李 棟，葉光斌，2*，宗緒巖，2，鄒 偉，2

（1.四川輕化工大學(xué)生物工程學(xué)院，四川宜賓 644000；2.四川輕化工大學(xué)釀酒生物技術(shù)及應(yīng)用四川省重點實驗室，四川宜賓 644000）

我國的白酒文化可追溯到四五千年前的“龍山文化”時期，可謂歷史悠久[1]。濃香型白酒作為我國的第一大蒸餾酒，其酒體具有綿甜醇厚、窖香濃郁、舒適協(xié)調(diào)等特點，深受人們喜愛，且市場份額占比大[2]。窖泥作為濃香型白酒生產(chǎn)過程中主要微生物來源之一，其質(zhì)量對白酒品質(zhì)改善及特質(zhì)香氣的形成具有重要的影響。泥窖池作為濃香型白酒特有的發(fā)酵容器，也是優(yōu)良釀酒微生物棲息繁衍地，經(jīng)過長期高酸度和密閉厭氧發(fā)酵等特殊釀酒環(huán)境的馴化，窖泥中逐漸富集了大量具有產(chǎn)香功能的微生物[3]。

在成熟的純培養(yǎng)技術(shù)下，窖泥中的產(chǎn)香功能微生物也逐漸被發(fā)掘出來。己酸乙酯是濃香型白酒的主要風(fēng)味物質(zhì)[4]，己酸作為己酸乙酯合成的前體物質(zhì)，其產(chǎn)生菌種類較多。主要有梭菌屬中的克氏梭菌（Clostridium kluyveri）、廣西梭菌（Clostridium guangxiense）[5-10]；芽孢桿菌屬中的地衣芽孢桿菌（Bacillus licheniformis）、巨大芽孢桿菌（Bacillus megaterium）[11]；顫桿菌科的Caproicibacterium菌屬[12]；產(chǎn)己酸菌屬（Caproiciproducens）[13]；瘤胃球菌科CPB6 菌株[14]等。有研究表明，多數(shù)梭菌可通過逆β 氧化途徑，以乙醇或乳酸為基礎(chǔ)，通過乙酰輔酶A，最終縮合成己酸，而其他菌屬產(chǎn)己酸的代謝途徑卻鮮有報道[15-16]。

除己酸外，丁酸、乙酸等酸也對白酒的風(fēng)味影響頗深。對酪酸梭菌（Clostridium butyricum）[17-18]、毛螺旋菌科（Lachnospiraceae）JN500902T 菌株[19]的研究發(fā)現(xiàn)，其可產(chǎn)生多種脂肪酸，如丁酸、乙酸等；在白酒釀造中，丁酸被轉(zhuǎn)化為丁酸乙酯，乙酸被轉(zhuǎn)化為乙酸乙酯，兩者皆是白酒中重要的香味成分。也有研究發(fā)現(xiàn)丁酸可作為合成己酸的前體物質(zhì)，同時對于新窖泥生成正丁醇起到至關(guān)重要的作用[20-21]。甲烷菌可實現(xiàn)“種間氫轉(zhuǎn)移關(guān)系”，與己酸菌能夠形成共棲作用，從而更加有利于己酸的生成[22]。

在窖泥環(huán)境體系中，微生物十分豐富，種間關(guān)系復(fù)雜，代謝產(chǎn)物多樣。加之實驗室條件下可培養(yǎng)的微生物種類有限，因此通過分離培養(yǎng)的方式必然會忽略窖泥中絕大部分具有產(chǎn)酸功能的微生物類型[23]。富集培養(yǎng)是目前有效分離環(huán)境樣品中難培養(yǎng)微生物的有效方法，例如Wu 等[24]從富集培養(yǎng)物中分離到了許多針對環(huán)境污染物的降解菌；Pernicova 等[25]將活性污泥加入到富集培養(yǎng)基（MSM）中培養(yǎng)，分離出了能產(chǎn)聚羥基鏈烷酸酯（PHA）的芽孢桿菌。對于微生物的分離而言，培養(yǎng)基選擇與設(shè)計無疑具有重要的作用。窖泥在不同富集處理下發(fā)酵產(chǎn)物的變化規(guī)律研究對于功能發(fā)酵菌液的開發(fā)與難培養(yǎng)微生物的分離等都具有重要的意義。如在培養(yǎng)基富集微生物時，進(jìn)行熱激的前處理，就會使得大量非孢子形成的細(xì)菌減少，降低微生物的物種豐富度，從而使多數(shù)含有芽孢的梭菌、芽孢桿菌等得以生存[26]；在培養(yǎng)基組分上加入乙醇作為碳源，富集窖泥后發(fā)現(xiàn)代謝產(chǎn)物乙酸的含量會高于己酸的含量，而以葡萄糖作為碳源時，己酸含量則高于乙酸含量[16]。盡管現(xiàn)在富集培養(yǎng)應(yīng)用領(lǐng)域十分廣泛，也幫助學(xué)者分離或富集了眾多的新種和目的功能菌，但是在白酒上的研究還是較少，限制我們對中國濃香型白酒發(fā)酵過程中窖泥微生物驅(qū)動原理的了解，所以窖泥中功能微生物的開發(fā)、難培養(yǎng)微生物的富集等工作仍是我們現(xiàn)在首要的目標(biāo)。

