朱小朋 付尚辰 郝 果 牛鵬飛 劉永峰

(1. 陜西師范大學(xué)食品工程與營(yíng)養(yǎng)科學(xué)學(xué)院,陜西 西安 710062;2. 富平縣檢驗(yàn)檢測(cè)中心,陜西 渭南 711700)

乳糖是牛乳中存在的主要碳水化合物[1]。乳糖檢測(cè)方法多樣,主要包括酶法、生物傳感器法、核磁共振法、紅外光譜法、分光光度法等[2]。傳統(tǒng)的酶法通常先將乳糖水解為葡萄糖和半乳糖,然后用葡萄糖試劑盒或半乳糖試劑盒通過(guò)測(cè)量還原態(tài)煙酰胺腺嘌呤二核苷酸來(lái)定量乳糖。然而在實(shí)際應(yīng)用中酶法檢測(cè)存在虛高現(xiàn)象,因?yàn)榈腿樘菢悠分写嬖诘途郯肴樘?其在試劑盒的初始反應(yīng)中也被β-半乳糖苷酶水解,導(dǎo)致葡萄糖或半乳糖的測(cè)量結(jié)果偏高,乳糖結(jié)果也相應(yīng)偏高[3]。生物傳感器法快速易操作且成本低,通過(guò)增加葡萄糖濃度來(lái)分析監(jiān)測(cè)水解過(guò)程中的乳糖水平,但是較高濃度的葡萄糖會(huì)產(chǎn)生干擾[4]。核磁共振法可直接對(duì)樣品進(jìn)行測(cè)定,但是有研究[5]發(fā)現(xiàn),當(dāng)乳糖質(zhì)量濃度<100 mg/L時(shí),與乳糖相關(guān)的質(zhì)子信號(hào)與來(lái)自牛乳基質(zhì)的其他信號(hào)重疊,無(wú)法可靠定量。紅外光譜法需要大量樣本建立預(yù)測(cè)模型,過(guò)程復(fù)雜耗時(shí)較長(zhǎng),水分子對(duì)紅外的吸收也會(huì)干擾液體樣品檢測(cè)[6]。分光光度分析方法簡(jiǎn)便、快捷,但是不適合大樣本的分析[7]。

為實(shí)現(xiàn)乳糖含量的準(zhǔn)確快速檢測(cè),試驗(yàn)選用高效液相色譜法(high performance liquid chromatography,HPLC)。它是分析碳水化合物最常用的技術(shù),其檢測(cè)效率高、靈敏度高、易于操作。其中檢測(cè)器的選擇決定檢測(cè)結(jié)果的可靠性,色譜柱的選擇決定分離組分的分離度以及達(dá)到的檢測(cè)限[8-9]。示差折光檢測(cè)器(refractive index detector,RID)對(duì)糖類檢測(cè)靈敏度較高,但是RID易受溫度、流速、流動(dòng)相等因素影響,存在基線穩(wěn)定性差、靈敏度低、與梯度洗脫不相容等問(wèn)題[10]。蒸發(fā)光散射檢測(cè)器(evaporative light scattering detector,ELSD)與RID相比具有較好的穩(wěn)定性和分離能力,靈敏度高、基線穩(wěn)定、無(wú)溶劑峰干擾,對(duì)糖類的測(cè)定有良好的應(yīng)用前景[11]。糖類色譜分析中常用凝膠柱、氨基柱和糖分析柱。凝膠柱常以聚合凝膠作為柱填料,但其孔徑較大適用于多聚糖和高聚糖的測(cè)定。氨基柱以多孔硅膠為基質(zhì),但由于其鍵合的氨丙基易水解從而縮短了氨基柱的使用壽命[12]。而糖柱分離條件簡(jiǎn)單、專一性強(qiáng)[13-14]。鈣型糖柱常用于檢測(cè)糖和糖醇,具有較高的分離效率和分辨率、檢測(cè)快、再生方法簡(jiǎn)單,已有研究[15]將鈣型糖柱用于菊芋塊莖中菊粉的定量分析。

現(xiàn)有研究方法檢測(cè)耗時(shí)較長(zhǎng)、還存在檢測(cè)結(jié)果偏高的現(xiàn)象[2-7]。因此,需要一種快速準(zhǔn)確的方法實(shí)現(xiàn)乳糖含量的檢測(cè)。研究以鈣型糖柱結(jié)合HPLC-ELSD建立牛乳中乳糖的測(cè)定方法,為牛乳質(zhì)量控制及合理利用提供理論依據(jù)和技術(shù)支持。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

