劉暢，徐錦，賴方方，陳海旭

1.自貢市第一人民醫(yī)院 神經(jīng)外科，四川 自貢 643000

2.四川衛(wèi)生康復(fù)職業(yè)學(xué)院 臨床醫(yī)技學(xué)院，四川 自貢 643010

3.四川衛(wèi)生康復(fù)職業(yè)學(xué)院 基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，四川 自貢 643010

大腦屬于高耗能器官，需要保障葡萄糖供應(yīng)，維持正常腦區(qū)生理功能。大腦無法合成或儲(chǔ)存葡萄糖，主要依賴于幾種葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白（GLUTs）攝取葡萄糖，包括GLUT1 和GLUT3[1]。經(jīng)研究利用葡萄糖類似物放射性示蹤劑對(duì)腦梗死患者進(jìn)行正電子發(fā)射斷層掃描顯示，大腦葡萄糖消耗降低與神經(jīng)功能損傷程度呈正相關(guān)[2-3]。因此，腦梗死會(huì)破壞葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)，導(dǎo)致葡萄糖代謝紊亂。阿魏酸是一類針對(duì)動(dòng)脈粥樣硬化、腦血管疾病治療的藥物。已有研究認(rèn)為阿魏酸對(duì)腦梗死具有改善作用[4-5]，但其作用機(jī)制仍待繼續(xù)探索。本研究擬通過中動(dòng)脈缺血構(gòu)建腦梗死模型，研究阿魏酸對(duì)腦梗死的治療效果，進(jìn)一步探索阿魏酸對(duì)葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)、代謝的影響。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料與儀器

阿魏酸鈉注射液（吉林康乃爾藥業(yè)有限公司，規(guī)格10 mL∶0.3 g，批號(hào)20220615），氟代脫氧葡萄糖（18F-FDG，美國Sigma 公司，批號(hào)1605），L3200 腦梗死線栓（廣州佳靈生物公司），紅四氮唑（TTC）試劑（北京索萊寶公司，批號(hào)s221212），ATP含量檢測(cè)試劑盒（南京建成公司，批號(hào)2210）；anti-GLUT1 蛋白抗體、anti-GLUT3 蛋白抗體、anti-PFKFB3 蛋白抗體、anti-β-actin 蛋白抗體（北京博奧森公司，批號(hào)bs2013、bs1105、bs1513、bs1208）；HRP-anti-rabbit IgG(H+L)抗體（上海碧云天公司，批號(hào)221014）。

Inveon PET/CT 儀（德國西門子公司），Accu-Chek 血糖儀（瑞士羅氏公司）；Mini-protean Tetra 凝膠電泳儀（美國Biorad 公司），QS3 熒光定量PCR儀（美國thermo 公司），F(xiàn)c 多功能酶標(biāo)儀（美國thermo 公司），5200 化學(xué)發(fā)光成像儀（上海天能公司）。

1.2 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物與分組

本研究使用動(dòng)物為SD 大鼠，雄性，SPF 級(jí)，72 只，體質(zhì)量180～200 g，7 周齡，由四川維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司提供，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物生產(chǎn)許可證號(hào)SCXK（川）2023-0040。大鼠飼養(yǎng)于SPF 級(jí)動(dòng)物房，12 h/12 h 晝夜循環(huán)，充足水源與食物，溫度（24±2）℃，濕度（50±10）%。檢疫合格后，將大鼠根據(jù)隨機(jī)分組分為假手術(shù)組、模型組、尼莫地平組，以及阿魏酸25、50、100 mg/kg 組，每組12 只。本研究所有實(shí)驗(yàn)操作均由本院倫理委員會(huì)審核批準(zhǔn)（審批號(hào)20220715067）。

1.3 腦梗死模型構(gòu)建

參考文獻(xiàn)報(bào)道[6]中模型構(gòu)建方案，取大鼠麻醉，仰臥位固定，頸部皮膚消毒、備皮，切開1 cm 傷口，分離出頸總動(dòng)脈血管，游離出頸外與頸內(nèi)動(dòng)脈。自頸外動(dòng)脈插入線栓，前進(jìn)至頸內(nèi)動(dòng)脈，再前進(jìn)至中動(dòng)脈阻塞血流。固定線栓，維持中動(dòng)脈缺血狀態(tài)2 h。缺血期間，模型組經(jīng)尾iv 生理鹽水，阿魏酸25、50、100 mg/kg 組分別iv 相應(yīng)劑量阿魏酸鈉注射液。尼莫地平組iv 20 mg/kg尼莫地平。每天8:00～9:00 時(shí)給藥（第1 天除外），共3 d。假手術(shù)組大鼠僅麻醉后分離血管，不插入線栓。