本研究設(shè)計不同的培養(yǎng)基營養(yǎng)成分和是否使用熱激處理等不同的處理組合（具體處理見表1），通過比較不同處理下6 輪次發(fā)酵產(chǎn)物確定最佳發(fā)酵處理措施。相關(guān)研究結(jié)果可以為窖泥功能菌液功能導(dǎo)向性富集、富集產(chǎn)酸培養(yǎng)條件優(yōu)化、窖泥老熟、難培養(yǎng)微生物的分離等提供理論支撐。

表1 培養(yǎng)基成分表

1 材料與方法

1.1 材料、試劑及儀器

1.1.1 窖泥樣本

優(yōu)質(zhì)老窖泥取自瀘州某名優(yōu)酒廠，用冰盒迅速運回實驗室，于4 ℃冰箱保存，用其配置成富集液樣品1—20號。

1.1.2 主要儀器與設(shè)備

氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀，美國Agilent 科技有限公司；厭氧工作站，北京八方世紀(jì)科技有限公司。

1.1.3 培養(yǎng)基

窖泥用不同培養(yǎng)基進(jìn)行富集培養(yǎng)，培養(yǎng)基組分見表1。

1.2 試驗方法

1.2.1 窖泥的富集

取25 g 窖泥于厭氧工作站中接種至250 mL 已除氧液體培養(yǎng)基（1.1.3）中，所有樣品于35 ℃培養(yǎng)7 d 后，以10 %的接種量進(jìn)行轉(zhuǎn)接，共富集6 輪（詳見圖1）。將每輪富集液分別保存至4 ℃及-20 ℃冰箱中，用于后續(xù)代謝產(chǎn)物研究。

圖1 窖泥富集培養(yǎng)接種方法

1.2.2 窖泥富集液代謝產(chǎn)物

取發(fā)酵液20 mL，使用2 mol/L 硫酸酸化至pH2，加無水乙醇定容至25 mL，12000 r/min、4 ℃冷凍離心5 min，取上清液，過0.2 μm 微孔濾膜[30]。進(jìn)樣前加10 μL乙酸丁酯（84 mg/mL）作為內(nèi)標(biāo)混勻。

氣相色譜條件：DB-WAX（60 m×250 μm×0.25 μm）色譜柱；載氣為高純度He，流速1 mL/min，進(jìn)樣口溫度230 ℃；程序升溫：初始溫度為60 ℃保持1 min，8 ℃/min 的升溫速率升至180 ℃保持2 min，再以15 ℃/min升至230 ℃，保持5 min。

質(zhì)譜（MS）條件：電子離子源（EI），70 eV 電子能量，采集模式為全掃描，質(zhì)量范圍20～550 u，離子源溫度230 ℃，四級桿溫度150 ℃，接口溫度230 ℃。

定性分析：質(zhì)譜圖通過與美國Agilent 公司提供的美國國家標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)研究所（national institute of standards and technology，NIST）標(biāo)準(zhǔn)譜庫05a.L 進(jìn)行比對，選擇匹配度均＞80的進(jìn)行定性分析[31]。

半定量分析：以乙酸丁酯作為內(nèi)標(biāo)，測定樣品中酸類、酯類、醇類及芳香類化合物的峰面積與乙酸丁酯峰面積之比，再根據(jù)乙酸丁酯的質(zhì)量濃度進(jìn)一步計算其含量[32]。

2 結(jié)果與分析

2.1 窖泥富集液代謝產(chǎn)物

窖泥富集液在不同培養(yǎng)基條件下經(jīng)過六次富集后，其代謝產(chǎn)物數(shù)據(jù)顯示（圖2），總酸、乙酸、丁酸和己酸產(chǎn)量范圍分別為61.8～11392 mg/100 mL、0～3491 mg/100 mL、0～9695 mg/100 mL、0～1744 mg/100 mL，對于能起到富集酸作用的培養(yǎng)基而言，總酸富集趨勢為第一輪富集到第三輪富集呈快速上升，第三輪富集到第四輪富集呈緩慢上升，而在第四輪富集到第六輪富集時則呈現(xiàn)下降，可以看出濃香型白酒的主要揮發(fā)性酸積累是在第三輪、第四輪富集時得到最大積累量（最高能到11392 mg/100 mL）。因此我們可以將整個發(fā)酵過程分為三個階段，第一階段為微生物生長繁殖時期（第一輪、第二輪富集時期），第二階段為微生物代謝時期（第三輪、第四輪富集時期），第三階段為微生物衰退消亡時期（第五輪、第六輪富集時期）。

