劉科均，賴錫勛，向勁，桂雨婷，葛玲瑞*

（1.湖南生物機電職業(yè)技術(shù)學院，湖南 長沙 410126；2.湖南省水產(chǎn)科學研究所，湖南 長沙 410153；3.湖南應用技術(shù)學院，湖南 常德 415000）

生物多樣性是人類賴以生存的物質(zhì)基礎(chǔ)。近年來，由于石油鉆井開采、水環(huán)境被破壞、生物資源過度開發(fā)及外來物種入侵等原因，許多水生生態(tài)系統(tǒng)的生物多樣性正受到嚴重威脅，如內(nèi)陸淡水生態(tài)系統(tǒng)湖泊、濕地等出現(xiàn)退化，海洋及沿岸地帶的漁業(yè)資源急劇減少，非國家重點保護野生動物種群下降趨勢明顯，遺傳資源也在不斷喪失和流失，部分珍貴和特有的漁業(yè)種質(zhì)資源流失問題嚴重[1]。傳統(tǒng)的水生生物資源調(diào)查方法，耗時長、成本高、操作方法煩瑣，難以在流域開展大規(guī)模漁業(yè)資源調(diào)查。因此，迫切需要更加便捷、精準且有效的生物資源調(diào)查方法。

環(huán)境DNA（environmental DNA, eDNA）是指從環(huán)境（水體、土壤、沉積物、冰、空氣等）中提取DNA 片段，包括皮膚表皮細胞、糞便、體液等胞內(nèi)DNA，以及動物機體出現(xiàn)損傷所釋放到環(huán)境的胞外DNA[2-4]。環(huán)境DNA 技術(shù)則是將提取到的DNA 片段通過DNA 測序技術(shù)，對目標生物進行定性和定量分析，從而獲得目標生物在生態(tài)系統(tǒng)中的分布情況等[5]。該技術(shù)能夠快速檢測出水域環(huán)境中的稀有種、瀕危種及入侵種等，是一種新型的生物資源調(diào)查方法?，F(xiàn)簡述環(huán)境DNA 技術(shù)的發(fā)展進程，及其在物種多樣性監(jiān)測、生物量評估、入侵物種和珍稀物種監(jiān)測等方面的應用，以期為水生生態(tài)系統(tǒng)生物多樣性研究工作提供一定參考。

1 環(huán)境DNA 發(fā)展進程

1987 年Ogram 等[6]成功從海洋沉積物中分離出微生物DNA，首次提出環(huán)境DNA 的概念。20 世紀90 年代末，科學家利用鯨魚糞便來區(qū)分不同鯨魚種類，為eDNA 技術(shù)在水生生態(tài)系統(tǒng)中的應用提供了靈感。直到2008 年，F(xiàn)icetola 等[7]利用eDNA 技術(shù)，對美國牛蛙入侵進行監(jiān)測，首次證明了eDNA 技術(shù)適用于水生生態(tài)系統(tǒng)的可行性，推動了eDNA 技術(shù)在水生生物監(jiān)測中的推廣與應用[8]。2012 年，科學家們逐漸將研究重心轉(zhuǎn)移到利用eDNA 技術(shù)對水域中某一特定物種進行實時監(jiān)測，意味著eDNA 技術(shù)在水域環(huán)境中的應用由定性轉(zhuǎn)變?yōu)橄鄬Χ?，由單一物種監(jiān)測發(fā)展到同時監(jiān)測多種物種以及對特定物種的監(jiān)測[9]。應用范圍從最初的池塘、湖泊、河流、水庫等淡水水域拓展至海水水域。調(diào)查物種從低等過渡到高等，包括細菌和古菌、真菌、浮游生物、植物、軟體動物、節(jié)肢動物、魚類、兩棲爬行類、哺乳類等幾乎所有生物類群[10]。環(huán)境DNA 研究發(fā)展概略見圖1。