1.4 神經(jīng)功能評(píng)分

給藥完成后24 h，參考文獻(xiàn)報(bào)道[7]中神經(jīng)功能評(píng)分方法，對(duì)各組大鼠的運(yùn)動(dòng)能力、感覺認(rèn)知、平衡功能、異常運(yùn)動(dòng)情況進(jìn)行系統(tǒng)評(píng)估，所有大鼠每項(xiàng)評(píng)估得分為0～6 分。將各項(xiàng)評(píng)分相加獲得最終評(píng)分結(jié)果。本次神經(jīng)功能評(píng)分最高分為18 分，分?jǐn)?shù)越低代表神經(jīng)功能損傷程度越輕。

1.5 TTC 染色

神經(jīng)功能評(píng)分完成后，將大鼠處死，取完整腦組織，切除小腦與嗅球組織。將腦組織放入冰箱中冷凍至堅(jiān)硬，經(jīng)刀片切成5 片約2 mm 厚切片，放入2% TTC 染色劑中，37 ℃水浴中孵育30 min。將切片按順序排列后拍照，經(jīng)Image pro plus 軟件分析白色梗死區(qū)面積與紅色非梗死區(qū)面積，經(jīng)公式計(jì)算梗死區(qū)面積占比。

梗死區(qū)面積占比＝白色區(qū)域面積/（白色區(qū)域面積＋紅色區(qū)域面積）

1.6 各組大鼠空腹血糖檢測(cè)

給藥完成后，大鼠禁食12 h。經(jīng)大鼠尾靜脈采血，滴加在血糖試紙上，通過血糖儀檢測(cè)、記錄相應(yīng)的血糖數(shù)值。

1.7 PET/CT 實(shí)驗(yàn)檢測(cè)缺血區(qū)葡萄糖攝取水平

空腹血糖檢測(cè)完成后。經(jīng)尾iv 氟代脫氧葡萄糖，劑量50 MBq/kg。將大鼠單籠置于安靜環(huán)境中，40 min 后，將大鼠麻醉，俯臥位固定在PET/CT 檢測(cè)裝置內(nèi)。通過PET/CT 儀先進(jìn)行7 min 的CT 定位掃描，再進(jìn)行18 min 的PET 掃描。設(shè)置空間分辨率參數(shù)為1.35 mm，視野（FOV）12.7 mm。整個(gè)實(shí)驗(yàn)結(jié)束后，通過PET/CT 儀器系統(tǒng)處理圖像，選取缺血區(qū)腦組織采集18F-FDG 標(biāo)準(zhǔn)攝取值（standard uptake value，SUV），以小腦18F-FDG SUV 為內(nèi)參，計(jì)算獲得相對(duì)SUV（relative SUV，SUVr），作為缺血區(qū)葡萄糖攝取水平的統(tǒng)計(jì)值。

1.8 比色法檢測(cè)組織者中ATP 含量

PET/CT 實(shí)驗(yàn)檢測(cè)完成后，將大鼠處死，取缺血側(cè)核心區(qū)組織。精準(zhǔn)稱取組織重量，按1∶9 加入蒸餾水，冰水浴勻漿，制備成10%勻漿液。離心后沸水浴10 min，取出混勻，離心收集上清液待測(cè)。根據(jù)說明書步驟，將試劑盒中工作液混合，通過比色法檢測(cè)組織中ATP 含量。

1.9 Western blotting 法檢測(cè)蛋白表達(dá)

取大鼠缺血核心區(qū)組織，加入RIPA 裂解液勻漿、提取蛋白，制備電泳樣品。取出SDS-PAGE 凝膠，開始電泳，全程冰浴，以蛋白標(biāo)記物到達(dá)底端為電泳終點(diǎn)。將凝膠取出，通過濕法轉(zhuǎn)膜，將凝膠上蛋白轉(zhuǎn)移至PVDF 膜上。封閉液浸沒2 h，孵育一抗溶液。次日，洗去一抗，孵育二抗溶液，滴加發(fā)光液，顯影儀下顯影獲得目的蛋白條帶。

