先天性巨結(jié)腸癥(hirschsprung’s disease,HD)是常見的小兒遺傳疾病[1-2],臨床癥狀主要表現(xiàn)為胎便排出延遲,糞便瘀積導(dǎo)致腸梗阻及結(jié)腸肥厚擴(kuò)張,嚴(yán)重者可導(dǎo)致爆發(fā)性小腸結(jié)腸炎,若不及時采取治療措施,可能威脅患兒生命[3]。因此,探究HD發(fā)病的相關(guān)因素并及時采取干預(yù)措施,對于改善患兒預(yù)后至關(guān)重要。多項(xiàng)研究認(rèn)為,HD是由多種低外顯致病基因協(xié)同作用造成的遺傳性疾病[4-5],其主要病理機(jī)制為神經(jīng)調(diào)節(jié)蛋白通路的失調(diào)。NRG1和NRG3基因均屬于神經(jīng)調(diào)節(jié)蛋白(NRGs),可參與調(diào)控神經(jīng)角質(zhì)細(xì)胞的生長、增殖與分化等,在上皮、肌肉細(xì)胞的增殖與分化中發(fā)揮重要作用[6-7]。與NRG1類似,SOX10對于形成和維持發(fā)育后期膠質(zhì)細(xì)胞的特性至關(guān)重要,有學(xué)者在HD患者的無神經(jīng)節(jié)細(xì)胞腸段中觀察到SOX10的異常表達(dá)[8]。上述研究證實(shí)HD的發(fā)病與NRG1、NRG3和SOX10基因表達(dá)密切相關(guān),但其基因多態(tài)性對HD發(fā)病的影響相關(guān)研究較少,現(xiàn)基于MiniSeq基因測序技術(shù)對HD患者NRG1、NRG3和SOX10基因多個位點(diǎn)單核苷酸多態(tài)性(single nucleotide polymorphism,SNP)進(jìn)行檢測,探討基因多態(tài)性與HD發(fā)病的相關(guān)性,具體報(bào)道如下。

1 資料與方法

1.1 對象 選擇本院在2019年2月到2023年2月期間確診為HD的患兒74例作為病例組,并將同期83例健康兒童納入對照組,病例組患兒年齡為2個月～10歲,平均年齡(4.83±1.34)歲;對照組體檢兒童年齡為3個月～9歲,平均年齡(4.22±1.10)歲。納入標(biāo)準(zhǔn):①HD診斷參考《先天性巨結(jié)腸的診斷及治療專家共識》[9];②研究對象家屬簽署知情同意書;③研究對象均具有完整的臨床資料。排除對象:①樣本采集前接受藥物治療;②內(nèi)分泌相關(guān)病史者;③配合度較低者。本次研究應(yīng)用的治療方案經(jīng)東莞市第八人民醫(yī)院倫理委員會的審核批準(zhǔn)(審批號:DEPH190211)。

1.2 方法

1.2.1 臨床資料收集 收集患者基本資料用于本次研究,包括性別、母親年齡、父親年齡、其它先天性疾病、母孕期主/被動吸煙、母親接觸有毒物質(zhì)、父親接觸有毒物質(zhì)、母孕期合并癥、母孕期患病史、家庭先天性畸形史、家庭惡性腫瘤病史及家庭頑固性便秘史。

1.2.2SOX10、NRG1和NRG3基因單核苷酸多態(tài)性檢測 利用生物信息數(shù)據(jù)庫(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/snp/)查找目的基因的多態(tài)性位點(diǎn),本研究選取SOX10多態(tài)性位點(diǎn)rs139884,3個NRG1多態(tài)性位點(diǎn)rs2439302、rs7835688和rs16879552,3分NRG3多態(tài)性位點(diǎn)rs10748842、rs10883866和rs6584400,釆用PCR擴(kuò)增目的基因,再對所選SNP位點(diǎn)進(jìn)行分型分析。

