石嘉麗 侯養(yǎng)謙 朱中杰 武玉 趙紅衛(wèi) 張益,

1（上海理工大學(xué) 上海 200093）

2（中國(guó)科學(xué)院上海應(yīng)用物理研究所 上海 201800）

3（中國(guó)科學(xué)院上海高等研究院 上海 201210）

多肽具有易合成、易修飾以及生物相容性好等優(yōu)勢(shì)，已成為超分子材料的重要構(gòu)建單元，在藥物遞送、生物催化和光電器件等領(lǐng)域具有廣闊的應(yīng)用前景［1-3］。在多肽序列中，由于氨基酸側(cè)鏈的立體阻礙，手性會(huì)影響多肽的分子構(gòu)象，進(jìn)而引起其自組裝的超分子體系的納米結(jié)構(gòu)、尺寸和功能等發(fā)生不同程度的變化［4-7］。近年來(lái)，多肽和其對(duì)映體肽的共組裝也成為調(diào)控超分子結(jié)構(gòu)和性能的重要策略［8-10］。

β-淀粉樣蛋白（Amyloid-β protein，Aβ）聚集成的寡聚體會(huì)破壞神經(jīng)突觸功能，被認(rèn)為是神經(jīng)退行性疾病阿爾茨海默癥（Alzheimer's Disease，AD）的標(biāo)志物［11］。已有研究者利用多肽與Aβ的共組裝，設(shè)計(jì)了多種基于D型氨基酸的淀粉樣蛋白抑制劑，可以抑制Aβ寡聚體的形成［12-15］。二苯丙氨酸作為Aβ的最短的核心識(shí)別序列，可自組裝形成與Aβ相似的淀粉樣纖維結(jié)構(gòu)，其分子內(nèi)及分子間相互作用研究對(duì)揭示Aβ聚集機(jī)制、結(jié)構(gòu)和毒性間的關(guān)系具有重要意義［16-17］。

本文研究了手性異構(gòu)體二苯丙氨酸L-Phe-L-Phe（FF）和D-Phe-D-Phe（ff）的自組裝和共組裝行為。采用多種光譜［18］、X射線衍射（X-ray Diffraction，XRD）、掃描電鏡（Scanning Electron Microscopy，SEM）、原子力顯微鏡（Atomic Force Microscopy，AFM）等表征方法，探討分子間相互作用，旨在揭示短肽分子手性對(duì)自組裝納米結(jié)構(gòu)的影響。此外，通過(guò)將FF和ff以不同的比例進(jìn)行共組裝，實(shí)現(xiàn)了對(duì)共組裝體微觀結(jié)構(gòu)的調(diào)控，并觀察到與單一組分自組裝體不同的全新晶相形成。

1 實(shí)驗(yàn)材料與方法

1.1 材料

L-Phe-L-Phe（FF）、D-Phe-D-Phe（ff）（純度＞98%）購(gòu)買(mǎi)自上海強(qiáng)耀生物科技有限公司；二甲亞砜（DMSO）購(gòu)買(mǎi)自Sigma-Aldrich公司；溶液配制使用超純水（18.2 MΩ·cm）。

1.2 多肽溶液的配制及組裝

將FF和ff粉末分別溶解在DMSO溶液中，得到濃度為200 mg·mL-1的儲(chǔ)備溶液；在一定量的儲(chǔ)備溶液中加入超純水，獲得終濃度為2 mg·mL-1的多肽溶液［19］。放置在37 ℃、300 r·min-1環(huán)境下孵育3 d。

1.3 組裝體的成像

掃描電鏡（Scanning Electron Microscope，SEM）：取10 μL上述孵育后的多肽溶液滴在潔凈的硅片表面，并冷凍干燥。測(cè)試前利用離子濺射鍍膜儀對(duì)樣品進(jìn)行噴金處理，使用LEO 1530VP（Zeiss）掃描電子顯微鏡觀察組裝體的微觀形貌。

原子力顯微鏡（Atomic Force Microscope，AFM）：取10 μL上述孵育后的多肽溶液滴加在潔凈的新鮮剝離的云母表面，靜置吸附3 min后去除多余溶液，自然晾干。通過(guò)Multimode 8（Bruker）掃描探針顯微鏡觀察組裝體的微觀拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)。使用名義懸臂彈性系數(shù)為7 N·m-1的XSC-11（MIKROMASCH）探針，選擇PeakForce QNM in Air掃描模式進(jìn)行成像。