1.10 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 各組大鼠TTC 染色與神經(jīng)功能評(píng)分比較

假手術(shù)組大鼠中動(dòng)脈未有插入線栓，腦組織TTC 染色全部為紅色活細(xì)胞組織，神經(jīng)功能評(píng)分全部為0 分，沒有任何神經(jīng)功能損傷。然而，模型組大鼠腦組織中卻出現(xiàn)了明顯的白色梗死區(qū)域，所有大鼠神經(jīng)功能損傷明顯。與模型組相比，阿魏酸25 mg/kg 組梗死區(qū)域面積占比與神經(jīng)功能評(píng)分沒有明顯變化，阿魏酸50、100 mg/kg 組梗死區(qū)域面積占比與神經(jīng)功能評(píng)分明顯減少（P＜0.05）。見圖1 和表1、2。

表1 大鼠腦組織梗死區(qū)域面積占比（，n=4）Table 1 Proportion of infarct area in rat brain tissue(,n=4)

表1 大鼠腦組織梗死區(qū)域面積占比（，n=4）Table 1 Proportion of infarct area in rat brain tissue(,n=4)

與對(duì)照組比較：*P＜0.05；與模型組比較：#P＜0.05*P＜0.05 vs control group;#P＜0.05 vs model group

表2 大鼠神經(jīng)功能評(píng)分（，n=12）Table 2 Neural function scores of rats (,n=12)

表2 大鼠神經(jīng)功能評(píng)分（，n=12）Table 2 Neural function scores of rats (,n=12)

與對(duì)照組比較：*P＜0.05；與模型組比較：#P＜0.05*P＜0.05 vs control group;#P＜0.05 vs model group

圖1 大鼠腦組織梗死區(qū)域染色Fig.1 Staining of infarct areas in rat brain tissue

2.2 各組大鼠空腹血糖結(jié)果比較

各組血糖水平差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，腦梗死模型對(duì)大鼠空腹血糖影響不具有顯著性，尼莫地平與阿魏酸治療對(duì)大鼠空腹血糖影響不明顯，見表3。

表3 大鼠空腹血糖結(jié)果比較（，n=12）Table 3 Comparison of fasting blood glucose results in rats(,n=12)

表3 大鼠空腹血糖結(jié)果比較（，n=12）Table 3 Comparison of fasting blood glucose results in rats(,n=12)

2.3 各組大鼠腦組織缺血核心區(qū)PET/CT 結(jié)果

與假手術(shù)組相比，模型組大鼠缺血核心區(qū)SUVr明顯降低（P＜0.05）；與模型組相比，阿魏酸25 mg/kg 組大鼠缺血核心區(qū)SUVr 沒有明顯變化，阿魏酸50、100 mg/kg 組大鼠缺血核心區(qū)SUVr 明顯提高（P＜0.05）；與尼莫地平組相比，阿魏酸50、100 mg/kg 組大鼠缺血核心區(qū)SUVr 明顯提高（P＜0.05）。見圖2、表4。

表4 大鼠腦組織缺血核心區(qū)SUVr（，n=12）Table 4 SUVr in ischemic core of rat brain tissue (,n=12)

表4 大鼠腦組織缺血核心區(qū)SUVr（，n=12）Table 4 SUVr in ischemic core of rat brain tissue (,n=12)

與對(duì)照組比較：*P＜0.05；與模型組比較：#P＜0.05；與尼莫地平組比較：&P＜0.05*P＜0.05 vs control group;#P＜0.05 vs model group;&P＜0.05 vs nimodipine group

圖2 大鼠腦組織PET/CT 結(jié)果Fig.2 PET/CT results of rat brain tissue

2.4 各組大鼠腦組織缺血核心區(qū)ATP 含量比較

與假手術(shù)組相比，模型組大鼠腦組織缺血核心區(qū)ATP 含量明顯減少（P＜0.05），與模型組相比，阿魏酸25 mg/kg 組ATP 含量沒有明顯變化，阿魏酸50、100 mg/kg 組ATP 含量明顯增加（P＜0.05），見表5。