圖2 樣品富集總酸圖

2.2 熱激與未熱激對同組分培養(yǎng)基間的影響

第三輪、第四輪富集時期，為微生物代謝時期，且在該時期有大量的酸積累。所以，將同培養(yǎng)基條件下，第三輪、第四輪富集時期的總酸積累作為分析基礎(chǔ)，對其熱激與未熱激處理下的樣本做顯著性分析，如圖3 所示，相同培養(yǎng)基組分在不同處理結(jié)果下，熱激與未熱激對酸的富集不呈顯著性差異，所以認(rèn)為熱激與未熱激的前處理對微生物發(fā)酵中期產(chǎn)酸的影響很小。

圖3 同培養(yǎng)基組分下，熱激與未熱激處理下微生物的富集與第三輪、第四輪發(fā)酵時期總酸積累的顯著性關(guān)系

2.3 培養(yǎng)基成分對窖泥富集液代謝產(chǎn)酸的影響

雖然在主發(fā)酵時期，是否熱激處理對同組分富集樣本影響較小，但是培養(yǎng)基自身的成分組成對代謝產(chǎn)物的影響極其重要。對此，針對主發(fā)酵時期的各個酸代謝量同20 組不同處理的富集樣本的營養(yǎng)物質(zhì)進(jìn)行相關(guān)性冗余分析（RDA 分析），如圖4 所示，RDA 分析顯示，培養(yǎng)基中的營養(yǎng)物質(zhì)（硫酸銨、蛋白胨、酵母粉、乙酸鈉、丁酸鈉、可溶性淀粉）與總酸、乙酸、丁酸、己酸呈正相關(guān)關(guān)系，乳酸、黃水、乙醇、葡萄糖、巰基乙酸鈉、牛肉膏則與上述酸呈負(fù)相關(guān)關(guān)系。

