鄭友，姜虎成，張燕，李杰，周梓涵，劉國興，*

[1.江蘇省淡水水產(chǎn)研究所，江蘇 南京 210017；2.江蘇省科技資源（農(nóng)業(yè)種質(zhì)）統(tǒng)籌服務(wù)平臺重要經(jīng)濟(jì)魚類低溫種質(zhì)庫，江蘇南京 210017；3.揚(yáng)州大學(xué)動物科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，江蘇 揚(yáng)州 225009]

當(dāng)藍(lán)藻暴發(fā)時，會產(chǎn)生不同種類的藻毒素（Microcystins, MCs），嚴(yán)重影響水產(chǎn)養(yǎng)殖動物的安全[1]。在MCs 的眾多變體中，微囊藻毒素（LR 亞型）（Microcystin-LR, MC-LR）的毒性最強(qiáng)。MC-LR 在環(huán)境中性質(zhì)極其穩(wěn)定，且難以被降解，容易通過食物鏈富集到水生動物體內(nèi)，最終進(jìn)入到人體中并造成危害[2-3]。目前MC-LR 在全球不同水體中均有檢測到。2008 年，太湖水體中MC-LR 檢測質(zhì)量濃度為11.8 μg/L[4]；土耳其科瓦達(dá)湖中MC-LR 檢測質(zhì)量濃度為48.5 μg/L[5]。這些濃度都遠(yuǎn)高于世界衛(wèi)生組織對飲用水中MC-LR 上限含量的（1 μg/L）規(guī)定。

目前，有關(guān)魚類暴露在MC-LR 的研究，多集中在魚類的免疫[6]、神經(jīng)[7]和生殖毒性[8]等方面。腸道作為重要的免疫和消化器官，對水生動物的健康有較大的影響[9]。當(dāng)魚類暴露在受藍(lán)藻污染的水體中，腸道作為MC-LR 的靶器官[10]，直接影響到腸道結(jié)構(gòu)的穩(wěn)態(tài)，最終對機(jī)體的健康產(chǎn)生影響。

河川沙塘鱧（Odontobutis potamophila）是一種個體較小、肉食性的淡水底棲魚類，廣泛分布在長江中下游、錢塘江、閩江等水系。近些年來，隨著河川沙塘鱧人工養(yǎng)殖技術(shù)的逐步成熟，養(yǎng)殖規(guī)模不斷擴(kuò)大。當(dāng)養(yǎng)殖水體暴發(fā)藍(lán)藻時，河川沙塘鱧會受到MC-LR 的脅迫。現(xiàn)開展MC-LR 對河川沙塘鱧組織病理損傷、生化反應(yīng)的影響試驗(yàn)，了解MC-LR對河川沙塘鱧生長和存活的影響，為MCLR 的風(fēng)險評估提供參考。

1 材料與方法

1.1 時間與地點(diǎn)

2022 年10 月23 日—11 月9 日。試驗(yàn)地位于江蘇省淡水水產(chǎn)研究所揚(yáng)中基地。

1.2 材料

MC-LR（MC-LR，CAS 101043-37-2, HPLC≥純度95%）購買于上海源葉生物科技有限公司（中國上海）。將其溶于甲醇，配制質(zhì)量濃度為250 μg/mL的原液，于-20 ℃冰箱保存。通過向曝氣自來水中加入適量的原液，達(dá)到MC-LR 處理所需的濃度。

選擇體型相近的河川沙塘鱧，體長（11.5±0.9）cm，體質(zhì)量（25.3±4.0）g，產(chǎn)自江蘇揚(yáng)中養(yǎng)殖基地。在試驗(yàn)前，沙塘鱧在2 個50 L 水箱中馴化2 周，實(shí)驗(yàn)室溫度（26±2）℃，光暗周期12∶12。馴化和試驗(yàn)期間，均提供餌料。馴化后，將沙塘鱧隨機(jī)分配到實(shí)驗(yàn)室藍(lán)色水箱（60 cm×30 cm×35 cm）。在試驗(yàn)期間，水體鹽度為（0.10±0.03）%，pH 值7.0～7.5，溫度（26±1）℃。每隔1 d 換1 次水。