表5 大鼠腦組織缺血核心區(qū)組織ATP 含量比較（，n=4）Table 5 Comparison of ATP content in ischemic core of rat brain tissue (,n=4)

表5 大鼠腦組織缺血核心區(qū)組織ATP 含量比較（，n=4）Table 5 Comparison of ATP content in ischemic core of rat brain tissue (,n=4)

與對(duì)照組比較：*P＜0.05；與模型組比較：#P＜0.05*P＜0.05 vs control group;#P＜0.05 vs model group

2.5 各組大鼠腦組織缺血核心區(qū)GLUT1、GLUT3與PFKFB3 蛋白表達(dá)比較

與假手術(shù)組相比，模型組大鼠腦組織缺血核心區(qū)GLUT1、GLUT3、PFKFB3 表達(dá)明顯降低（P＜0.05）；與模型組相比，阿魏酸25 mg/kg 組GLUT1、GLUT3、PFKFB3 表達(dá)沒有明顯變化，阿魏酸50、100 mg/kg 組GLUT1、GLUT3、PFKFB3 表達(dá)明顯增加（P＜0.05）；與尼莫地平組相比，阿魏酸50、100 mg/kg 組GLUT1、GLUT3、PFKFB3 表達(dá)明顯增加（P＜0.05），見圖3、表6。

表6 大鼠腦組織缺血核心區(qū)GLUT1、GLUT3 與PFKFB3 蛋白表達(dá)（，n=4）Table 6 Expression of GLUT1,GLUT3,and PFKFB3 in the ischemic core of rat brain tissue (,n=4)

表6 大鼠腦組織缺血核心區(qū)GLUT1、GLUT3 與PFKFB3 蛋白表達(dá)（，n=4）Table 6 Expression of GLUT1,GLUT3,and PFKFB3 in the ischemic core of rat brain tissue (,n=4)

與對(duì)照組比較：*P＜0.05；與模型組比較：#P＜0.05；與尼莫地平組比較：&P＜0.05*P＜0.05 vs control group;#P＜0.05 vs model group;&P＜0.05 vs nimodipine group

圖3 大鼠腦組織缺血核心區(qū)GLUT1、GLUT3 與PFKFB3蛋白表達(dá)Fig.3 Expression of GLUT1,GLUT3,and PFKFB3 in the ischemic core of rat brain tissue

3 討論

腦梗死是臨床常見的心腦缺血疾病。經(jīng)線栓法阻塞血流模擬臨床患者中動(dòng)脈缺血，再拔出線栓模擬溶栓復(fù)灌是腦梗死非臨床研究常用模型[7]。該模型優(yōu)點(diǎn)是誘發(fā)可逆性神經(jīng)功能損傷，可用于不同藥物治療效果評(píng)估。本研究結(jié)果顯示，模型組大鼠出現(xiàn)了明顯的梗死區(qū)域，這與臨床卒中患者CT 平掃中常見的腦實(shí)質(zhì)低密度和灰白質(zhì)界限消失的情況相適應(yīng)。此外，腦梗死大鼠可見神經(jīng)功能評(píng)分明顯降低，與臨床卒中患者即使溶栓治療后仍會(huì)出現(xiàn)不同程度運(yùn)動(dòng)功能障礙、四肢無法協(xié)調(diào)的情況一致[8]。因此，本研究腦梗死模型構(gòu)建成功。

阿魏酸鈉屬于當(dāng)歸中重要成分阿魏酸的鈉鹽結(jié)構(gòu)。阿魏酸被發(fā)現(xiàn)可以通過抑制突觸前谷氨酸的釋放來實(shí)現(xiàn)神經(jīng)保護(hù)作用，發(fā)揮抗阿爾茲海默病的作用[9-10]。此外，阿魏酸也有被發(fā)現(xiàn)提高蛋白激酶（Akt）/坍塌反應(yīng)調(diào)節(jié)蛋白2（CRMP2）信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)，促進(jìn)神經(jīng)元再生和突觸的重塑，從而發(fā)揮抗抑郁作用[11]。本研究結(jié)果顯示，阿魏酸對(duì)腦梗死存在明顯的治療作用，其治療效果與腦梗死臨床常用的擴(kuò)腦血管藥物尼莫地平相當(dāng)。