1.4 光譜表征

圓二色光譜（Circular Dichroism，CD）：使用Chirascan（Applied Photophysics）圓二色光譜儀對(duì)多肽組裝體的二級(jí)結(jié)構(gòu)進(jìn)行測(cè)量。多肽溶液用超純水稀釋至0.5 mg·mL-1，選擇比色皿光程為1 mm，收集掃描波長(zhǎng)范圍為200~260 nm的數(shù)據(jù)，帶寬為1.0 nm，采集數(shù)據(jù)點(diǎn)間隔為1.0 nm，以超純水的光譜作為基線。使用CDNN 2.1程序分析組裝體中多肽的二級(jí)結(jié)構(gòu)含量。

傅里葉變換紅外光譜（Fourier Transform Infrared Spectroscopy，F(xiàn)TIR）：將多肽溶液通過(guò)冷凍干燥技術(shù)獲得固體粉末，與干燥的KBr粉末一起研磨、混合均勻并壓片。使用傅里葉變換紅外光譜儀TENSOR 27（Bruker）測(cè)試多肽的紅外光譜，收集波數(shù)范圍為1 800~1 200 cm-1的數(shù)據(jù)，采集數(shù)據(jù)點(diǎn)間隔為4 cm-1，掃描次數(shù)為64次，以KBr作背景。

熒光發(fā)射光譜（Fluorescence Emission Spectrum）：取200 μL、2 mg·mL-1多肽儲(chǔ)備溶液或孵育后的多肽溶液加入比色皿中。使用FS 5（Edinburgh Instruments）熒光光譜儀進(jìn)行PL光譜掃描，設(shè)置激發(fā)波長(zhǎng)為259 nm，收集波長(zhǎng)范圍為270~320 nm的數(shù)據(jù)，采集數(shù)據(jù)點(diǎn)間隔為1 nm，掃描次數(shù)為3次。

1.5 X射線粉末衍射（Particle X-ray Diffraction,PXRD）分析

將多肽溶液冷凍干燥獲得固體粉末，研磨均勻。使用D8 Advance（Bruker）X射線衍射儀測(cè)量多肽自組裝體的X射線粉末衍射譜，采用Cu Kα射線，λ=0.154 05 nm，收集掃描2θ范圍為5°~14°的數(shù)據(jù)，采集數(shù)據(jù)點(diǎn)間隔為0.02°。

2 結(jié)果與討論

2.1 手性二苯丙氨酸的自組裝

如SEM圖像（圖1（a、b））所示，F(xiàn)F和ff分別自組裝形成的納米纖維是多尺寸的，其中較大的纖維由較小的纖維相互纏繞而成。使用AFM對(duì)溶液體系中最小尺寸的納米纖維進(jìn)行了觀察，從不同圖像中隨機(jī)選擇一定數(shù)量的納米纖維進(jìn)行測(cè)量，發(fā)現(xiàn)兩者的高度與半高寬存在差異（圖1（c、d））。其中，F(xiàn)F自組裝納米纖維的高度為（5.2±0.8） nm，半高寬為（31.2±12.3） nm；而ff自組裝納米纖維的高度為（11.1±1.0） nm，半高寬為（102.3±18.0） nm。

圖1 FF和ff自組裝微觀結(jié)構(gòu)(a, b) FF (a)及ff (b)的自組裝微觀結(jié)構(gòu)的SEM圖像，(c, d) FF (c)及ff (d)自組裝納米纖維的AFM圖像（左）和AFM圖像中線條所示位置的線性剖面圖（右）Fig.1 Nanostructures of self-assembled FF and ff(a, b) SEM images of self-assembled nanostructures of FF (a) and ff (b), (c, d) AFM images (left) of self-assembled nanofibers of FF (c) and ff (d), and linear profiles (right) of the lines shown in AFM images