生牛乳:采集于陜西省西安市長(zhǎng)安區(qū)奶牛養(yǎng)殖場(chǎng)的健康泌乳期奶牛,采集后放在冰盒中(4 ℃)帶回放入-80 ℃冰箱備用(用于鈣型糖柱法的相關(guān)試驗(yàn));

11種商品液態(tài)乳(編號(hào)1～11,其中:6號(hào)樣品為鮮牛乳,10號(hào)樣品為無(wú)乳糖牛乳):市售;

鈣型糖柱:300 mm×7.8 mm,5 μm,美國(guó)飛諾美公司;

ZORBAX氨基柱:250 mm×4.6 mm,5 μm,美國(guó)安捷倫公司;

乳糖標(biāo)準(zhǔn)品、葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)品、半乳糖標(biāo)準(zhǔn)品:純度≥99%,上海源葉生物科技有限公司;

乙腈:色譜純,湖北弗頓科技術(shù)有限公司;

其他試劑均為分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

高效液相色譜儀:ΜltiMate3000型,美國(guó)賽默飛公司;

蒸發(fā)光散射檢測(cè)器:ELSD6000型,美國(guó)賽默飛公司;

數(shù)顯電子天平:BSA224S-CW型,賽多利斯科學(xué)儀器有限公司;

高速臺(tái)式冷凍離心機(jī):TGL-16gR型,上海安亭科學(xué)儀器廠;

超聲清洗器:KQ3200B型,昆山市超聲儀器有限公司。

1.3 鈣型糖柱法測(cè)定乳糖

1.3.1 樣品溶液制備 生牛乳混勻后稱取5.000 g于50 mL容量瓶中,加入不同質(zhì)量濃度(0.2,0.3,0.4 g/mL)三氯乙酸溶液(trichloroacetic acid,TCA)5 mL,震蕩搖勻并用水定容至50 mL,隨后用濾紙過(guò)濾除去沉淀。取適量濾液稀釋100倍后用0.45 μm微孔濾膜過(guò)濾后進(jìn)行檢測(cè)?？瞻讟悠贩Q取水5.000 g于50 mL容量瓶中,后續(xù)步驟同上。

1.3.2 乳糖標(biāo)準(zhǔn)品溶液制備 準(zhǔn)確稱取乳糖標(biāo)準(zhǔn)品20.0 mg,加入2.0 mL水溶解,得到質(zhì)量濃度為10.0 mg/mL的乳糖標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液,將乳糖標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液分別稀釋500,250,200,125,100倍,以此來(lái)配制質(zhì)量濃度分別為20.0,40.0,50.0,80.0,100.0 mg/L的乳糖標(biāo)準(zhǔn)工作液。于4 ℃冰箱中貯藏備用。

1.3.3 液相色譜條件 色譜柱為鈣型糖柱(300 mm×7.8 mm,5 μm);流動(dòng)相為純水;柱溫60 ℃;進(jìn)樣量20 μL;蒸發(fā)光散射檢測(cè)器條件:飄移管溫度115 ℃;氣流量3.2 L/min,撞擊器關(guān)閉;流速:使用0.9,1.0 mL/min進(jìn)行優(yōu)化。

1.3.4 方法學(xué)考察

(1) 線性關(guān)系:將1.3.2配制的20.0,40.0,50.0,80.0,100.0 mg/L乳糖標(biāo)準(zhǔn)工作液按照1.3.3色譜條件進(jìn)行測(cè)定,記錄峰面積并按式(1)計(jì)算乳糖質(zhì)量濃度,以乳糖質(zhì)量濃度(X1)為橫坐標(biāo)、乳糖峰面積(Y1)為縱坐標(biāo)進(jìn)行線性回歸分析。

(1)

式中:

X1——試樣中乳糖的含量,mg/g;

C1——樣液中乳糖質(zhì)量濃度,mg/L;

C0——空白中乳糖質(zhì)量濃度,mg/L;

V1——試樣定容體積,L;

n1——樣液稀釋倍數(shù);

m1——試樣質(zhì)量,g。

(2) 定量限和檢出限:選取信噪比(S/N)為10時(shí)的乳糖質(zhì)量濃度作為定量限,信噪比(S/N)為3時(shí)的乳糖質(zhì)量濃度作為檢出限。

(3) 精密度和重復(fù)性:精密度考察按照1.3.1所述前處理方法制備1份供試品溶液連續(xù)進(jìn)樣測(cè)定6次,然后依據(jù)1.3.3色譜條件進(jìn)樣檢測(cè);重復(fù)性考察按照1.3.1所述前處理方法制備6份供試品溶液分別進(jìn)樣測(cè)定,然后依據(jù)1.3.3色譜條件進(jìn)樣檢測(cè);記錄峰面積并按式(1)計(jì)算乳糖含量。