1.3 慢性暴露試驗(yàn)

設(shè)置3 個試驗(yàn)組（D3、D5、D7）1 個對照組（CK）。選擇世界衛(wèi)生組織微囊藻毒素限定標(biāo)準(zhǔn)值（1 μg/L）的10 倍，作為試驗(yàn)的暴露濃度。試驗(yàn)組在曝氣自來水中加入適量的原液，以達(dá)到MC-LR 處理所需的濃度（10 μg/L）。對照組中只加入干凈的水，不加任何試劑，其余條件與試驗(yàn)組保持一致。每個試驗(yàn)組設(shè)置3 個重復(fù)組，每個重復(fù)組10 條魚，試驗(yàn)組共9 個重復(fù)，90 條魚。對照組3 個重復(fù)，每個重復(fù)10 條魚。

在試驗(yàn)期間，每天更換三分之一的水，以保持水質(zhì)和適當(dāng)濃度的MC-LR，其他條件與馴化過程保持一致。在試驗(yàn)開始后的24 h 內(nèi)，每4 h 觀察1 次沙塘鱧中毒癥狀并記錄，同時記錄24，48 和96 h 其死亡率。

1.4 樣品收集

在采集樣品前，禁食1 d，使用三卡因甲磺酸鹽（MS222）麻醉河川沙塘鱧，另外，取各組河川沙塘鱧的腸道和肝臟組織，用4%多聚甲醛固定，進(jìn)行組織病理學(xué)檢查。用無菌磷酸鹽緩沖溶液（PBS）沖洗腸道3 次，液氮快速冷凍，于-80 ℃冰箱保存，用來測定生化指標(biāo)。所有采樣程序都是在超凈工作臺上進(jìn)行。

1.5 生化分析

每組隨機(jī)取3 尾河川沙塘鱧的腸道組織（n=3），取樣量為0.2 g 左右，使用PBS 沖洗血液，快速放入液氮中，并于-80 ℃冰箱保存。測定酶活前，將組織混合生理鹽水勻漿（W∶V=1∶9），然后在4 ℃下，于3 500 r/min 離心10 min。分別測定總超氧化物歧化酶（T-SOD）、過氧化氫酶（CAT）、丙二醛（MDA）、谷胱甘肽過氧化物酶（GPX）和還原型谷胱甘肽（GSH）水平。

1.6 HE 染色及組織病理學(xué)觀察

每組隨機(jī)取3 尾河川沙塘鱧的腸道和肝臟組織，使用PBS 沖洗血液。吸干水分后放入裝有4%多聚甲醛的離心管中固定24 h。隨后用水沖洗組織，并用分級乙醇系列進(jìn)行脫水。然后，樣品在二甲苯中透明，并包埋在石蠟中。石蠟切片厚度為5 μm，使用旋轉(zhuǎn)切片機(jī)（RM2016，萊卡，德國）。脫蠟后切片蘇木精-伊紅染色。染色切片的顯微鏡觀察和攝影使用顯微鏡（Eclipse E100，尼康，日本）。

1.7 數(shù)據(jù)處理與統(tǒng)計分析

采用單因素方差分析（ANOVA）和Waller-Duncan 多重區(qū)間檢驗(yàn)分析各組間的生化指標(biāo)，比較組間差異顯著。統(tǒng)計分析使用GraphPad 9.0 軟件（Graph Pad Software Inc., USA）和SPSS 軟件（Ver., 26.0；SPSS Inc., 美國）。結(jié)果以（平均值±標(biāo)準(zhǔn)差）表示。P＜0.05 被認(rèn)為具有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果與分析

2.1 中毒癥狀以及死亡率

MC-LR 對河川沙塘鱧的毒性試驗(yàn)結(jié)果見表1。由表1 可見，在MC-LR 暴露的3 d，河川沙塘鱧開始出現(xiàn)反應(yīng)遲鈍的現(xiàn)象，玻璃棒觸碰后游動正常，各組均未出現(xiàn)死亡。暴露的5 d 后，沙塘鱧開始出現(xiàn)測斜，玻璃棒觸碰后游動緩慢，開始出現(xiàn)死亡，死亡率達(dá)到16.6%。在暴露的7 d，使用玻璃杯觸碰存活的沙塘鱧，部分游動緩慢，部分僵直不動，但是鰓蓋仍能緩慢閉合張開。此時沙塘鱧的死亡率達(dá)到40%，死亡的沙塘鱧，側(cè)臥在養(yǎng)殖箱底部，皮膚發(fā)白，眼球凸起。