為了探討造成FF和ff自組裝體微觀形貌差異的原因，我們利用光譜學(xué)和XRD技術(shù)進(jìn)行了深入分析。圖2（a）表示的是FF與ff的CD譜，使用CDNN 2.1程序?qū)D譜進(jìn)行分析，結(jié)果表明，兩者主要的二級(jí)結(jié)構(gòu)為β-折疊和β-轉(zhuǎn)角，但占比略有區(qū)別（圖2（b））。FTIR譜（圖2（c））中FF和ff在1 665 cm-1和1 694 cm-1的特征峰進(jìn)一步證實(shí)了兩者的二級(jí)結(jié)構(gòu)以β-折疊和β-轉(zhuǎn)角為主［20-21］。我們推測(cè)FF和ff自組裝納米纖維上的差異與多肽二級(jí)結(jié)構(gòu)相對(duì)含量的差異相關(guān)，分子手性影響二苯丙氨酸側(cè)鏈苯環(huán)的空間取向，使其以更穩(wěn)定地排列形成超分子結(jié)構(gòu)。如熒光發(fā)射光譜所示，當(dāng)激發(fā)波長(zhǎng)為259 nm時(shí)，自組裝后的FF和ff在281 nm處有一個(gè)發(fā)射峰（圖2（d）），而且兩者發(fā)射譜幾乎重合。與DMSO中游離的FF相比，發(fā)射峰無(wú)明顯移動(dòng)但峰型略有變化。我們知道，溶解在DMSO中FF和ff的芳香殘基間存在π-π堆積作用但無(wú)疏水相互作用，沒(méi)有形成納米結(jié)構(gòu)，而水中的FF和ff間除了芳香殘基間π-π堆積作用外還存在疏水相互作用；因此，F(xiàn)F和ff的自組裝應(yīng)該主要是由疏水相互作用驅(qū)動(dòng)的。同時(shí)，XRD圖譜表明FF和ff在水中自組裝后衍射峰位置與自組裝前完全不同（比較圖2（e）和（f）），說(shuō)明多肽分子與溶劑分子間的相互作用導(dǎo)致了多肽分子規(guī)則的排列，形成了高度有序的自組裝微觀結(jié)構(gòu)，導(dǎo)致晶型變化。我們發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)F和ff衍射峰的峰型基本相同，且與FF單晶結(jié)構(gòu)模擬的衍射圖有相似的峰位置［22］，說(shuō)明FF和ff在各自組裝體中分子排列方式較為相似。其中，在2θ=8.4°處的衍射峰強(qiáng)度較弱，可能與本實(shí)驗(yàn)條件下形成納米纖維，而不是之前研究者報(bào)道的納米管等微觀結(jié)構(gòu)相關(guān)［23］。此外，XRD圖譜中FF自組裝體的衍射峰位置相比f(wàn)f略向低角度偏移，推測(cè)它們的晶格參數(shù)略有不同。上述結(jié)果表明，分子手性引起的二苯丙氨酸側(cè)鏈苯環(huán)的空間取向會(huì)影響自組裝納米結(jié)構(gòu)的分子間距離，故形成不同尺寸的納米纖維。

圖2 FF和ff自組裝體的CD譜(a)、二級(jí)結(jié)構(gòu)含量分布(b)、FTIR譜(c)、熒光發(fā)射光譜（λexcitation=259 nm）(d)、未組裝肽的XRD圖譜(e)和自組裝肽的XRD圖譜(f)（彩圖見(jiàn)網(wǎng)絡(luò)版）Fig.2 CD spectra (a), ratios of secondary structures (b), FTIR spectra (c), fluorescence emission spectra (λexcitation=259 nm) (d), XRD patterns of unassembled peptide powders (e), and XRD patterns (f) of self-assembled FF and ff peptides (color online)

2.2 不同手性二苯丙氨酸的共組裝

我們將不同比例的FF和ff（FF:ff=3:1、1:1、1:3）混合，在與之前相同的實(shí)驗(yàn)條件下進(jìn)行多肽共組裝，觀察共組裝體的微觀形貌。如SEM圖像（圖3）所示，3:1和1:3比例的FF和ff共組裝體系形成了大量的納米纖維結(jié)構(gòu)；兩種比例的多肽共組裝而成的納米纖維之間的纏繞相比自組裝體系更為緊密。AFM圖像（圖3）也證實(shí)3:1和1:3比例的FF和ff共組裝形成了大量纖維束，其納米纖維束的高度大多在數(shù)十納米的范圍內(nèi)。而FF和ff以1:1比例共組裝的SEM和AFM圖像則顯示其形成了排列較為均勻的束狀微觀結(jié)構(gòu)，分支由納米纖維組成［24］。形態(tài)迥異的組裝體結(jié)構(gòu)表明不同比例FF和ff的共組裝策略提供了淀粉樣纖維聚集體研究新的思路。

圖3 不同比例FF和ff共組裝結(jié)構(gòu)的微觀結(jié)構(gòu)FF和ff共組裝體系的SEM圖像(a, c, e)和AFM圖像(b, d, f)，F(xiàn)F和ff的混合比例分別為3:1 (a, b)、1:1 (c, d)、1:3 (e, f)Fig.3 Nanostructures of co-assembled FF and ff with various ratiosSEM images (a, c, e) and AFM images (b, d, f) of co-assemblies formed by FF and ff at ratios of 3:1 (a, b), 1:1 (c, d), 1:3 (e, f)

