明樣品中序列未被檢測出的概率很低,反映了本次測序結果可代表樣品的真實情況。各樣本序列數(shù)均在40000條以上,包含的蜜粉源植物物種豐富度較高。Chao和Ace指數(shù)反映了各樣本中的物種豐富度,Shannon和Simpson指數(shù)反映了各樣本物種多樣性,Shannoneven指數(shù)反映了各樣本物種均勻度。各樣本間OTU水平上蜜粉源植物Alpha多樣性指數(shù)無顯著差異(表2)。

表2 樣本蜜粉源植物組成Alpha多樣性指數(shù)

各地樣本的不同組樣品間存在較高的相關性,而不同地區(qū)樣本間相關性較低,但WM和FS個別樣品具有相對較高的相關性(圖1),可能與兩地距離相對較近有關。樣本間的相關性反映出結果具有一定重復性,且不同地域樣本具有明顯區(qū)別。

圖1 樣本相關性熱圖

2.2 各地樣品中蜜粉源植物物種組成

通過對3地9個樣品測序獲得的序列進行聚類,共獲得241個OTU,基于各OTU序列比對分析,共獲得蜜粉源植物82種(其中19種只鑒定到屬)(表3),隸屬于27目46科71屬。各樣本中,鑒定出最多蜜粉源植物的是陜西省寶雞市樣本(BJ),有57種;貴州省望謨縣樣本(WM)中有30種,廣西壯族自治區(qū)鳳山縣樣本(FS)中有40種。BJ和WM共有種20個,BJ和FS共有種24個,WM和FS共有種19個,其中三地共有種18個,占22.0%,主要有紅足蒿(Artemisiarubripes)、蕪青(Brassicarapa)、翅柃(Euryaalata)等。僅在一個地區(qū)的樣本中出現(xiàn)的共有55種,占67.1%,其中有31種出現(xiàn)在BJ樣本中,有9種出現(xiàn)在WM樣本中,有15種出現(xiàn)在FS樣本中。由此可見,三地樣品中蜜粉源植物的物種組成存在較大差異。

表3 鑒定出的中華蜜蜂訪問蜜粉源植物及其分布

鑒定出的蜜粉源植物中,菊目最多,有12種,毛茛目有7種,薔薇目、禾本目、唇形目各有6種。草本植物和木本植物(含喬木、灌木和木質藤本等)分別為44種和38種。這些植物有少數(shù)是花單生(如蛇莓Duchesneaindica),多數(shù)形成花序,花序類型包括傘形花序(如蒜Alliumsativum)、頭狀花序(如鬼針草Bidenspilosa)、總狀花序(如蕪青Brassicarapa)、穗狀花序(如野草香Elsholtziacyprianii)、圓錐花序(如漆樹Toxicodendronvernicifluum)等多種類型,但研究結果不能反映中華蜜蜂對花序選擇的偏好性。

結果顯示,中華蜜蜂采集的蜜粉源植物屬的區(qū)系復雜(表3,表4),其中包含世界分布區(qū)類型(類型1)屬共12個,如鐵線蓮屬(Clematis)、鬼針草屬(Bidens)等;熱帶分布區(qū)類型(包括類型2—7)屬共26個,其中最多的是泛熱帶分布區(qū)類型(類型2)屬,共9個;溫帶分布區(qū)類型(包括類型8—14)屬共33個,其中最多的是北溫帶分布區(qū)類型(類型8)屬。樣本中未見分布區(qū)類型有溫帶亞洲分布區(qū)類型(類型11)、中亞分布區(qū)類型(類型13)和中國特有分布區(qū)類型(類型15)三種。根據(jù)屬的區(qū)系成分分析,溫帶分布區(qū)類型的植物屬最多,其次為熱帶分布區(qū)類型,所占比例分別為46.5%和36.6%,其中BJ和WM樣本中屬的分布區(qū)類型均是溫帶分布區(qū)類型多于熱帶分布區(qū)類型,而FS樣本中熱帶分布區(qū)類型多于溫帶分布區(qū)類型。

表4 鑒定出的蜜粉源植物屬的分布區(qū)類型

2.3 各地樣本中蜜粉源植物優(yōu)勢種分析

由圖2可知,不同樣本中優(yōu)勢物種組成情況及其所占比例不同,其中BJ樣本中有紅足蒿(Artemisiarubripes)、向日葵(Helianthusannuus)等,WM樣本中有蕪青(Brassicarapa)、粗糠柴(Mallotusphilippensis)等,FS樣本中有蕪青(Brassicarapa)、枇杷(Eriobotryajaponica)等。

圖2 各地樣本中蜜粉源植物優(yōu)勢物種及其相對豐度

2.4 蜜粉源植物系統(tǒng)進化關系

中華蜜蜂訪問的蜜粉源植物處于APG IV系統(tǒng)的不同分支,包括基部支群、木蘭類分支、單子葉植物、真雙子葉植物等(圖3),說明中華蜜蜂對蜜粉源植物的選擇具有一定廣泛性,其中在核心雙子葉植物菊類分支和薔薇類分支中某些位置比較集中。

