肖 亮，鄒湘香，劉 敏，成志軍，陳 武，劉文祥

（1.湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)，湖南 長沙 410128；2.湖南中煙工業(yè)有限責(zé)任公司原料保障中心，湖南長沙 410000；3.湖南省農(nóng)業(yè)信息與工程研究所，湖南 長沙 410125）

湖南是我國重要的商品蔬菜生產(chǎn)基地之一，2019 年蔬菜種植面積超過131.32 萬hm2，其中包括15.0 萬hm2設(shè)施蔬菜，總產(chǎn)值達(dá)1 322.65 億元[1]。在蔬菜生產(chǎn)中，因復(fù)種指數(shù)高、輪作困難、肥料和農(nóng)藥使用量大而導(dǎo)致的土壤理化性質(zhì)惡化、土傳病害高發(fā)、作物嚴(yán)重減產(chǎn)和品質(zhì)下降等土壤連作障礙問題非常突出，嚴(yán)重影響了蔬菜的產(chǎn)量、品質(zhì)和安全性[2-3]。采用客土換土、土壤化學(xué)熏蒸消毒、灌溉洗鹽等措施雖然可以修復(fù)連作障礙，但存在成本高昂、不環(huán)保和操作流程復(fù)雜等問題[4-6]。

國家“化肥農(nóng)藥雙減”行動(dòng)，以及《“十三五”生物產(chǎn)業(yè)發(fā)展規(guī)劃》、《農(nóng)業(yè)綠色發(fā)展技術(shù)導(dǎo)則（2018—2030 年）》和《湖南省“十三五”科技創(chuàng)新規(guī)劃》等系列文件明確了對突破土壤連作障礙及病蟲害綠色防控關(guān)鍵技術(shù)的要求。為了開發(fā)適宜湖南設(shè)施蔬菜大棚的土壤綠色消毒技術(shù)，筆者以辣椒品種茄門為試材，在益陽市欣博農(nóng)業(yè)有限公司連作障礙嚴(yán)重的設(shè)施大棚進(jìn)行了多種消毒處理的比較試驗(yàn)，研究了不同消毒措施對土壤微生物生態(tài)、土壤微生物功能及主要土傳病害（辣椒白絹病、疫霉、根結(jié)線蟲和青枯病）病原菌豐度以及病害發(fā)生情況的影響，以期為解決設(shè)施蔬菜連作障礙提供參考。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

供試?yán)苯菲贩N：茄門，由湖南省蔬菜研究所提供。于2021 年7 月18 日采用常規(guī)方法播種育苗后備用。

供試大棚：益陽市欣博農(nóng)業(yè)有限公司連作障礙嚴(yán)重的設(shè)施大棚。該大棚已經(jīng)連續(xù)種植辣椒6 a，2021 年辣椒青枯病、辣椒疫病、辣椒白絹病和根結(jié)線蟲等典型根莖病害的綜合發(fā)病率達(dá)85%以上，幾乎絕收。

供試藥劑與有機(jī)物料及其使用方法：棉隆、威百畝、用于RSD 處理的牛糞與稻殼、氰胺化鈣均從當(dāng)?shù)剞r(nóng)資市場購買。棉隆的施用與土壤處理參考行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)NY3127—2017[7]，威百畝的土壤消毒參考團(tuán)體標(biāo)準(zhǔn)T/CCPIA 055—2020[8]，RSD 處理參考王光飛等[9]的方法，氰胺化鈣土壤處理參考陳利達(dá)等[10]的方法。