(4) 加標(biāo)回收率試驗(yàn):精確稱取生牛乳5.000 g再加入不同水平(15,40,80 mg/g)的乳糖標(biāo)準(zhǔn)品后,按照1.3.1優(yōu)化方法制備待測(cè)樣品并用1.3.3色譜條件進(jìn)樣檢測(cè),記錄峰面積并按式(1)計(jì)算乳糖含量再計(jì)算乳糖回收率。

1.4 氨基柱法測(cè)定乳糖

1.4.1 樣品溶液和乳糖標(biāo)準(zhǔn)品溶液的制備 參考GB 5009.8—2016第一法。

1.4.2 液相色譜條件 參考GB 5009.8—2016第一法。

1.5 市售液態(tài)乳的乳糖含量檢測(cè)

采用GB 5009.8—2016第一法對(duì)試驗(yàn)所建立的方法進(jìn)行驗(yàn)證,將購(gòu)買的11種市售液態(tài)乳參照1.3.1所述前處理方法提取乳糖并用1.3.3所述液相色譜條件進(jìn)行檢測(cè),記錄峰面積并按式(1)計(jì)算乳糖含量;參照1.4.1所述前處理方法提取乳糖并用1.4.2所述液相色譜條件進(jìn)行檢測(cè),記錄峰面積并按式(2)計(jì)算乳糖含量。

(2)

式中:

X2——試樣中乳糖的含量,mg/g;

C2——樣液中乳糖質(zhì)量濃度,mg/mL;

V2——試樣定容體積,mL;

n2——樣液稀釋倍數(shù);

m2——試樣質(zhì)量,g。

1.6 數(shù)據(jù)分析

通過(guò)SPSS Statistics 24.0對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行顯著性分析,其結(jié)果表示為“平均值±標(biāo)準(zhǔn)差”,輸出數(shù)據(jù)由Origin 2018軟件繪圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 鈣型糖柱法條件優(yōu)化

2.1.1 樣品提取優(yōu)化 采用三氯乙酸溶液對(duì)樣品進(jìn)行前處理使蛋白質(zhì)沉淀,該試劑是常用的蛋白質(zhì)沉淀劑,沉淀效果好、準(zhǔn)確度高[16]。由表1可知,TCA質(zhì)量濃度不同時(shí),所得乳糖含量無(wú)顯著性差異(P>0.05),相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差(relative standard deviations,RSDs)為1.48%～2.17%。TCA具有較強(qiáng)腐蝕性,需同時(shí)考慮樣品提取操作的安全性,因此選取最低質(zhì)量濃度0.2 g/mL進(jìn)行提取。

表1 不同濃度TCA處理后乳糖含量

2.1.2 流動(dòng)相流速優(yōu)化 鈣型糖柱的典型流動(dòng)相為純水,以純水作為流動(dòng)相時(shí)色譜圖基線平滑噪音小。然而流動(dòng)相流速的變化會(huì)影響保留時(shí)間、柱壓、分離度和基線穩(wěn)定性[17],流速過(guò)大會(huì)導(dǎo)致色譜圖拖尾和基線不穩(wěn)[18]。圖1中,流速為1.0 mL/min時(shí)乳糖保留時(shí)間為5.008 min,流速為0.9 mL/min時(shí)保留時(shí)間為5.513 min,可見(jiàn)流速增大保留時(shí)間前移。但流速1.0 mL/min時(shí),色譜柱的壓力會(huì)過(guò)高,不宜進(jìn)行大量的樣品分析,同時(shí)會(huì)影響色譜柱壽命。因此,0.9 mL/min為最適宜流速。

圖1 不同流速下乳糖標(biāo)準(zhǔn)品圖譜

2.2 方法學(xué)驗(yàn)證

2.2.2 重復(fù)性和精密度 重復(fù)性試驗(yàn)中所得乳糖含量分別為35.30,37.34,35.67,36.74,37.22,37.71 mg/g,其平均值為(36.66±0.97) mg/g,RSDs為2.65%,表明該方法重復(fù)性較好。精密度試驗(yàn)中所得乳糖含量為35.77,36.41,36.83,36.60,36.73,34.53 mg/g,其平均值為(36.16±0.89) mg/g,RSDs為2.45%。表明在該色譜條件下,高效液相色譜儀精密度良好。

2.2.3 乳糖加標(biāo)回收率 表2中,牛乳樣品在3個(gè)不同加標(biāo)水平下(15,40,80 mg/g)的乳糖回收率為90.96%～98.23%,結(jié)果表明,方法具有很高的準(zhǔn)確度,適用于實(shí)際樣品的測(cè)定。