葡萄糖是腦組織能量代謝的主要來源，對(duì)正常生理功能至關(guān)重要。成年人大腦約占總體質(zhì)量的2%，但每天約消耗攝入熱量的20%。這一高能耗器官需要通過葡萄糖代謝生成ATP，為正常神經(jīng)元生理功能提供能量。腦能量缺乏是卒中溶栓后康復(fù)受損，神經(jīng)元損傷和壞死的關(guān)鍵因素。隨著核醫(yī)學(xué)發(fā)展，目前臨床常用的PET/CT 掃描，可以檢測(cè)腦梗死患者對(duì)18-F 脫氧葡萄糖的攝取情況，進(jìn)而評(píng)估腦組織的葡萄糖攝取率[12]。本研究也通過PET/CT 掃描檢測(cè)了腦梗死大鼠缺血核心區(qū)的葡萄糖SUVr值。結(jié)果顯示，腦梗死大鼠SUVr 值明顯降低。此外，血糖試紙檢測(cè)顯示，腦梗死對(duì)大鼠外周血糖沒有明顯影響。提示腦梗死僅會(huì)造成大鼠腦部葡萄糖代謝減退，誘發(fā)神經(jīng)功能損傷。與此同時(shí)，本研究結(jié)果可見，100 mg/kg 阿魏酸不僅對(duì)外周血糖沒有明顯影響，而且明顯提高了大鼠缺血核心區(qū)葡萄糖攝取率。此外，尼莫地平也明顯提高了缺血核心區(qū)葡萄糖攝取率，但其效率略低于阿魏酸。

外周葡萄糖主要通過血腦屏障中GLUTs 輔助運(yùn)輸至腦組織中。GLUT1 主要負(fù)責(zé)血糖經(jīng)血腦屏障轉(zhuǎn)運(yùn)入腦，而GLUT3 主要負(fù)責(zé)將內(nèi)環(huán)境中葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)至神經(jīng)元細(xì)胞質(zhì)內(nèi)[1]。本研究結(jié)果顯示，模型組腦組織中GLUT1、GLUT3 蛋白表達(dá)明顯降低，即受腦梗死影響，外周向中樞系統(tǒng)的葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)途徑受到抑制。與此同時(shí)，PFKFB3 作為一類糖酵解調(diào)節(jié)酶，既是調(diào)控糖酵解也是反映腦組織中葡萄糖代謝水平的關(guān)鍵酶[13]。已有研究表明，亞低溫治療可明顯提高腦梗死模型大鼠腦組織糖酵解水平，減少腦梗死面積[14]。本研究結(jié)果也有顯示，模型組大鼠腦組織中PFKFB3 表達(dá)明顯降低，且試劑盒檢測(cè)顯示ATP 含量明顯減少，提示腦梗死大鼠腦組織中葡萄糖代謝抑制是由GLUT1、GLUT3 蛋白表達(dá)降低引起，隨之帶來的就是PFKFB3 表達(dá)減少。然而，與模型組相比，阿魏酸可以劑量相關(guān)性增加GLUT1、GLUT3 蛋白表達(dá)，且明顯提高了PFKFB3蛋白表達(dá)，提示阿魏酸能夠明顯促進(jìn)外周葡萄糖向大腦神經(jīng)元內(nèi)部轉(zhuǎn)運(yùn)，且對(duì)神經(jīng)元內(nèi)葡萄糖代謝有明顯的提高作用。此外，結(jié)果顯示，尼莫地平對(duì)GLUT1、GLUT3 蛋白表達(dá)的影響較小，且明顯低于阿魏酸100 mg/kg 組，提示了尼莫地平在提高缺血核心區(qū)葡萄糖攝取率方面低于阿魏酸。

綜上所述，阿魏酸能明顯減輕腦梗死大鼠神經(jīng)功能損傷，其機(jī)制可能與GLUT1、GLUT3 蛋白表達(dá)升高，缺血區(qū)神經(jīng)元內(nèi)葡萄糖代謝水平提高相關(guān)，這有助于保障缺血區(qū)細(xì)胞的能量供給，維持缺血核心區(qū)神經(jīng)元狀態(tài)，促進(jìn)細(xì)胞新生與修復(fù)，最終達(dá)到減輕神經(jīng)元損傷，改善神經(jīng)功能障礙的作用。

利益沖突所有作者均聲明不存在利益沖突