1.2 試驗(yàn)方法

土壤消毒措施共設(shè)5 個(gè)處理，分別為：T1，棉隆處理，撒施棉隆40 g/m2后翻耕，同時(shí)每小區(qū)施商品有機(jī)肥60 kg 后覆膜；T2，威百畝處理，每小區(qū)噴施威百畝30 倍稀釋液5 L，施商品有機(jī)肥60 kg后覆膜；T3，氰氨化鈣處理，每小區(qū)施牛糞80 kg、谷殼80 kg 和氰氨化鈣12 kg，灌水至飽和后覆膜；T4，RSD 處理，每小區(qū)施牛糞100 kg、谷殼100 kg，灌水到飽和后覆膜；T5（CK）：每小區(qū)施商品有機(jī)肥60 kg，灌水至飽和，不覆膜。每個(gè)處理3 次重復(fù)，一共15 個(gè)小區(qū)，各小區(qū)面積均為80 m2，隨機(jī)區(qū)組排列。土壤消毒處理始于2021 年7 月24 日，于8 月15 日完成土壤消毒后用旋耕機(jī)松土透氣，然后整地。于9 月1 日按常規(guī)方法定植辣椒并進(jìn)行常規(guī)管理。

1.3 測定指標(biāo)及方法

1.3.1 辣椒發(fā)病情況 于2021 年10 月15 日和10月29 日采用常規(guī)方法調(diào)查統(tǒng)計(jì)各處理的辣椒青枯病、疫病、白絹病和根結(jié)線蟲等病害發(fā)病情況，并計(jì)算病情指數(shù)、發(fā)病率和防治效果。

1.3.2 辣椒農(nóng)藝性狀 采用常規(guī)方法調(diào)查統(tǒng)計(jì)各處理辣椒的株高、莖粗和產(chǎn)量。

1.3.3 土壤樣品采集和酶活性測定 消毒處理結(jié)束后按五點(diǎn)式取樣法采集0～10 cm 土層土壤，剔除石塊和作物殘?bào)w后混勻，置于自封袋帶回實(shí)驗(yàn)室。一部分采用試劑盒法測定土壤脲酶、 -葡萄糖苷酶、酸性磷酸酶和蔗糖酶的活性。另一部分經(jīng)冷凍干燥后于-80℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.4 土壤微生物群落結(jié)構(gòu)和多樣性分析 微生物群落結(jié)構(gòu)和多樣性分析時(shí)稱取0.5 g 冷凍干燥后的土壤樣品，用DNA 提取試劑盒（FastDNA SPIN Kit for Soil，MP）提取土壤總DNA。土壤總DNA 經(jīng)Miseq高通量測序，分別對細(xì)菌（16S rRNA）和真菌（ITS保守區(qū)域）進(jìn)行微生物群落結(jié)構(gòu)和多樣性分析。利用QIIME（V 1.9.1）軟件過濾低質(zhì)量序列并去除嵌合體。利用Uparse（V7.0）軟件對樣品中的有效序列以97%的一致性聚類成為OTUs，采用Mothur方法與SSUrRNA 數(shù)據(jù)庫進(jìn)行物種注釋分析。使用QIIME（V 1.9.1）軟件計(jì)算good-coverage、Chao1、Shannon、Simpson 指數(shù)等指標(biāo)，并進(jìn)行network 分析，以挖掘樣品之間的差異。樣品總DNA 提取、PCR 擴(kuò)增/建庫和測序等均由廣東美格基因科技有限公司完成。真菌ITS2 區(qū)PCR 擴(kuò)增引物為ITS2-F（5′-GCATCGATGAAGAACGCAGC-3′）、ITS4-R（5′-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3′）。細(xì)菌16S rRNA V4～V5 區(qū)PCR 擴(kuò) 增 引 物 為515 F（5′-GTGCCAGCMGCCG CGGTAA-3′）、907F（5′-CCGTCAATTCMTTTRAGTTT-3′）。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同消毒處理對辣椒病害防效的影響