表2 乳糖加標(biāo)回收率結(jié)果

2.3 鈣型糖柱法和氨基柱法的比較

表3 鈣型糖柱和氨基柱對(duì)乳糖的線性范圍、檢出限及定量限對(duì)比

2.3.2 檢測(cè)耗時(shí)對(duì)比 圖2(a)中,氨基柱法檢測(cè)的乳糖標(biāo)準(zhǔn)品保留時(shí)間為12.577 min并且在3.0 min出現(xiàn)未知雜峰,牛乳樣品中乳糖保留時(shí)間為12.502 min。圖2(b)中,鈣型糖柱法檢測(cè)的乳糖標(biāo)準(zhǔn)品的保留時(shí)間為5.515 min,牛乳中的乳糖保留時(shí)間為5.420 min。并且在乳糖的保留時(shí)間內(nèi),其他組分未出現(xiàn)雜質(zhì)峰干擾,表明方法的專屬性較好。圖2(a)中基線噪音較大,可能是由于漂移管的溫度變化使乙腈沒(méi)有完全蒸發(fā)[19]。因此,鈣型糖柱法與氨基柱法相比,極大縮短了檢測(cè)時(shí)長(zhǎng),提高了檢測(cè)效率,實(shí)現(xiàn)了乳糖含量的快速檢測(cè)。

圖2 牛乳樣品及乳糖標(biāo)準(zhǔn)品的保留時(shí)間圖譜

2.4 市售液態(tài)乳的檢測(cè)結(jié)果對(duì)比

2.4.1 乳糖含量分析 由表4可知,氨基柱法的檢測(cè)結(jié)果為33.93～50.72 mg/g,鈣型糖柱法的檢測(cè)結(jié)果為33.86～49.55 mg/g。為更好地比較兩種方法所測(cè)乳糖含量的差異,對(duì)表4數(shù)據(jù)進(jìn)行獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)。結(jié)果表明,兩種方法所測(cè)11種市售液態(tài)乳的乳糖含量之間均無(wú)顯著性差異(P>0.05)。6號(hào)樣品(鮮牛乳)乳糖含量最高,兩種方法所得結(jié)果一致。

表4 11種市售液態(tài)乳的乳糖含量檢測(cè)結(jié)果

2.4.2 色譜圖分析 圖3(a)中,所有樣品的色譜圖峰形對(duì)稱無(wú)拖尾,基線平穩(wěn)噪音小,無(wú)雜峰干擾,保留時(shí)間一致。10號(hào)樣品在5.5 min時(shí)未出現(xiàn)色譜峰,表明該樣品中無(wú)乳糖,隨后相繼出現(xiàn)兩個(gè)色譜峰,經(jīng)標(biāo)準(zhǔn)品驗(yàn)證分別是葡萄糖(6.518 min)和半乳糖(7.217 min),葡萄糖、半乳糖之間分離效果良好。圖3(b)中,10號(hào)樣品中未檢測(cè)出乳糖和半乳糖,7.8 min的色譜峰為葡萄糖。圖3(b)中8號(hào)樣品在10.0 min的色譜峰為蔗糖。鈣型糖柱法乳糖的保留時(shí)間在5.5 min處呈現(xiàn)高度的一致性(RSDs為0.06%)而國(guó)標(biāo)方法中保留時(shí)間在12.5 min處偏移程度相對(duì)較大(RSDs為0.84%),可能是流動(dòng)相中乙腈揮發(fā)使保留時(shí)間發(fā)生了漂移[20]。

a. 乳糖 b. 葡萄糖 c. 半乳糖 d. 蔗糖

3 結(jié)論

研究建立了以0.2 g/mL三氯乙酸溶液進(jìn)行蛋白質(zhì)沉淀,鈣型糖柱法測(cè)定牛乳中乳糖含量的方法。該方法前處理簡(jiǎn)單且6 min內(nèi)可以實(shí)現(xiàn)乳糖含量檢測(cè),其選擇性好、靈敏度較高、檢出限低(3.6 μg/g)、回收率高、精密度和準(zhǔn)確性良好、峰面積和乳糖含量之間存在良好線性關(guān)系,測(cè)定結(jié)果具有較高準(zhǔn)確度且與國(guó)標(biāo)(GB 5009.8—2016)測(cè)量結(jié)果基本一致。該方法能夠滿足牛乳中定量檢測(cè)乳糖的需要并為產(chǎn)品質(zhì)量控制方面提供技術(shù)支持,還可用于牛乳中葡萄糖、半乳糖的測(cè)定,具有可行性和適用性。