2 環(huán)境DNA 應用領(lǐng)域

2.1 物種及物種多樣性

目前，國內(nèi)關(guān)于eDNA 技術(shù)的運用主要包含常見物種監(jiān)測，珍稀及瀕危物種監(jiān)測和入侵物種監(jiān)測。通過利用eDNA 技術(shù)，對我國淡水水域中的常見魚種開展檢測，以掌握其資源現(xiàn)狀，從而促進中國魚類資源的保護與發(fā)展，對我國各地有效實施漁業(yè)增殖放流的管理工作有著重要意義[11]。不同于國外，我國的eDNA 技術(shù)起步較晚。王曉輝等[12]從海洋底泥中的提取并純化eDNA 的研究，為之后eDNA 技術(shù)在水生生態(tài)系統(tǒng)中進行物種監(jiān)測的成功應用奠定了基礎(chǔ)。盧珊[13]研究萼花臂尾輪蟲、鯉、泥鰍和日本沼蝦與其eDNA 的定性與定量關(guān)系，證實通過對水體中eDNA 的定性、定量測定可以實現(xiàn)對水體中的水生生物種類及生物豐度的監(jiān)測。劉軍等[14]分別對線粒D-loop 區(qū)、16S RNA 基因、COI基因以及Cytb 基因部分片段進行擴增，通過與千島湖48 種魚類基因組DNA 進行比較后，發(fā)現(xiàn)線粒體16S RNA 基因具有更好的通用性和適用性，更適合作為魚類結(jié)構(gòu)分析eDNA 研究的通用引物。徐念等[15]在長江宜昌至南京江段進行調(diào)查，將eDNA技術(shù)與傳統(tǒng)調(diào)查方法所得結(jié)果對比發(fā)現(xiàn)，eDNA 技術(shù)檢測出的物種種類為15 種，比傳統(tǒng)調(diào)查方法少2 種，但其中含有傳統(tǒng)方法未檢測到的魚類。羅加山[16]通過eDNA 結(jié)合高通量條形碼技術(shù)，對滇中高原湖泊魚類多樣性進行研究，整理了撫仙湖、陽宗湖、滇池、星云湖4 個湖泊的魚類分布圖及其魚類物種組成。王桂營[17]應用eDNA 技術(shù)，對鴨綠江口底棲生物多樣性及評價生態(tài)質(zhì)量狀況進行初步研究，并與形態(tài)學鑒定結(jié)果比較，顯示兩者所得評價指數(shù)間的相關(guān)性十分接近。上述研究表明，eDNA技術(shù)發(fā)展前景廣闊，可作為形態(tài)學鑒定方法的一種重要補充工具。

2.2 生物量評估

生物量評估是水生生物資源監(jiān)控中的一項重要任務，通過對原始生態(tài)中的eDNA 濃度進行測定和比對，可以實現(xiàn)對監(jiān)測區(qū)域內(nèi)目標生物量水平高低的監(jiān)測。近年來，越來越多的科學家通過研究將eDNA 濃度與生物量聯(lián)系起來，認為eDNA 濃度與生物密度之間存在某種線性關(guān)系，即通過檢測該環(huán)境中的eDNA 濃度，可以估算出物種的生物量[18]。文獻[19-20]均在實驗室中通過試驗得出，eDNA 濃度隨著水溫的升高呈指數(shù)衰減，且eDNA 的濃度與鯉生物量有著明顯的正相關(guān)關(guān)系。Klymus 等[21]進行的試驗同樣發(fā)現(xiàn)，eDNA 的濃度與生物量之間呈正相關(guān)，但不同的是，影響eDNA 濃度變化的因素是攝食量而非水溫。文獻[22-23]研究表明，影響eDNA濃度的因素還包括生物個體的生成速率、生物密度、環(huán)境條件（高pH 值、強光、鹽度）等。Evans 等[24]對9 種生物的線粒體基因片段序列進行測定研究，發(fā)現(xiàn)其序列拷貝數(shù)與生物豐度間，存在正相關(guān)關(guān)系，進一步說明eDNA 具有用于生物量評估的潛力。國內(nèi)對于eDNA 技術(shù)進行生物量評估的研究也在增多。李苗等[25]通過對eDNA 技術(shù)的不斷研究，總結(jié)出一套適用于中國對蝦生物量評估的eDNA 技術(shù)操作流程，為我國對蝦養(yǎng)殖的從業(yè)者提供了一種新的方法。閆卉果等[26]同樣建立并優(yōu)化了適用于巖原鯉生物量評估的eDNA 技術(shù)，具有快速、靈敏、特異性強等特點，使其在實際應用中成為一個重要的附加工具。秦傳新等[27]報道了國外有關(guān)eDNA 應用于生物量評估方面的研究進展，指出，與傳統(tǒng)方法相比，eDNA 技術(shù)具有高效、經(jīng)濟、安全等優(yōu)勢，但也存在著無法直接觀察生物群落和個體情況等缺陷，因此，只有將二者融合起來、取長補短，才能更好地為生物量評估工作提供技術(shù)支持。