于10 月15 日進(jìn)行第1 次病害調(diào)查，發(fā)現(xiàn)有輕微辣椒疫病；于10 月29 日進(jìn)行第2 次病害調(diào)查，CK 處理的辣椒疫病發(fā)病嚴(yán)重，可能由于氣溫不高，各處理均只有辣椒疫病發(fā)生，未觀察到辣椒青枯病、白絹病和根結(jié)線蟲病株。由表1 可知，辣椒疫病病情指數(shù)以CK 處理最高且顯著高于其他處理，其次是T4 處理，其病情指數(shù)顯著高于T1、T2 處理；各消毒處理可顯著降低辣椒疫病的發(fā)生，防治效果由高到低依次為T2 ＞T1 ＞T3 ＞T4，防治效果分別為84.68%、82.89%、78.19%和67.68%。

表1 各消毒處理的辣椒疫霉病發(fā)病情況比較

2.2 不同消毒處理對辣椒農(nóng)藝性狀的影響

從表2 可知，各消毒處理的株高和莖粗均無明顯差異，但產(chǎn)量差異較大，4 個(gè)消毒處理的辣椒產(chǎn)量均超過了1 200 kg/667m2，以T1 處理的產(chǎn)量最高，達(dá)1 364 kg/667m2，而CK 處理因辣椒疫病發(fā)生嚴(yán)重，產(chǎn)量僅為890 kg/667m2。由此可見，土壤消毒處理可顯著降低辣椒疫病的發(fā)生，從而明顯緩解因病害嚴(yán)重發(fā)生而導(dǎo)致的減產(chǎn)。

表2 不同消毒處理對辣椒農(nóng)藝性狀的影響

2.3 不同消毒處理對連作土壤酶活性的影響

土壤脲酶、 -葡萄糖苷酶、酸性磷酸酶和蔗糖酶是衡量土壤物質(zhì)轉(zhuǎn)化能力的重要酶。從表3 可知，各處理的 -葡萄糖苷酶、蔗糖酶和脲酶活性無顯著差異，酸性磷酸酶活性差異顯著，以CK 處理的最高，且顯著高于T1 和T2 處理，但與T3 和T4 處理差異不顯著。這說明不同消毒處理對土壤酶活的影響不一致，各消毒處理對 -葡萄糖酶、蔗糖酶和脲酶活性的影響不明顯，但棉隆和威百畝處理（T1 和T2）可顯著降低土壤中酸性磷酸酶的活性。

表3 不同消毒處理對土壤酶活性的影響 (U/g)

2.4 威百畝消毒處理對連作土壤微生物多樣性的影響

前期病害調(diào)查結(jié)果表明，威百畝消毒處理后的辣椒疫霉發(fā)病率及病情指數(shù)最低，相對防效最高。因此選取該處理與對照的土壤進(jìn)行高通量測序，以比較兩者之間細(xì)菌多樣性的異同。經(jīng)序列拼接并過濾低質(zhì)量數(shù)據(jù)，高通量測序總共獲得851 253 條有效的細(xì)菌reads。由圖1 所示，隨著測序數(shù)據(jù)量的增加，新OTU（新物種）出現(xiàn)的速率趨緩，說明測序量接近飽和。

圖1 各組樣品稀釋度曲線

由表4 可知，威百畝處理土壤樣品的reads 數(shù)在43 101～64 618 條之間，OTUs 數(shù)為925～2 734 個(gè)。SS1 和SS2 這2 組威百畝處理的土壤樣品reads 數(shù)均大于CK 處理土壤樣品，且威百畝消毒處理后土壤樣品的OTUs 數(shù)均少于2 組CK 樣品，說明威百畝處理降低了土壤細(xì)菌種群結(jié)構(gòu)的多樣性，但由于大量土壤微生物被殺滅，土壤微生物之間的互作網(wǎng)絡(luò)被破壞，造成大量生態(tài)位點(diǎn)被存活的細(xì)菌所占據(jù)并大量繁殖，從而導(dǎo)致其豐度大幅增加（reads 數(shù)增加）。

表4 各處理土壤樣品的OTUs 和reads 數(shù)

由圖2 可知，威百畝消毒處理可降低土壤中細(xì)菌的多樣性，從而導(dǎo)致物種豐富度下降（圖2 左），且消毒處理和CK 處理之間的差異達(dá)極顯著水平（圖2 右）。