采外周血2 mL于EDTA抗凝管中,使用白細(xì)胞純化試劑處理血液樣本5 min,離心3 min轉(zhuǎn)速為3 000 r/min,再經(jīng)兩次純化后得到白細(xì)胞樣本,渦旋裂解白細(xì)胞樣本3 min,得到待測DNA樣品。SOX10、NRG1和NRG3基因PCR引物設(shè)計(jì)如表1所示。PCR反應(yīng)體系20 μL:模板DNA 2 μL,正反向引物各0.5 μL,2×Taq PCR Master Mix 10 μL,去離子水7 μL。PCR反應(yīng)條件:①DNA鏈預(yù)變性95 ℃,10 min;②DNA鏈變性92 ℃,30 s;反應(yīng)體系退火55 ℃,30 s;DNA鏈延伸72 ℃,45 s,均循環(huán)36次;③DNA鏈總延伸72 ℃,10 min;④產(chǎn)物4 ℃保存。PCR反應(yīng)產(chǎn)物經(jīng)2%瓊脂糖凝膠檢測,若目的電泳帶清晰、無雜帶,表明PCR擴(kuò)增成功。PCR產(chǎn)物擴(kuò)增成功后選用相應(yīng)的限制性內(nèi)切酶分別對選取的7個SNP位點(diǎn)進(jìn)行酶切分析,酶切產(chǎn)物在2%瓊脂糖凝膠電泳,觀察并記錄影像。采用美國Illumina公司MiniSeq高通量測序儀進(jìn)行基因測序。

表1 SOX10、NRG1和NRG3基因各SNP位點(diǎn)引物序列

2 結(jié)果

2.1 基因分型結(jié)果 根據(jù)兩組研究對象SOX10、NRG1和NRG3基因的7個SNP位點(diǎn)分析顯示,rs139884位點(diǎn)等位基因C/T,分型為CC、TT、CT;rs2439302位點(diǎn)等位基因C/G,分型為CC、GG、CG;rs7835688位點(diǎn)等位基因G/C,分型為GG、CC、GC;rs16879552位點(diǎn)等位基因T/C,分型為TT、CC、TC;rs10748842位點(diǎn)等位基因T/C,分型為TT、CC、TC;rs10883866位點(diǎn)等位基因C/G,分型為CC、GG、CG;rs6584400位點(diǎn)等位基因G/A,分型為GG、AA、GA(圖1),圖2為各SNP位點(diǎn)的基因型分布情況。對檢測出的SOX10、NRG1和NRG3基因多態(tài)性數(shù)據(jù)進(jìn)行Hardy-Weinberg遺傳平衡檢驗(yàn),實(shí)際頻數(shù)和理論頻數(shù)比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05),樣本符合Hardy-Weinberg遺傳平衡定律(表2)。

A:rs139884位點(diǎn)1、2為CT基因型,3、4為TT基因型,5、6為CC基因型;B:1、2、3分別為rs2439302位點(diǎn)CG、CC、GG基因型,4、5、6分別為rs7835688位點(diǎn)GC、CC、GG基因型;C:1、2、3分別為rs16879552位點(diǎn)TT、CC、TC基因型,4、5、6分別為rs10748842位點(diǎn)TT、CC、TC基因型;D:1、2、3分別為rs10883866位點(diǎn)CC、CG、GG基因型,4、5、6分別為rs6584400位點(diǎn)GG、AA、GA基因型。

A:rs2439302位點(diǎn);B:rs2439302位點(diǎn);C:rs2439302位點(diǎn);D:rs16879552位點(diǎn);E:rs10748842位點(diǎn);F:rs10883866位點(diǎn);G:rs6584400位點(diǎn)。

表2 Hardy-Weinberg 遺傳平衡檢驗(yàn)

2.2 兩組一般資料比較 對兩組一般資料進(jìn)行比較,母親年齡、其它先天性疾病、父親接觸有毒物質(zhì)、母孕期合并癥、母孕期患病史、家庭頑固性便秘史對患兒HD發(fā)病無顯著影響(P>0.05),病例組患兒父親年齡顯著高于對照組(P<0.05),病例組母孕期主/被動吸煙、母親接觸有毒物質(zhì)、母親接觸有毒物質(zhì)及有家庭惡性腫瘤病史的患兒人數(shù)顯著高于對照組(P<0.05,表3)。