2.3 珍稀物種和入侵物種監(jiān)測

許多珍稀或瀕危魚類作為其生態(tài)系統(tǒng)中不可或缺的一部分，近年來，受人為或自然等因素影響，其種群數(shù)量正處在滅絕的邊緣。珍稀及瀕危魚類難以捕獲且數(shù)量稀少，傳統(tǒng)方法如水聲監(jiān)測法及刺網(wǎng)監(jiān)測法等，在監(jiān)測過程中易對生物造成一定傷害。eDNA 技術(shù)具備采樣簡單、環(huán)境友好等特點，在物種數(shù)量較少的情況下，對其監(jiān)測具有重要意義。吳昀晟等[28]利用eDNA 技術(shù)，對長江江豚種群進行監(jiān)測，證明了環(huán)境DNA 技術(shù)用于監(jiān)測長江中低密度瀕危水生動物的可行性。

物種入侵不僅對本地魚類會產(chǎn)生一定的威脅，同時對生態(tài)系統(tǒng)也會產(chǎn)生巨大危害。在物種入侵前期，其生物量較少，尚未形成種群，及時發(fā)現(xiàn)并處理可以有效避免物種入侵所產(chǎn)生的危害。因此，通過eDNA 技術(shù)對入侵物種進行監(jiān)測，是做好生物入侵預防工作的重要保障。

在國外，Jerde 等[29]用eDNA 技術(shù)，對芝加哥運河中的2 種亞洲鯉進行早期入侵監(jiān)測，并將其與傳統(tǒng)漁業(yè)調(diào)查方法比較，結(jié)果顯示，eDNA 監(jiān)測敏感度更高。在國內(nèi)，馬竹欣[30]利用eDNA 技術(shù)調(diào)查元陽梯田中克氏原螯蝦分布情況，通過與蝦籠誘捕法對比，結(jié)果表明，其檢出率顯著高于傳統(tǒng)方法，證明eDNA 技術(shù)可以高效監(jiān)測入侵物種的分布現(xiàn)狀及擴散動態(tài)等。

3 環(huán)境DNA 研究方法

eDNA 技術(shù)操作，大致分為3 大部分，即樣品的采集與保存、eDNA 捕獲與提取、eDNA 分析等。近年來，國內(nèi)外相繼出現(xiàn)有關(guān)eDNA 監(jiān)測技術(shù)標準化的報道。針對不同生態(tài)系統(tǒng)中，在應用eDNA 監(jiān)測技術(shù)時，存在諸多差異，從而導致試驗結(jié)果各不相同。因此，eDNA 監(jiān)測技術(shù)標準化系統(tǒng)性框架的建立，具有重大意義。

3.1 樣品的采集與保存

在我國，eDNA 技術(shù)的應用范圍十分廣泛，無論是對特定物種監(jiān)測還是對某區(qū)域進行生物量評估，選擇合適的方法采集和保存樣品，是保證試驗數(shù)據(jù)準確的重要因素。張麗娟等[31]通過對云南滇池和撫仙湖中2 個湖泊中的水樣品進行測序，整理出適用于2 個湖泊中藻類監(jiān)測的測序深度。為減少使用的誤差，在取樣時從每個點位各采集水樣1 L，并進行3 次重復采樣。王汝賢等[32]利用eDNA技術(shù)，對長江口水域魚類生物多樣性進行調(diào)查，同樣是18 個采樣站點，均使用1 000 mL 的采樣瓶，重復采集3 瓶表層水樣品，該方法與傳統(tǒng)底拖網(wǎng)調(diào)查方法獲得的結(jié)果對比，eDNA 檢出率明顯提高。為減少對水樣的污染，工作人員在采樣時，一定要佩戴口罩和手套，同時在采樣前，需將采樣瓶和采水器潤洗，并使用10%漂白劑浸泡10 min，采樣時，用純凈水做陰性對照。

樣品保存，主要指樣品從采集到eDNA 提取這段時間的保存。eDNA 存在于許多樣品中，如土壤、沉積物、固體混合物等樣品，無須預處理，可以選擇在-80 ℃、-20 ℃溫度下，干燥冷凍或干冰浴冷凍保存[33]。水樣保存，則可以選擇冰浴保存，可有效降低eDNA 的降解速率[34]。