圖2 細(xì)菌Alpha 多樣性指數(shù)（左）及指數(shù)間差異檢驗(yàn)結(jié)果（右）

對威百畝消毒處理后的細(xì)菌Beta 多樣性進(jìn)行比較分析的結(jié)果發(fā)現(xiàn)，結(jié)果如圖3 所示，威百畝消毒處理土壤樣品之間的物種組成相似，它們在PCA 圖中聚集在一起，CK 處理各土壤樣品間的物種組成相似度也很高（圖3 左）；PCoA 分析也觀察到了類似的現(xiàn)象，威百畝土壤消毒處理與CK 處理的細(xì)菌群落相似性在組內(nèi)相似性高，但組間相似性低（圖3右）。由此表明，威百畝處理重塑了土壤細(xì)菌種群結(jié)構(gòu)及其多樣性。

圖3 細(xì)菌Beta 多樣性PCA（左）及PCoA 分析（右）結(jié)果

選取威百畝消毒處理土壤中在各分類水平上平均豐度排名前15 的物種進(jìn)行三元相圖分析，結(jié)果見圖4，威百畝消毒處理土壤中的優(yōu)勢細(xì)菌種群分別是硬壁菌門（Firmicutes）的芽孢桿菌目（Bacillales）（OTU910、OTU92、OTU7、OTU5、OTU4）、放 線菌門（Actinobacteria）的鏈霉菌屬（Streptomyces）（OTU3）、變形菌門（Proteobacteria）的不動(dòng)桿菌屬（Acinetobacter）（OTU2）和酸桿菌門（Acidobacteria）的嗜酸桿菌綱（acidobacteriia）（OTU1）等。其中芽孢桿菌目和鏈霉菌屬都可分泌種類豐富的抑菌活性物質(zhì)及促生長物質(zhì)，是公認(rèn)的有益微生物；而CK 土壤中優(yōu)勢細(xì)菌種群主要是綠彎菌門（Chloroflexi）的纖線桿菌目（Ktedonobacterales）（OTU19）、擬桿菌綱（Bacteroidia）的Uncultured（OTU28）和奇古菌門（Thaumarchaeota） 的亞硝基菌綱（Nitrososphaeria）（OTU8）等。上述分析結(jié)果表明，芽孢桿菌和鏈霉菌等類群是消毒后土壤中的優(yōu)勢與核心細(xì)菌種群，原因可能是土壤中的芽孢桿菌和鏈霉菌可分別產(chǎn)生芽孢和孢子等休眠體，其對土壤消毒劑的耐受能力強(qiáng)，不易被殺滅。

圖4 土壤消毒處理與CK 土壤中核心細(xì)菌物種的三元相圖分析

Beta 多樣性的聚類分析結(jié)果（圖5）表明，以鏈霉菌屬（OTU3）和芽孢桿菌屬（OTU4、OTU5、OTU7）為代表的有益微生物的種群豐度在消毒處理前極低，但消毒處理后其相對豐度大幅提高，在SS1 組4 個(gè)樣品中，鏈霉菌屬的相對豐度比CK1組增加了43.18 倍，芽孢桿菌屬的相對豐度增加了22.63 倍；在SS2 組4 個(gè)樣品中，鏈霉菌屬的相對豐度比CK2 組增加了1.23 倍，芽孢桿菌屬的相對豐度增加了5.92 倍；也有大量微生物在威百畝消毒處理后相對豐度大幅下降，如酸桿菌門（OTU1）、Unassigned 和uncultured 等細(xì)菌類群的豐度分別比CK 下降了215.1%、16.2%和71.31%。

圖5 2 組樣品中細(xì)菌OTUS 的Beta 多樣性聚類分析

選擇各處理中豐度排名靠前的30 個(gè)OTUs 進(jìn)行物種豐度聚類分析，結(jié)果見圖6，相同處理的不同樣品間細(xì)菌群落組成相似度高，但處理間的相似度低，尤其是威百畝消毒處理和CK 之間差異顯著，這與三元相圖和聚類分析的結(jié)果一致。