表3 病例組與對照組一般資料對比

以理論值作為參照組進(jìn)行用卡方檢驗(yàn)(χ2)。

2.3 不同基因中單個SNP位點(diǎn)與先天性巨結(jié)腸癥的相關(guān)性SOX10、NRG1和NRG3基因各SNP位點(diǎn)基因型在兩組中的分布情況如表4所示,NRG3基因rs10748842、rs10883866、rs6584400位點(diǎn)和SOX10基因rs139884位點(diǎn)各基因型在兩組間的分布頻率差異均不具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05);病例組患者NRG1基因rs2439302位點(diǎn)CG和GG基因型人數(shù)顯著高于對照組,并且rs7835688位點(diǎn)GC和CC基因型人數(shù)顯著高于對照組(P<0.05),攜帶NRG1基因rs2439302和rs7835688突變雜合基因和突變純合基因型的個體比同基因位點(diǎn)野生純合基因攜帶者HD發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)更高。

表4 SOX10、NRG1和NRG3基因不同SNP位點(diǎn)與HD發(fā)病的相關(guān)性

2.4 HD發(fā)病的多因素分析 將是否HD發(fā)病作為因變量(未發(fā)病=0,發(fā)病=1),將患者一般資料中具有顯著差異的因素及2個NRG1基因SNP位點(diǎn)的基因型作為自變量(表5)進(jìn)行多因素Logistic回歸分析,校正母親年齡、其它先天性疾病、父親接觸有毒物質(zhì)及母孕期合并癥等因素后,分析結(jié)果顯示,性別、母孕期主/被動吸煙、母親接觸有毒物質(zhì)、rs2439302-G和rs7835688-C等位基因是影響HD發(fā)病的獨(dú)立危險(xiǎn)因素(表6)。

表5 多因素Logistic回歸分析變量賦值情況

2.5 列線圖模型 將篩選出的5個獨(dú)立危險(xiǎn)因素作為預(yù)測因子構(gòu)建列線圖模型,根據(jù)列陣圖讀出賦分結(jié)果,預(yù)測HD發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)率,以劉某為例,男性賦分49.43分,母孕期主/被動吸煙賦分33.75分,母親未接觸有毒物質(zhì)賦分0分,NRG1的rs2439302位點(diǎn)基因型為CG或GG賦分39.06分,NRG1的rs7835688位點(diǎn)基因型為GC或CC賦分38.24分,所得總分160.48分對應(yīng)的概率即為預(yù)測HD發(fā)病概率79.03%(圖3)。

圖3 預(yù)測HD發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)的列線圖模型

2.6 模型驗(yàn)證 采用Bootstrap法重復(fù)抽樣1 000次內(nèi)部驗(yàn)證該模型,列線圖模型預(yù)測HD發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)作為檢驗(yàn)變量,患者實(shí)際HD發(fā)病作為狀態(tài)變量,構(gòu)建列線圖模型預(yù)測HD發(fā)病的ROC曲線和校準(zhǔn)曲線,列線圖模型的校準(zhǔn)度以校準(zhǔn)曲線中的平均絕對誤差(Mean absolute error,MAE)進(jìn)行評估,由分析結(jié)果可知,內(nèi)部驗(yàn)證前后曲線下面積(AUC)分別為0.837(95%CI:0.784～0.893)、0.841(95%CI:0.786～0.896),靈敏度分別為86.5%和89.2%,特異度分別為77.1%、78.3%,MAE分別為0.015、0.017,表明列線圖預(yù)測模型區(qū)分度、校準(zhǔn)度、靈敏度及特異度良好(圖4～5、表7)。