3.2 eDNA 捕獲

過濾法、沉淀法和離心法，是目前主要使用的捕獲eDNA 的3 種方法。其中以過濾法最為常用，且效果要比另外2 種方法好。過濾法是指對水樣進行過濾，在水樣通過濾膜后，將eNDA 截留在濾膜上。沉淀法原理是利用一定比例的乙酸鈉（CH3COONa）和無水乙醇（C2H5OH）與水樣反應，使其中的eDNA 聚集并沉淀，從而獲得富集eDNA 的沉積物。離心法則是利用離心機，對水樣進行離心處理來富集eDNA[35]。

3.3 eDNA 提取

水樣中eDNA 含量少，且成分復雜，如重金屬離子、腐殖酸以及來自不同生物組織的DNA 片段等，都會導致試驗結(jié)果出現(xiàn)誤差。近年來，越來越多的研究者，將傳統(tǒng)方法與DNA 提取試劑盒相結(jié)合，提出了多種方法，從樣品中提取高質(zhì)量的水樣DNA。

eDNA 提取方法可分為3 大類，分別為傳統(tǒng)提取法（過濾法、沉淀法以及物理破碎法等）、DNA 試劑盒提取法，以及兩者結(jié)合的方法。目前常用的水樣eDNA 提取試劑盒有：DNeasy Tissue and Blood DNA extraction kit 、QIAamp DNA Micro extraction kit、MoBio Power Water DNA extraction kit 和QuickgDNA spin-column kit 等4 種試劑盒[36]。水樣eDNA提取試劑盒又可分為普通DNA 提取試劑盒與專有eDNA 提取試劑盒。DNeasy Tissue and Blood DNA extraction kit 屬于普通DNA 提取試劑盒，MoBio Power Water DNA extraction kit 則屬于專有DNA 提取試劑盒。目前尚無文獻報道將普通eDNA 試劑盒與專有eDNA 提取試劑盒進行對比試驗，但專有eDNA 提取試劑盒的價格相較普通eDNA 試劑盒要更貴。

選擇eDNA 提取方法時，要根據(jù)不同試驗對象選擇不同的方法，以獲得高質(zhì)量的水樣DNA。Deiner等[37]通過比較3 種不同的環(huán)境DNA 提取方法發(fā)現(xiàn)，對于真核生物，應該提取細胞色素C 氧化酶Ⅰ基因（COⅠ基因），采用過濾與Qiagen’s DNeasy Blood &Tissue Kit 相結(jié)合的方法，而對于水環(huán)境中的真菌，則應該采用沉淀與MoBio Power Water DNA extrac tion kit 相結(jié)合的方法。eDNA 提取完成后，一般于4 ℃或-20 ℃冰箱保存。

3.4 eDNA 分析

根據(jù)eDNA 監(jiān)測對象及目的，可將擴增引物分為特異性引物和metabarcoding 通用引物。特異性引物通常應用于對特定物種進行監(jiān)測，包括珍稀物種監(jiān)測、入侵物種檢測及病原監(jiān)測等，metabarcoding通用引物則更適用于進行生物多樣性或生物量評估等[38]。設(shè)計引物時，可參考NCBI 等大型開放數(shù)據(jù)庫中的序列或通過測序技術(shù)，來獲得目標物種的DNA 序列，通用引物擴增片段一般控制在90～120 bp為宜[39]。目前主要使用的引物設(shè)計軟件有：Primer Premier，NCBI Primer-Blast，Primer3 Plus 等。不同的生物類群所使用的通用引物各不相同，如真菌通常使用18S rRNA 基因作為通用引物，細菌、古菌則采用16S rRNA 基因。在魚類研究中，主要以12S rRNA基因或CO I 基因作為通用引物。兩者各有優(yōu)勢，12S rRNA 基因具有更高的檢出率，CO I 基因的數(shù)據(jù)庫則更加全面。

水樣本的擴增方式有常規(guī)PCR 擴增和實時熒光定量PCR（qPCR）。常規(guī)PCR 可利用通用引物擴增多種生物的目的片段；qPCR 可利用特異性引物，定性擴增特定物種的目的片段，同時能定量分析該目的片段的含量[40]。PCR 擴增結(jié)果以陰性、陽性記錄。采用凝膠電泳法對PCR 擴增結(jié)果進行檢測，從而推測采樣點是否存在目標種的活動跡象，陰性表明環(huán)境樣品中不存在目標種的DNA，陽性則表明環(huán)境樣品中存在目標種的DNA[41]。通常研究者會選擇采用10～40 μL 的PCR 反應體系、設(shè)置3～10 個平行樣本的方法，確保結(jié)果的準確性，通過設(shè)置陰陽性對照，排除假陽性與假陰性擴增以及交叉污染。