表1 MC-LR 對河川沙塘鱧的毒性試驗(yàn)結(jié)果

2.2 MC-LR 引起河川沙塘鱧肝臟組織病理損傷

通過HE 染色，10 μg/L MC-LR 暴露不同時間段后，河川沙塘鱧的肝臟組織病理變化見圖1（a）（b）（c）（d）。由圖1（a）可見，對照組的沙塘鱧的肝細(xì)胞結(jié)構(gòu)完整，細(xì)胞核呈現(xiàn)深褐色并位于細(xì)胞中間，細(xì)胞間界限清晰。圖1（b）中，暴露的3 d 后，肝細(xì)胞間縫隙變大，出現(xiàn)充血。由圖1（c）（d）可知，在暴露的5 d 中，肝細(xì)胞開始出現(xiàn)核溶解，同時出現(xiàn)粉紅色的嗜酸小體。在7 d 時，癥狀加重。

圖1 10 μg/L MC-LR 暴露不同時間段后河川沙塘鱧的肝臟組織病理變化

2.3 MC-LR 引起河川沙塘鱧腸道組織病理損傷

通過HE 染色，10 μg/L MC-LR 暴露不同時間段后河川沙塘鱧的腸道組織病理變化見圖2（a）（b）（c）（d）。由圖2（a）可見，對照組沙塘鱧的腸道結(jié)構(gòu)正常，腸絨毛完整，隱窩結(jié)構(gòu)無異常。圖2（b）中，暴露的3 d 后，腸道黏膜肌層出現(xiàn)空泡。由圖2（c）可知，在暴露的5 d 中，腸道的空泡化加重。在圖2（d）中，暴露在MC-LR 的7 d 后，隱窩結(jié)構(gòu)出現(xiàn)異常，且仍存在空泡化的情況。

2.4 MC-LR 引起河川沙塘鱧腸道組織抗氧化能力的變化

MC-LR 對河川沙塘鱧腸道T-SOD、CAT 活性和MDA、GPX、GSH 濃度見圖3（a）（b）（c）（d）（e）。圖中各柱間字母不同，表示組間差異顯著（P＜0.05），字母相同表示組間差異不顯著（P＞0.05）。由圖3 可見，T-SOD 酶活性呈現(xiàn)顯著下降趨勢；而CAT 酶活性和MDA、GPX 的濃度呈現(xiàn)先下降后上升的趨勢，GSH 的濃度與GPX 酶濃度變化趨勢相反。

3 討論

MC-LR 對大多數(shù)水生動物有劇毒，但其毒性對不同水生動物的影響存在一定差異。目前，大多數(shù)有關(guān)MC-LR 對魚類的毒理學(xué)研究均為急性試驗(yàn)，多采用腹腔注射致死濃度或者亞致死濃度。沈強(qiáng)等[11]通過對白鰱和羅非魚腹腔注射MC-LR，發(fā)現(xiàn)MC-LR 的LD50分別為270 和790 μg/kg。環(huán)境暴露作為另一種攻毒方式，可以更好地模擬野外真實(shí)環(huán)境中大多數(shù)魚類的MC 暴露情況。姜錦林[12]將鯉暴露在10 μg/L 的環(huán)境中14 d，發(fā)現(xiàn)MC-LR 顯著改變了抗氧化酶活的活性及濃度，同時造成了一些病理學(xué)損傷，但隨著暴露時間的增加，氧化損傷得到了消除。在本試驗(yàn)中，發(fā)現(xiàn)MC-LR 對河川沙塘鱧產(chǎn)生了類似的影響，但是隨著暴露時間的增加，損傷沒有被消除。推斷兩者試驗(yàn)結(jié)果的差別，是由物種差異、個體大小和養(yǎng)殖環(huán)境等綜合因素造成。