圖4 內(nèi)部驗(yàn)證前后列線圖預(yù)測模型的ROC曲線

圖5 內(nèi)部驗(yàn)證前后列線圖預(yù)測模型的校準(zhǔn)曲線

表7 Bootstrap內(nèi)部驗(yàn)證前后模型區(qū)分度指標(biāo)比較

3 討論

HD是一種先天性高度異質(zhì)性遺傳疾病[10]。目前發(fā)現(xiàn)可以在胚胎時期影響腸道發(fā)育的基因有10余種[11-12]。其中SOX10基因?qū)儆赟OX基因家族成員,參與胚胎發(fā)育和細(xì)胞分化的調(diào)控[13]。目前SOX10在HD相關(guān)綜合征中研究報(bào)道較多,而研究對象為HD患者相關(guān)報(bào)道較少[14]。神經(jīng)調(diào)節(jié)蛋白(NRGs)是由一個表皮生長因子信號分子通路組成,他們參與了細(xì)胞間通訊,如遷移,増殖,分化及調(diào)亡等。NRG1可在整個神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)展中表達(dá)[15],而NRG3與NRG1有相同的受體,并且基因的協(xié)同作用可以對成神經(jīng)細(xì)胞的發(fā)育產(chǎn)生影響[16]。但對于散發(fā)性HD患者上述基因編碼區(qū)序列發(fā)生突變難以發(fā)現(xiàn)。因此不同SNP位點(diǎn)與HD的發(fā)病相關(guān)研究逐漸增多[17-19]。

HD屬于復(fù)雜多基因病,多基因病是指一類由多對、十幾對或更多的基因控制的、遺傳因素與環(huán)境因素相互作用的疾病。目前認(rèn)為一些常見的遺傳變異,主要是指SNPs及其特定的組合可能是造成復(fù)雜性狀疾病易感性的最重要的原因[20]。有研究表明在中國漢族人群中,NRG1基因變異會增加HD的風(fēng)險(xiǎn)[8],本研究中確認(rèn)了NRG1基因兩個SNP位點(diǎn)rs2439302與rs7835688與HD發(fā)病相關(guān),rs2439302位點(diǎn)C突變?yōu)镚,病例組CG和GG基因型人數(shù)顯著高于對照組;rs7835688位點(diǎn)G突變?yōu)镃,病例組GC和CC基因型人數(shù)顯著高于對照組,rs2439302-G與rs7835688-C為HD發(fā)病的風(fēng)險(xiǎn)等位基因,分析其原因可能是由于NRG1通路的失調(diào)導(dǎo)致HD發(fā)病,并且NRG1風(fēng)險(xiǎn)基因型存在的情況下,RET rs2435357風(fēng)險(xiǎn)基因型(TT)增加2.3至19.53倍。NRG1不僅影響神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞發(fā)育、遷移以及髓鞘和軸突形成,還與RET之間存在相互作用,通過多重機(jī)制影響HD的發(fā)展[21]。研究中多因素Logistic回歸分析結(jié)果顯示,除rs2435357-G和rs7835688-C外,性別、母孕期主/被動吸煙、母親接觸有毒物質(zhì)也是影響HD發(fā)生的獨(dú)立危險(xiǎn)因素,基于這5項(xiàng)因素構(gòu)建預(yù)測HD發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)的列線圖模型并驗(yàn)證模型,內(nèi)部驗(yàn)證前后AUC值分別為0.837(95%CI:0.837～0.893)、0.841(95%CI:0.841～0.896),靈敏度分別為87.8%和89.2%,特異度分別為77.1%、78.3%,該模型具有良好的預(yù)測價值。但研究中未發(fā)現(xiàn)SNP位點(diǎn)rs16879552、rs139884、rs10748842、rs10883866及rs6584400與HD的發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)相關(guān),SOX10和NRG3基因可能不是HD發(fā)病的易感基因。本研究存在一定的局限性,納入的樣本數(shù)據(jù)來自同一醫(yī)療中心,結(jié)果難免存在一定偏倚;研究對象均為中國漢族,對于我國以外的其他種族人群,尚未進(jìn)行本研究結(jié)果的合理性和有效性探討,未來還需要擴(kuò)大樣本量進(jìn)一步對研究結(jié)果進(jìn)行確認(rèn)。

綜上所述,NRG1是先天性巨結(jié)腸癥的易感基因,rs2439302-G和rs7835688-C為HD發(fā)病的風(fēng)險(xiǎn)等位基因,而rs16879552、rs139884、rs10748842、rs10883866和rs6584400與HD發(fā)病無明顯相關(guān)性;基于性別、母孕期主/被動吸煙、母親接觸有毒物質(zhì)、rs2439302-G和rs7835688-C構(gòu)建的列線圖模型對HD發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)有較好的預(yù)測效果。