4 優(yōu)勢和存在問題

4.1 eDNA 技術(shù)的優(yōu)勢

eDNA 技術(shù)發(fā)展至今已有約30 年，eDNA 技術(shù)的研究領(lǐng)域，從微生物生態(tài)學拓展到了生態(tài)系統(tǒng)生態(tài)學、古生態(tài)學及生物多樣性監(jiān)測等；檢測對象涵蓋了微生物、植物、魚類、哺乳類等生物。從物種多樣性研究、生物量評估、入侵物種監(jiān)測甚至到重建古生態(tài)系統(tǒng)、古植物史，eDNA 的應用范圍也在不斷擴大。eDNA 技術(shù)作為一種全新的生物調(diào)查方法，同傳統(tǒng)調(diào)查方法相比，具備靈敏度高、特異性強、操作便捷、受外界影響因素小等顯著特點。在使用該種方法進行調(diào)查時，能節(jié)省人力、物力、財力以及時間，采樣時，對生態(tài)系統(tǒng)的干擾較小。

4.2 eDNA 技術(shù)存在的問題

eDNA 技術(shù)雖在以上方面優(yōu)于傳統(tǒng)調(diào)查方法，但在目前的諸多研究試驗中，仍存在一系列的問題與不足。在采集和保存樣品、eDNA 提取及分析等方面，各研究者所采取的方法不盡相同，導致最后與得出的結(jié)果之間，均存在一定差異，缺乏對比性。因此建立eDNA 監(jiān)測方法標準化框架，對eDNA 技術(shù)的應用推廣十分重要。

eDNA 技術(shù)存在PCR 通用引物設(shè)計繁鎖的潛在局限性，目前的研究水平，尚無十分完美的通用引物。以魚類多樣性檢測中常用的12S rRNA 序列為例，在進行PCR 擴增后，得到的片段幾乎90%均注釋到魚類中，但其分辨率較低，種屬區(qū)分度不明顯，仍需要加以改進[42]。

在樣品采集、保存及運輸過程中，極易出現(xiàn)交叉污染，且樣品本身可能含有高鹽、腐殖酸、重金屬離子等PCR 抑制劑，導致試驗結(jié)果出現(xiàn)假陰性的情況。PCR 擴增及高通量測序時，操作步驟煩瑣，使用試劑繁雜，也增加了樣品被污染的概率。

目前常用的基因庫有NCBI、BLOD 和Mito chondrial Genome Database of Fish 等大型開放數(shù)據(jù)庫，針對一些特定生物類群構(gòu)建的DNA 數(shù)據(jù)庫，也在不斷出現(xiàn)，但在這些國際數(shù)據(jù)庫中，有關(guān)中國生物類群的數(shù)據(jù)，仍存在很大欠缺。趙夢迪[43]在中國東黃海魚類資源調(diào)查時發(fā)現(xiàn)，eDNA 技術(shù)能夠檢測到大部分的傳統(tǒng)方法捕撈的魚類，卻仍有部分魚類無法被檢測到。

5 展望

環(huán)境DNA 技術(shù)作為一種快速、精準的生物調(diào)查方法，與第二代測序技術(shù)（NGS）相結(jié)合，極大提高了人類對生態(tài)系統(tǒng)中物種信息監(jiān)測的能力。該方法目前在物種多樣性監(jiān)測、生物量評估、珍稀水生生物資源調(diào)查等諸多研究中，展現(xiàn)出了顯著優(yōu)勢和巨大潛能。但國內(nèi)eDNA 技術(shù)起步較晚，因此仍有許多問題需進一步研究和解決。在今后的環(huán)境DNA研究中，一方面要大力發(fā)展并推廣eDNA 技術(shù)，完善國內(nèi)數(shù)據(jù)庫；另一方面應盡快制定一個統(tǒng)一的eDNA 監(jiān)測方法標準化框架。eDNA 技術(shù)與傳統(tǒng)調(diào)查方法各有自己的優(yōu)勢，在實際應用過程中，eDNA技術(shù)不能完全取代傳統(tǒng)調(diào)查方法，要將2 種方法相結(jié)合，才能更好地對水生生物進行監(jiān)測，在水生生態(tài)文明建設(shè)中發(fā)揮更為重要的作用。