MC-LR 是一種肝毒素，極易在肝臟中累積，影響肝臟的功能[13]。在本試驗(yàn)中，河川沙塘鱧在10 μg/L MC-LR 的暴露下，肝臟的組織結(jié)構(gòu)受到嚴(yán)重破壞。暴露3 d 后，肝臟出現(xiàn)充血癥狀。隨后在5 d 時，肝細(xì)胞出現(xiàn)了核溶解現(xiàn)象，表明肝細(xì)胞開始出現(xiàn)了凋亡。作為重要的免疫和代謝器官，肝細(xì)胞的凋亡，會導(dǎo)致解毒能力下降，最終造成魚類死亡[14]。在7 d 時，肝細(xì)胞出現(xiàn)大量的嗜酸小體，這是由于細(xì)胞凋亡時，細(xì)胞膜內(nèi)陷或胞質(zhì)出芽脫落形成的，這同樣也證明了肝細(xì)胞的凋亡。

目前，有關(guān)MC-LR 對水生動的影響多集中在重要的免疫器官上，而腸道作為河川沙塘鱧體內(nèi)最早接觸MC-LR 的組織，還未被全面的研究。為了探究MC-LR 對腸道影響，同樣對腸道進(jìn)行了組織病理觀察。發(fā)現(xiàn)，雖然河川沙塘鱧的腸絨毛結(jié)構(gòu)沒有受到影響，但是腸道黏膜肌層出現(xiàn)了空泡，這可能是MC-LR 通過腸道上皮屏障或者腸道漿膜滲透后造成的。此外，在暴露的7 d，發(fā)現(xiàn)隱窩結(jié)構(gòu)出現(xiàn)異常，這影響了腸道對營養(yǎng)物質(zhì)的吸收。

為了探究MC-LR 是否會引起腸道的氧化應(yīng)激，對腸道的幾種抗氧化酶進(jìn)行了測定。試驗(yàn)表明，只有抗氧化酶T-SOD 的活性出現(xiàn)了下降的趨勢，這與河川沙塘鱧暴露在溴氰菊酯的變化趨勢一致[15]。SOD 可以中和體內(nèi)氧化應(yīng)激產(chǎn)生的活性氧（ROS），減少其帶來的損害。推測MC-LR 導(dǎo)致腸道組織氧化應(yīng)激，產(chǎn)生了過量的ROS，而組織為了抵抗氧化應(yīng)激所產(chǎn)生的SOD，無法完全消除ROS，當(dāng)氧化與抗氧化的平衡被打破時，組織受到了ROS 的侵害，導(dǎo)致產(chǎn)生SOD 的能力越來越弱，這是T-SOD呈現(xiàn)下降趨勢的原因。CAT 酶可以消除H2O2帶來的損害。MDA 是脂質(zhì)氧化的最終產(chǎn)物，MDA 的變化可以反映脂質(zhì)氧化損傷的程度。在本試驗(yàn)中，CAT酶和MDA 濃度都呈現(xiàn)先下降后上升的趨勢，這可能與T-SOD 酶活性的下降有關(guān)。GPX 同樣是體內(nèi)重要的過氧化氫分解酶，同時它還是GSH 的底物，催化GSH 變成GSSG，使有毒的氧化物變成無毒的烴基化合物，這對緩解MC 產(chǎn)生的活性氧對組織的損害是極其重要的[16]。本試驗(yàn)中，GPX 酶與抗氧化劑GSH 的變化趨勢正相反，這可能是部分GPX 酶參與了GSH 的催化反應(yīng)，導(dǎo)致GPX 酶濃度減少，從而使GSH 的濃度增多。

4 結(jié)論

MC-LR 對河川沙塘鱧具有毒性作用，毒理機(jī)制可能是通過產(chǎn)生過量的ROS 影響腸道組織的抗氧化能力，從而引起組織損傷。同時肝組織作為微囊藻毒素的主要靶器官，肝細(xì)胞的大量凋亡導(dǎo)致其免疫能力下降，最終導(dǎo)致河川沙塘鱧的死亡。