3 討論

蜜蜂是重要的傳粉昆蟲類群之一,對其蜜粉源植物多樣性的研究可為其資源的保護提供一定依據(jù)[18]。中華蜜蜂適應于山地生態(tài)環(huán)境[29],善于利用零星蜜源[9—10],傳統(tǒng)中華蜜蜂養(yǎng)殖取蜜時間往往間隔一年以上,其蜂蜜中包含不同花期植物來源的花粉。本研究在三地樣本中,分別鑒定出蜜粉源植物57種(陜西省寶雞市)、30種(貴州省望謨縣)和40種(廣西壯族自治區(qū)鳳山縣)。這些蜜粉源植物中,除有刺槐、龍眼、白刺花、向日葵、枇杷、柃等主要蜜粉源植物以及漆樹、葎草、紫穗槐、臭椿等重要輔助蜜粉源植物[30]外,還有一些鮮見文獻報道的物種。這些山區(qū)中蜜粉源植物非常豐富,中華蜜蜂在各地實際訪問的植物種類數(shù)遠大于此。若集約化單一性作物的季節(jié)性種植是傳粉昆蟲種類及數(shù)目驟減的主要原因之一[31],那么山區(qū)里豐富的蜜粉源植物多樣性就是中華蜜蜂等傳粉昆蟲種群得以存續(xù)的重要保障;同樣地,中華蜜蜂等傳粉昆蟲也為山區(qū)蜜粉源植物多樣性提供了保障。棲息地的減少對中華蜜蜂種群的生存產生重大的影響,目前中華蜜蜂的分布區(qū)已經有一定縮減[6—8],而相對來說,山區(qū)由于環(huán)境受到人類干擾較小,成為中華蜜蜂生存的重要陣地。另外,我國近些年封山育林等工作將對中華蜜蜂資源的保護起到一定積極作用。

本研究選擇了不同省份的三個山區(qū),從全球氣候分布來看,位于陜西秦嶺地區(qū)的寶雞市屬于溫帶季風氣候區(qū),位于云貴高原邊緣地帶的望謨縣和鳳山縣屬于亞熱帶季風氣候區(qū)。植被特點與氣候條件相關,從植物區(qū)系劃分來看,三個研究區(qū)域均屬于泛北極植物區(qū),其中寶雞市在中國-日本森林植物亞區(qū)華北植物地區(qū)和華中植物地區(qū)交界處,植被以北溫帶分布為主[32—34],鑒定出的蜜粉源植物中溫帶分布區(qū)類型屬最多;望謨縣和鳳山縣在中國-日本森林植物亞區(qū)滇、黔、桂地區(qū)與中國-喜馬拉雅森林植物亞區(qū)云南高原地區(qū)的交界處[32],植被具有溫帶分布向熱帶分布過渡的特點,在鳳山樣本中鑒定出的蜜粉源植物出現(xiàn)了熱帶分布區(qū)類型屬多于溫帶分布區(qū)類型屬的特點,與文獻中地理位置上比較接近的貴州茂蘭蜜粉源植物區(qū)系特點基本一致[35]。受樣本量限制,相關數(shù)據(jù)不能全面反映蜜粉源植物構成的復雜性,僅為定性分析中華蜜蜂對蜜粉源植物的選擇及了解局部地區(qū)中華蜜蜂傳粉多樣性提供一定參考。

中華蜜蜂是我國的本土蜂種,其在長期的進化過程中與蜜粉源植物形成了復雜的進化關系。中華蜜蜂傳粉植物種類豐富,其對蜜源植物采集喜好性差異小[9]。有報道稱蜜粉源植物的花部性狀等可能會影響蜜蜂的選擇[36—38],但根據(jù)鑒定出的蜜粉源植物花序特點,并未發(fā)現(xiàn)相關性狀對中華蜜蜂選擇的影響。研究發(fā)現(xiàn)中華蜜蜂選擇的蜜粉源植物中一些占優(yōu)勢的種類主要集中在進化樹的菊類分支和薔薇類分支中,但其是否對進化地位在這些植物附近的類群有所偏好,有待于進一步研究。另外,通過對各地區(qū)樣本鑒定出的20種主要優(yōu)勢蜜粉源植物分布區(qū)域(https://www.gbif.org/)分析發(fā)現(xiàn),有12種與中華蜜蜂主要分布區(qū)域呈現(xiàn)出一定的一致性,這將對研究中華蜜蜂起源與其與蜜粉源植物協(xié)同進化提供一定依據(jù)。

研究中采用的DNA條形碼、高通量測序等現(xiàn)代技術為研究花粉組成的多樣性提供了方便[16—18],測序結果可為相關研究提供物種多樣性、系統(tǒng)進化關系等信息,與孢粉學方法相比,具有分析快速、不完全依靠專業(yè)分類知識等優(yōu)點[14]。但在實際分析中仍存在一些問題,如有部分序列只能鑒定到屬,不能準確判斷其物種來源,其原因可能是數(shù)據(jù)庫資料不全或數(shù)據(jù)庫中的數(shù)據(jù)所用分類系統(tǒng)混亂;也可能是由于高通量測序基因片段太短,所得到的序列不足以進行近緣種的區(qū)分。隨著測序技術的發(fā)展及數(shù)據(jù)庫的完善,相關研究方法必將進一步為研究相關問題提供便利,但在實際應用中,種的確定、開花特點分析等還應結合傳統(tǒng)分類學知識和實地調查等技術。

綜上所述,中華蜜蜂選擇蜜粉源植物多樣性豐富,相關研究有助于理解中華蜜蜂與蜜粉源植物的進化關系及其在某些植物傳粉過程中的重要性,為分析中華蜜蜂對蜜粉源植物的選擇機制提供基礎,為中華蜜蜂資源的保護提供依據(jù)。