圖6 不同消毒處理連作土壤的物種豐度分析

土壤細(xì)菌種群結(jié)構(gòu)在4 組處理間存在較大差異，他們共有的OTU 數(shù)有1 081 個(gè)；CK1、CK2、SS1和SS2 獨(dú)有的OTU 數(shù)分別有1 044、2 168、224 和380 個(gè)；另外，每2 組樣品或3 組樣品間還有數(shù)量不等的共有OTU（見圖7）。以上分析結(jié)果同樣說明了威百畝處理（T2）重塑了土壤細(xì)菌的種群結(jié)構(gòu)。

圖7 不同消毒處理連作土壤的細(xì)菌種群結(jié)構(gòu)venn 圖

土壤細(xì)菌種群結(jié)構(gòu)和豐度的巨大差異必然導(dǎo)致微生物種群的功能屬性發(fā)生相應(yīng)的變化。基于16S rRNA 高通量測序的COG 功能預(yù)測分析結(jié)果（圖8）表明，威百畝消毒處理和CK 的細(xì)菌群落分布特征差異明顯，處理間樣品高度聚集，而不同處理的離散度高；組間通路差異分析結(jié)果（圖9）表明，威百畝消毒處理在新陳代謝（metabolism）和poorly characterized 這2 大類通路上明顯優(yōu)于CK，但在細(xì)胞過程和信號傳導(dǎo)（cellular processes and signaling）通路上弱于CK，2 組處理在信息處理和存儲（information storage and processing）通路上基本相當(dāng)。

圖8 基于16S rRNA 功能預(yù)測的PCA 分析

圖9 基于16S rRNA 功能預(yù)測的組間通路差異分析

3 討 論

近年來，設(shè)施蔬菜生產(chǎn)過程中根莖病害發(fā)生嚴(yán)重、土壤質(zhì)量惡化和土壤鹽漬化等連作障礙問題越來越嚴(yán)重，制約了蔬菜產(chǎn)業(yè)的進(jìn)一步發(fā)展壯大[11-12]。雖然造成連作障礙的原因比較復(fù)雜，但在生產(chǎn)中最常用且有效的方法是進(jìn)行土壤消毒。目前，土壤消毒方法主要有物理消毒（火焰、蒸汽、日光、高溫、低溫等）、化學(xué)消毒（使用各類熏蒸劑）和生物滅菌（強(qiáng)還原）[13-18]。通過土壤消毒可以減少土壤中的病原菌、害蟲，從而顯著提高設(shè)施蔬菜的產(chǎn)量和品質(zhì)。筆者的試驗(yàn)結(jié)果表明，各消毒處理均可顯著降低辣椒疫病的發(fā)生，防治效果由高到低依次為T2（威百畝處理）＞T1（棉隆處理）＞T3（氰氨化鈣處理）＞T4（RSD 處理），防治效果分別為84.68%、82.89%、78.19%和67.68%；各消毒處理的株高和莖粗均無明顯差異，但4 個(gè)消毒處理的辣椒產(chǎn)量均超過1 200 kg/667m2，以T1 的產(chǎn)量最高，達(dá)1 364 kg/667m2，而CK 因辣椒疫病發(fā)生嚴(yán)重，產(chǎn)量僅為890 kg/667m2；各消毒處理對 -葡萄糖酶、蔗糖酶和脲酶活性的影響不明顯，但棉隆和威百畝處理（T1和T2）可顯著降低酸性磷酸酶的活性；威百畝處理（T2）可重塑土壤微生物的種群結(jié)構(gòu)，尤其是鏈霉菌屬和芽孢桿菌屬等有益微生物種群的豐度明顯提高，有利于維持健康的土壤微生態(tài)環(huán)境。