圖4 不同處理下，富集培養(yǎng)在第三輪、第四輪富集時培養(yǎng)基的主要組分和總酸、乙酸、丁酸、己酸的冗余分析（RDA分析）

3號、4號、5號、6號、7號、8號、13號、14號處理與總酸、乙酸、丁酸、己酸呈正相關(guān)關(guān)系，這些酸也與上述處理中的營養(yǎng)物質(zhì)（3 號、4 號、5 號、6 號、13號、14 號處理共同的營養(yǎng)組分：乙酸鈉、硫酸銨、蛋白胨、酵母粉）呈正相關(guān)，唯獨與7 號、8 號處理中的黃水呈負(fù)相關(guān)，但這些處理都在富集過程中積累了較好的混合酸（總酸、乙酸、丁酸、己酸）。相關(guān)研究發(fā)現(xiàn)，在葡萄糖CGM 培養(yǎng)基（本實驗5 號處理使用的培養(yǎng)基）中加入丁酸鈉和乙酸鈉后，能有效提高丁酸、乙酸的產(chǎn)量，進(jìn)而影響己酸的積累（從654 mg/100 mL 提高至892 mg/100 mL）[16]，而3號、4 號、5 號、6 號處理中的丁酸鈉和乙酸鈉與混合酸呈正相關(guān)關(guān)系，表明丁酸鈉和乙酸鈉對混合酸的積累有著促進(jìn)作用（圖2，圖4）。其表現(xiàn)為，3號、4 號處理在第四輪富集時，積累了較多的總酸和丁酸（9705.2～11392 mg/100 mL 和8435～9695 mg/100 mL），5 號、6 號處理（獨特的營養(yǎng)組分：丁酸鈉）在第三輪富集時對總酸、乙酸和丁酸有一定積累（4618～5083 mg/100 mL，2061～2259 mg/100 mL，2351～2687 mg/100 mL）。黃水作為濃香型白酒發(fā)酵過程中的產(chǎn)物[33]，推測其含有較豐富的促生長因子，所以在加入了黃水的7號、8 號處理中表現(xiàn)出較高的乙酸、丁酸積累。其中7 號處理在第二輪富集時積累了較多總酸、乙酸和己酸（7892 mg/100 mL、3067 mg/100 mL 和1587 mg/100 mL），8 號處理則在第三輪富集時主要對總酸、丁酸有所積累（5159 mg/100 mL，3817 mg/100 mL）。己酸乙酯是濃香型白酒中的主體呈香物質(zhì)，過多的乳酸會抑制濃香白酒主體香的形成，所以現(xiàn)在的研究推行通過“增己降乳”的方法來提高己酸乙酯的含量[34]，1 號、2 號、11 號、12 號處理中富含乳酸，并且與總酸、乙酸、丁酸、己酸呈負(fù)相關(guān)關(guān)系，因此推測過高的酸度對微生物代謝形成了反饋抑制，導(dǎo)致了產(chǎn)酸量的減少。Clostridium kluyveri可以利用乙醇來產(chǎn)己酸，但在窖泥菌群研究中，該菌的相對豐度不高[35]，本實驗中的9 號、15號、16 號、17 號、18 號處理均加有乙醇，且與總酸、乙酸、丁酸、己酸呈負(fù)相關(guān)關(guān)系，同時產(chǎn)酸（如己酸）較低（平均酸含量＜1336.4 mg/100 mL），所以推測乙醇能抑制混菌的生長或能抑制以乙醇為碳源生長的細(xì)菌（如Clostridium kluyveri）。有研究表明，巰基乙酸鈉作為抑制劑，可以抑制微生物芽孢的形成[36]，所以認(rèn)為15 號、16 號處理中加入的巰基乙酸鈉，也會使微生物的含量降低，從而使得產(chǎn)酸很低。10號處理中加入乙醇后，依然在第二輪富集中表現(xiàn)出較高的丁酸含量（4465 mg/100 mL），可能因為該培養(yǎng)基在滅菌后加入乙醇，然后又進(jìn)行了熱激處理，使得乙醇揮發(fā)（沸點：78 ℃），不用抑制該培養(yǎng)基的微生物生長。19 號、20 號處理對揮發(fā)性酸積累很低（平均酸含量＜1336.4 mg/100 mL），可能因為該培養(yǎng)基（MRS 培養(yǎng)基）主要是用來培養(yǎng)乳酸桿菌的，所以使得其它產(chǎn)酸微生物難以生存。13號、14 號處理（獨特的營養(yǎng)組分：可溶性淀粉、葡萄糖）能在第三輪、第四輪富集時積累總酸、乙酸、丁酸、己酸（5843～7444.7 mg/100 mL，2254～3055 mg/100 mL，2452～3383 mg/100 mL，652～1067 mg/100 mL），而且混合酸的含量在富集過程中有先增加后下降的趨勢，說明富集中期時，有利于這些處理對混合酸的積累。

2.4 熱激與否對優(yōu)勢富集樣本的各揮發(fā)性酸的影響

經(jīng)過多組處理間的總酸比較，篩選出了13 號、14號處理作為最優(yōu)的富集培養(yǎng)基組合，為進(jìn)一步探究熱激對其各揮發(fā)性酸的影響，我們對其微生物代謝時期的各酸代謝量進(jìn)行了差異分析，如圖5 所示。對比之下，13號、14號處理，在微生物代謝時期（第三輪、第四輪富集）產(chǎn)混合酸差異很小，兩輪富集乙酸、丁酸、己酸差距分別在225～801 mg/100 mL、116～155 mg/100 mL、141～301 mg/100 mL 之間，并無顯著性差異，且產(chǎn)混合酸能力很高。由于13號、14 號處理在多輪次富集中產(chǎn)酸高且穩(wěn)定，受熱激處理影響小，所以我們認(rèn)為其可作為窖泥產(chǎn)酸核心菌群研究的出發(fā)樣本。

圖5 13號、14號處理第三輪、第四輪富集時，富集輪次與酸之間的顯著性關(guān)系

3 結(jié)論

本實驗通過不同培養(yǎng)條件對窖泥進(jìn)行連續(xù)富集培養(yǎng)，篩選出了能夠高產(chǎn)酸的13 號、14 號處理。在發(fā)酵第三輪、第四輪時，13 號處理和14 號處理間無顯著性差異，且都能夠有效的富集混合酸（乙酸、丁酸、己酸）。在最佳產(chǎn)酸時期，總酸的產(chǎn)值在5000～7500 mg/100 mL之間，乙酸在2254～3055 mg/100 mL之間，丁酸在2452～3383 mg/100 mL之間，己酸在909～1744 mg/100 mL 之間。該項研究成果，后續(xù)可作為窖泥產(chǎn)酸核心菌群的研究對象，也可以開展純菌的分離研究。同時本課題相關(guān)研究可以為后續(xù)單菌分離、改善窖泥質(zhì)量、生物強化法生產(chǎn)濃香型白酒等提供理論依據(jù)及實踐基礎(chǔ)。