CD譜（圖4（a、b））表明，F(xiàn)F和ff混合體系中也形成了以β-折疊和β-轉(zhuǎn)角為主的二級(jí)結(jié)構(gòu)。相比于1:1比例的FF和ff，3:1和1:3非等比共組裝體系中多肽的β-折疊和β-轉(zhuǎn)角二級(jí)結(jié)構(gòu)含量更高，這可能是造成不同比例共組裝超分子體系微觀結(jié)構(gòu)存在差異的原因。紅外光譜（圖4（c））在1 603 cm-1、1 665 cm-1、1 694 cm-1的特征峰也表明了混合體系中多肽的二級(jí)結(jié)構(gòu)主要為β-折疊和β-轉(zhuǎn)角，與CD光譜中反映的二級(jí)結(jié)構(gòu)相一致。

圖4 不同比例FF和ff的共組裝體系的譜學(xué)分析(a) CD譜，(b) 二級(jí)結(jié)構(gòu)含量分析，(c) FTIR譜，(d) 熒光發(fā)射光譜（λexcitation = 259 nm），(e) 共組裝體系的XRD圖譜Fig.4 Spectroscopic analysis of co-assembled FF and ff with various ratios(a) CD spectra, (b) Ratios of secondary structures, (c) FTIR spectra, (d) Fluorescence emission spectra (λexcitation = 259 nm),(e) XRD patterns of co-assembled FF and ff

我們也利用熒光發(fā)射光譜和XRD技術(shù)對(duì)FF和ff共組裝體系進(jìn)行了探討。熒光發(fā)射光譜（圖4（d））表明，當(dāng)激發(fā)波長(zhǎng)為259 nm時(shí)，不同比例FF和ff在水中組成的共組裝體系均在281 nm處顯示出一個(gè)發(fā)射峰，與DMSO中FF和ff混合溶液的熒光發(fā)射光譜相比，沒(méi)有明顯的峰值移動(dòng)，峰型稍有變化。這個(gè)結(jié)果與FF或ff自組裝的熒光發(fā)射光譜相一致，說(shuō)明FF和ff發(fā)生共組裝的驅(qū)動(dòng)力與自組裝相似，以疏水相互作用為主。不同比例FF和ff的共組裝體系的XRD圖譜（圖4（e））與FF或ff自組裝體系的衍射圖譜類似（圖2（f））；但是，F(xiàn)F和ff的共組裝體系在更小的角度（2θ=6.29°）出現(xiàn)了一個(gè)新的衍射峰，說(shuō)明共組裝形成了新的晶相。FF和ff以1:1共組裝體系中新的衍射峰位置相比非等比例共組裝體系中新的衍射峰位置角度略高，推測(cè)兩者的晶格參數(shù)略有不同。這個(gè)不同可能最終反映在共組裝體系的微觀結(jié)構(gòu)上的差異（圖3）。

3 結(jié)語(yǔ)

本文利用多種實(shí)驗(yàn)技術(shù)研究了手性多肽FF和ff的自組裝和共組裝行為，對(duì)多肽的二級(jí)結(jié)構(gòu)、組裝體系的微觀結(jié)構(gòu)、分子間相互作用進(jìn)行了表征與分析。結(jié)果表明，F(xiàn)F和ff氨基酸側(cè)鏈上苯環(huán)的空間取向的不同在一定程度上影響了肽分子間、肽分子與水分子間的相互作用，進(jìn)而造成了自組裝體及共組裝體的微觀結(jié)構(gòu)上的差異。XRD結(jié)果顯示，不同比例的FF和ff混合體系出現(xiàn)新的衍射峰，表明多肽共組裝行為會(huì)形成新的晶相。我們的研究揭示了多肽的手性和共組裝策略對(duì)組裝體納米結(jié)構(gòu)和分子間相互作用方式的影響，為調(diào)控多肽超分子微觀結(jié)構(gòu)提供了新的參考。一方面有望促進(jìn)淀粉樣纖維的形成和抑制機(jī)制的理解，另一方面可以用于設(shè)計(jì)結(jié)構(gòu)、功能多樣化的多肽超分子納米材料，為未來(lái)其更廣泛應(yīng)用提供了新的思路。

致謝感謝上海同步輻射光源BL06B、BL17B線站工作人員在實(shí)驗(yàn)方面的幫助和討論。

作者貢獻(xiàn)聲明石嘉麗完成實(shí)驗(yàn)和撰寫(xiě)文稿；侯養(yǎng)謙協(xié)助指導(dǎo)實(shí)驗(yàn)；侯養(yǎng)謙、朱中杰、武玉、趙紅衛(wèi)指導(dǎo)數(shù)據(jù)分析和協(xié)助文稿修改；張益構(gòu)思文稿思路并指導(dǎo)文稿修改。